趙奕威,冉 軒,朱佳真,李 佳,王淑慧,李宗芳,2,江 維,2*

(1 西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院生物診斷治療國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心,西安 710004;2 西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院腫瘤病院;*通訊作者,E-mail:jiangweixjtu@163.com)

脾臟是最大的外周免疫器官,占全身淋巴細(xì)胞總量的25%,除了胚胎時(shí)期的造血功能、濾血功能、儲(chǔ)血等功能外,還是重要的抗感染免疫和抗腫瘤免疫器官[1]。臨床研究發(fā)現(xiàn),因脾臟外傷而切除脾臟增加多種免疫相關(guān)疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn),比如感染、腫瘤、2型糖尿病、肝膿腫等[2-5]。脾臟和肝臟的聯(lián)系緊密,脾臟和肝臟不但通過(guò)門(mén)靜脈直接聯(lián)系,脾臟與肝臟之間還存在免疫對(duì)話。前期研究提示在肝病的發(fā)生發(fā)展中,脾臟作為直接與肝臟聯(lián)系的免疫器官,直接參與肝病的發(fā)生發(fā)展[6]。但脾臟切除后肝臟及外周血的免疫狀態(tài)發(fā)生的變化尚不清楚。因此,本研究旨在研究脾切除后小鼠肝臟和外周血免疫細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

大鼠抗小鼠FITC-labeled CD3、大鼠抗小鼠PE-labeled CD4、大鼠抗小鼠APC-labeled CD8a、大鼠抗小鼠PE-labeled CD19、大鼠抗小鼠APC-labeled F4/80、大鼠抗小鼠FITC-labeled Ly6G、大鼠抗小鼠PE-labeled Ly6C、大鼠抗小鼠CD16/32、大鼠抗小鼠PE-cy7-labeled CD11b、大鼠抗小鼠FITC-labeled CD11c、大鼠抗小鼠Brilliant Violet 421TM-labeled CD45抗體購(gòu)自美國(guó)Biolegend公司;大鼠抗小鼠PE-labeled MHCⅡ抗體購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6-8周齡雄性C57BL/6小鼠32只,體質(zhì)量(20±2)g,為SPF級(jí),購(gòu)買(mǎi)于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,生產(chǎn)許可證號(hào):SYXK(陜)2018-001,并飼養(yǎng)于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物房?jī)?nèi)。分為假手術(shù)組、脾切除1周組、脾切除2周組、脾切除4周組,每組8只;假手術(shù)組再分為3個(gè)亞組:假手術(shù)1周組(n=3)、假手術(shù)2周組(n=3)、假手術(shù)4周組(n=2)。其中假手術(shù)1周組和脾切除1周組于處死前1周行假手術(shù)或脾切除,假手術(shù)2周組和脾切除2周組于處死前2周行假手術(shù)或脾切除,假手術(shù)4周組和脾切除4周組于處死前4周行假手術(shù)或脾切除。所有小鼠在同一時(shí)間處死,取肝臟和外周血,并檢測(cè)肝臟質(zhì)量、計(jì)算肝臟指數(shù),制備肝臟和外周血單細(xì)胞懸液(方法如下述),用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肝臟和外周血免疫細(xì)胞的比例。實(shí)驗(yàn)經(jīng)西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3 脾切除及假手術(shù)

在紫外線滅菌后的環(huán)境下,腹腔注射4%的水合氯醛(0.1 ml/10 g體質(zhì)量)麻醉小鼠,備皮并用碘伏消毒3遍,取腹部正中切口長(zhǎng)約0.8 cm,暴露脾臟,輕輕翻出脾臟,分別用縫合線結(jié)扎脾臟上極和下極的血管,剪掉血管,脾臟即游離下來(lái)。觀察血管結(jié)扎處無(wú)出血后,逐層縫合腹腔,碘伏消毒皮層后將小鼠放置于溫暖的地方,保溫復(fù)蘇。假手術(shù)僅打開(kāi)腹腔,不做脾切除術(shù),直接縫合腹腔。

1.4 外周血及肝臟單細(xì)胞懸液制備

脾切除及假手術(shù)術(shù)后第1周、2周、4周處死小鼠后取其肝臟組織并稱(chēng)重,將獲取的組織在70 μm細(xì)胞篩網(wǎng)上研磨,用含2%胎牛血清的PBS沖洗研磨后的組織,制備細(xì)胞懸液。將肝臟細(xì)胞懸液經(jīng)70 μm尼龍篩網(wǎng)過(guò)濾,過(guò)濾后獲取的細(xì)胞懸液在4 ℃、50g離心8 min,棄沉淀,取懸浮細(xì)胞,重復(fù)1次。懸浮細(xì)胞在4 ℃、450g離心8 min,棄上清,并重復(fù)1次,取沉淀細(xì)胞備用。眼球取血法采血于EDTA抗凝管中備用。將上述所取肝臟細(xì)胞懸液、血液1 ml并加入5 ml紅細(xì)胞裂解液充分混勻,冰上孵育5 min,用含2%胎牛血清的PBS中止,4 ℃、350g離心5 min后取沉淀細(xì)胞并用1 ml PBS重懸,4 ℃、350g離心5 min;取其沉淀并用1 ml PBS重懸,計(jì)數(shù),調(diào)細(xì)胞濃度為1×107-2×107個(gè)/ml,放置于冰上,備用。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肝臟和外周血免疫細(xì)胞的比例

每管吸取100 μl細(xì)胞懸液加入流式管中,用抗大鼠抗小鼠CD16/32抗體4 ℃孵育15 min,加入相應(yīng)的抗體,4 ℃避光孵育30 min,后加入含1%胎牛血清的PBS 2 ml,4 ℃下350g離心5 min,棄去上清液;重復(fù)1次,最后加入0.5 ml PBS重懸,用FACS Canto Ⅱ flow cytometer(BD,美國(guó))檢測(cè)結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 肝臟質(zhì)量的變化

造模期間,由于手術(shù)原因假手術(shù)組死亡1只小鼠、脾切除2周組死亡3只小鼠、脾切除4周組死亡1只小鼠。與假手術(shù)組小鼠相比,脾切除1周、2周、4周組肝臟質(zhì)量與肝指數(shù)均無(wú)顯著差異(P>0.05,見(jiàn)圖1)。

圖1 脾切除組與假手術(shù)組肝質(zhì)量與肝指數(shù)比較Figure 1 Comparison of liver weight and liver index between splenectomy groups and sham operation group

2.2 肝臟免疫細(xì)胞的變化

與假手術(shù)組相比,脾切除4周組小鼠肝臟CD3+CD8+T細(xì)胞顯著升高(13.97%±2.97%vs22.30%±3.14%,t= -5.092,P<0.01,見(jiàn)圖2);脾切除1周、2周、4周組肝臟CD3+CD4+/CD3+CD8+均顯著降低(t=2.785,2.45,-3.549,均P<0.05,見(jiàn)圖2);而脾切除1周、2周、4周組肝臟CD3-CD19+B細(xì)胞、CD3+CD4+T細(xì)胞無(wú)顯著差異(P>0.05,見(jiàn)圖2)。

與假手術(shù)組相比較,* P <0.05,* * P <0.01圖2 脾切除組與假手術(shù)組肝臟CD3 +CD8 +T細(xì)胞、CD3 +CD4 +/CD3 +CD8 +、CD3 -CD19 +B細(xì)胞以及CD3 + CD4 +T細(xì)胞的比較Figure 2 Comparison of CD3 +CD8 +T lymphocytes, the ratio of CD3 +CD4 +/CD3 +CD8 +, CD3 -CD19 +B lymphocytes, and CD3 +CD4 +T lymphocytes in liver between splenectomy groups and sham operation group

與假手術(shù)組相比,脾切除1周組肝臟CD11b+Ly6G+粒細(xì)胞顯著升高(P<0.05,見(jiàn)圖3),而脾切除1周、2周、4周組肝臟CD11b+Ly6Chi單核細(xì)胞、CD11b+Ly6Cmed單核細(xì)胞、CD11c+MHCⅡ+DC細(xì)胞、CD11bintF4/80hi枯否細(xì)胞、CD11bhiF4/80int巨噬細(xì)胞、CD11bhiF4/80intLy6Chi巨噬細(xì)胞、CD11bhiF4/80intLy6Clow巨噬細(xì)胞均無(wú)顯著差異(P>0.05,見(jiàn)圖3)。

2.3 外周血免疫細(xì)胞的變化

與假手術(shù)組小鼠相比,脾切除1周、2周、4周組外周血CD3-CD19+B細(xì)胞、CD3+CD4+T細(xì)胞、CD3+CD8+T細(xì)胞、CD3+CD4+/CD3+CD8+均無(wú)顯著差異(P>0.05,見(jiàn)圖4)。

與假手術(shù)組相比較,* P <0.05圖3 脾切除組與假手術(shù)組肝臟CD11b +Ly6G +粒細(xì)胞、CD11b +Ly6Chi單核細(xì)胞、CD11b +Ly6Cmed單核細(xì)胞、CD11c +MHCⅡ +DC細(xì)胞、CD11bintF4/80hi枯否細(xì)胞、CD11bhiF4/80int巨噬細(xì)胞、CD11bhiF4/80intLy6Chi巨噬細(xì)胞以及CD11bhiF4/80intLy6Clow巨噬細(xì)胞的比較Figure 3 Comparison ofCD11b +Ly6G +granulocytes,CD11b +Ly6Chimonocytes,CD11b +Ly6Cmed monocytes,CD11c +MHCⅡ +dendritic cells, CD11bintF4/80hikupffer cells, CD11bhiF4/80intmacrophages, CD11bhiF4/80intLy6Chimacrophages and CD11bhiF4/80inttLy6Clow macrophages in liver between splenectomy group and sham operation group

圖4 脾切除組與假手術(shù)組外周血CD3 -CD19 +B細(xì)胞、CD3 +CD4 +T細(xì)胞、CD3 +CD8 +T細(xì)胞以及CD3 +CD4 +/CD3 +CD8 +的比較Figure 4 Comparison of CD3 -CD19 +B lymphocytes, CD3 +CD4 +T lymphocytes, CD3 +CD8 +T lymphocytes, and ratio of CD3 +CD4 +/CD3 +CD8 +in peripheral blood between splenectomy group and sham operation group

與假手術(shù)組比較，脾切除1周組外周血CD11b+Ly6G+粒細(xì)胞、CD11b+Ly6Chi單核細(xì)胞顯著升高(P<0.05,見(jiàn)圖5),而脾切除1周、2周、4周組外周血CD11b+Ly6Cmed單核細(xì)胞、CD11c+MHCⅡ+DC細(xì)胞無(wú)顯著差異(P>0.05,見(jiàn)圖5)。

與假手術(shù)組相比較,* P <0.05圖5 脾切除組與假手術(shù)組外周血CD11b +Ly6G +粒細(xì)胞、CD11b +Ly6Chi單核細(xì)胞、CD11b +Ly6Cmed單核細(xì)胞以及CD11c +MHCⅡ +DC細(xì)胞的比較Figure 5 Comparison of CD11b +Ly6G +granulocytes, CD11b +Ly6Chimonocytes, CD11b +Ly6Cmed monocytes, and CD11c +MHCⅡ +dendritic cells in peripheral blood between splenectomy group and sham operation group

3 討論

在病理狀態(tài)下,脾切除直接影響外周血和肝臟組織的免疫細(xì)胞分布。文獻(xiàn)報(bào)道切除晚期荷瘤小鼠的脾臟能夠減少外周血和腫瘤組織髓源抑制性細(xì)胞(MDSC)的比例而升高CD8+T細(xì)胞的比例,延長(zhǎng)小鼠的生存期[7]。脾切除能阻斷慢性應(yīng)激引起的外周血CD4+T細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞比例的變化[8]。但上述研究均是在病理模型上進(jìn)行,臨床研究發(fā)現(xiàn)外傷脾切除增加多種免疫相關(guān)疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn),比如感染、腫瘤、2型糖尿病、肝膿腫等,但脾臟切除后肝臟及外周血的免疫狀態(tài)發(fā)生的變化尚不清楚[2-5]。因此,本文研究脾切除后小鼠肝臟和外周血免疫細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化具有重要意義。本研究結(jié)果顯示脾切除術(shù)后肝臟CD3+CD4+/CD3+CD8+持續(xù)降低,術(shù)后1周肝臟CD11b+Ly6G+粒細(xì)胞升高,而術(shù)后1周外周血CD11b+Ly6Chi單核細(xì)胞、CD11b+Ly6G+粒細(xì)胞升高，提示脾臟在維持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)中具有重要作用。

脾臟是機(jī)體最大的外周免疫器官,也是重要的髓外造血部位,參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展,比如肝炎肝硬化、腫瘤、心腦血管疾病等[9-11]。脾臟和肝臟不僅在解剖學(xué)上通過(guò)門(mén)靜脈直接聯(lián)系,在免疫學(xué)上,肝和脾相互作用、相互影響,共同在清除病原、維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)中扮演重要角色[6]。前期研究結(jié)果[12-15]也表明肝脾之間相互影響,存在免疫對(duì)話;比如肝癌發(fā)生后,脾臟質(zhì)量和脾指數(shù)明顯增大,脾臟紅髓增大、白髓減小,同時(shí)脾臟處于免疫抑制狀態(tài),脾臟中免疫抑制性細(xì)胞如MDSC、調(diào)節(jié)T細(xì)胞明顯增多,而免疫活性細(xì)胞如CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、NK細(xì)胞明顯降低,切除脾臟可降低肝癌組織中MDSC的比例。由此可看出,肝臟和脾臟之間存在著緊密的聯(lián)系。本研究結(jié)果顯示脾切除術(shù)后肝臟CD3+CD4+/CD3+CD8+持續(xù)降低,術(shù)后1周肝臟CD11b+Ly6G+粒細(xì)胞升高，提示脾臟在維持肝臟區(qū)域免疫穩(wěn)態(tài)中仍具有重要作用。其機(jī)制可能是脾切除后脾臟清除機(jī)體病原微生物的功能缺失，由門(mén)靜脈進(jìn)入肝臟的病原物增多造成肝臟免疫細(xì)胞比例失調(diào)，但其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

脾臟作為重要的免疫器官清除微生物,而脾切除能增加感染的風(fēng)險(xiǎn)[15]。文獻(xiàn)報(bào)道脾切除患者細(xì)菌性肝膿腫的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加,其原因可能是脾切除后機(jī)體免疫功能受損[4]。而脾臟具有濾血作用,脾臟過(guò)濾后的血液通過(guò)門(mén)靜脈進(jìn)入肝臟,然而脾切除后血液中的病原微生物直接進(jìn)入肝臟,其可能增加肝臟病原物生物的數(shù)量,因此肝臟的免疫狀態(tài)可能會(huì)發(fā)生改變,而CD3+CD8+T細(xì)胞是抵御病原微生物的重要細(xì)胞。該研究表明脾切除小鼠與假手術(shù)小鼠相比,肝臟質(zhì)量與肝指數(shù)雖然無(wú)顯著差異,但是脾切除術(shù)后4周肝臟CD3+CD8+T細(xì)胞顯著升高,肝脾CD3+CD4+/CD3+CD8+在術(shù)后1周、2周、4周均顯著降低。這可能是由于脾臟切除術(shù)后脾臟的濾血功能缺失,由門(mén)靜脈進(jìn)入肝臟的病原物增多造成,但其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

應(yīng)激能增加外周血單核細(xì)胞、粒細(xì)胞等免疫細(xì)胞的比例[14,16],而脾切除手術(shù)相對(duì)與假手術(shù)而言恢復(fù)較慢,是一個(gè)應(yīng)激源。該研究還顯示脾切除術(shù)后1周外周血CD11b+Ly6Chi單核細(xì)胞、CD11b+Ly6G+粒細(xì)胞顯著升高,而在術(shù)后2周、4周無(wú)顯著差異。這可能是由于脾切除手術(shù)應(yīng)激造成的術(shù)后1周外周血CD11b+Ly6Chi單核細(xì)胞、CD11b+Ly6G+粒細(xì)胞升高,但其具體原因仍需進(jìn)一步探索。