程昊，陳姚鋒，唐婷范，張帥

（1.廣西科技大學生物與化學工程學院，廣西糖資源綠色加工重點實驗室，廣西柳州545006；2.肇慶學院食品與制藥工程學院，廣東肇慶526061）

百香果（Passiflora eduli），又名西番蓮、雞蛋果，是西番蓮科西番蓮屬藤本植物，原產(chǎn)南美洲，在我國南方熱帶、亞熱帶地區(qū)有廣泛種植，其中廣西地區(qū)是最大的百香果種植基地[1-3]。百香果具有濃烈獨特的芳香和風味，富含多種維生素、礦物質(zhì)、氨基酸、碳水化合物等營養(yǎng)物質(zhì)，另外，百香果還含有芹菜素、木樨草素、槲皮素多種黃酮類活性物質(zhì)，具有抗氧化、降血脂、降血壓及解酒護肝等生理功效[4-8]。

百香果去殼后即為酸甜可口的果汁，同時具有獨特的芳香氣味，這些特點比較適合釀造果酒，但經(jīng)文獻檢索，目前尚未有百香果酒的研究報道。本研究以百香果汁為原料，以釀酒酵母為發(fā)酵劑，釀造出一款口感獨特的低度發(fā)酵型百香果酒，并通過單因素試驗和正交試驗對發(fā)酵工藝進行優(yōu)化。本研究不僅提供了一款新型果酒，而且為百香果的深加工開辟了一條可行的新途徑，這對于促進百香果行業(yè)及果酒行業(yè)的發(fā)展、帶動百香果種植地區(qū)的經(jīng)濟發(fā)展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

百香果：2018年10月采摘于廣西柳江縣成團鎮(zhèn)，洗凈晾干，4℃儲藏備用；釀酒酵母（菌種保藏號CICC1215）（4℃斜面保藏）：廣東省微生物菌種保藏中心；粉末狀麥芽汁培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；果膠酶（500 U/mg，食品級）：河南萬邦實業(yè)有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

WS108型手持式糖度計：上海譜振生物科技有限公司；PHS型數(shù)顯酸度計：濰坊金水華禹信息科技有限公司；PX-A1T精密酒精計（分度值為0.1%Vol）：廣州市普析通儀器有限公司；600數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋：金壇市維誠實驗器材有限公司；ZY-F32型恒溫發(fā)酵箱：上海喆研機械制造有限公司；TDL-16C型高速臺式離心機：上海安亨科學儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

1.3.2 操作要點

1.3.2.1 果汁制備

百香果破殼后取出果汁于燒杯內(nèi)，加入適量果膠酶，50℃恒溫60 min以充分水解果汁中的果膠，從而降低果汁黏度而有利于發(fā)酵過程。最后，4 000 r/min離心10 min，取上清液即為酶解后的果汁。

1.3.2.2 添加配料

在果汁中加入蔗糖至糖度20°Bx以利于發(fā)酵，同時，為防止果汁中單寧類物質(zhì)的氧化以及抑制果汁中雜菌的生長，還需添加60 mg/L焦亞硫酸鉀。

1.3.2.3 酵母種子液制備

無菌條件下，取一環(huán)斜面酵母接種至麥芽汁培養(yǎng)基中，28℃下120 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)72 h后即得酵母種子液，檢測菌體濃度。

1.3.2.4 主發(fā)酵

在裝有已添加配料的百香果汁的發(fā)酵瓶中加入適量酵母種子液，以溶液最終達到發(fā)酵瓶容量的3/4為宜，混勻后用8層紗布密封瓶口，然后置于恒溫發(fā)酵箱內(nèi)進行無氧發(fā)酵，發(fā)酵過程中產(chǎn)生的CO2可通過紗布及時排出。發(fā)酵溫度一般在15℃～25℃之間，溫度太低發(fā)酵難以啟動，而溫度過高則發(fā)酵加速并可能產(chǎn)生醋酸，同時酵母細胞易老化[9-11]。當發(fā)酵液表面趨于平靜，不再有氣泡產(chǎn)生時，表明主發(fā)酵階段結(jié)束。

1.3.2.5 陳釀

陳釀即后發(fā)酵，此過程要去除發(fā)酵醪液中的酒糟，避免產(chǎn)生不良風味而影響酒的品質(zhì)。采用虹吸法將酒液吸到另一干凈容器內(nèi)，小心操作勿使底部酒糟吸出，同時吸到新容器后要盡量加滿，以減少氧氣對酒液的氧化作用[12-13]。

1.3.2.6 澄清過濾

由于酒液中含有植物單寧、蛋白質(zhì)等攜帶陰離子的大分子物質(zhì)[14-15]，因此酒液陳釀后可能會出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象，可用帶正電荷的澄清劑如明膠對酒液進行澄清，然后再用超濾膜過濾，最終可獲得清澈的酒液。

1.3.2.7 滅菌

采用巴氏殺菌法。酒液灌瓶后，63℃恒溫20 min，抑制腐敗菌生長并防止酒體二次發(fā)酵。滅菌時要注意酒瓶的瓶頸空隙率，防止因加熱導致瓶內(nèi)壓力升高而發(fā)生炸瓶現(xiàn)象。

1.3.3 單因素試驗

在主發(fā)酵過程中，酵母接種量不同，會引起發(fā)酵啟動速度及發(fā)酵周期不同，形成的酒體感官品質(zhì)會有很大差異。適宜的發(fā)酵溫度是酵母保持良好發(fā)酵性能的重要因素，而發(fā)酵液初始pH值則通過影響酵母細胞表面所帶電荷的狀態(tài)而影響酵母的生長、代謝及發(fā)酵能力?；诖耍驹囼灧謩e考察接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵液初始pH值這3個重要因素對發(fā)酵液糖度變化的影響，確定適宜的參數(shù)范圍。

接種量對發(fā)酵的影響：在發(fā)酵過程中，設(shè)定發(fā)酵溫度為20°C，發(fā)酵液初始pH值為3.3（自然pH值），考察接種量分別為體積百分比0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%時對發(fā)酵液糖度變化的影響。

溫度對發(fā)酵的影響：在發(fā)酵過程中，設(shè)定接種量為2.0%，發(fā)酵液初始pH值為3.3（自然pH值），考察發(fā)酵溫度分別為 16、18、20、22、24 ℃時對發(fā)酵液糖度變化的影響。

發(fā)酵液初始pH值對發(fā)酵的影響：在發(fā)酵過程中，設(shè)定接種量為2.0%，發(fā)酵溫度為20℃，考察發(fā)酵液初始 pH 值分別為 2.7、3.0、3.3、3.6、3.9、4.2 時，菌體濃度和發(fā)酵液糖度的變化。

1.3.4 正交試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，設(shè)計酵母接種量（A）、發(fā)酵溫度（B）、發(fā)酵液初始pH值（C）、空列（D）四因素三水平L9（34）正交試驗，正交因素水平表見表1。以感官品質(zhì)為響應指標，優(yōu)化發(fā)酵工藝參數(shù)。感官品質(zhì)通過感官評分來衡量，結(jié)合本試驗百香果酒的實際情況，制定感官評價標準如表2，邀請8名專業(yè)人員參照本標準作出品評和打分。

表1 正交試驗因素水平Table 1 Orthogonal test factors and levels

表2 感官評分標準Table 2 Sensory scoring standard

1.3.5 質(zhì)量檢測

酵母菌濃度：血細胞計數(shù)板法測定；pH值：酸度計測定；糖度：手持式糖度計測定；酒精度：酒精計測定；總酸：電位滴定法測定，參照GB/T 10345-2007《白酒分析方法》[16]；殘?zhí)牵?，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）法測定，參照 NY/T 2742-2015《水果及制品可溶性糖的測定》[17]；菌落總數(shù)：稀釋平板計數(shù)法測定，參照GB 4789.2-2016《食品微生物菌落總數(shù)的測定》[18]；大腸菌群：稀釋培養(yǎng)測數(shù)法測定，參照GB 4789.3-2016《食品微生物學檢驗大腸菌群計數(shù)》[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果與分析

2.1.1 接種量對發(fā)酵的影響

接種量對發(fā)酵的影響見圖1。

由圖1可看出，接種量≤1.0%時，發(fā)酵啟動比較慢從而導致發(fā)酵周期延長，這不但增加了生產(chǎn)成本，而且也提高了發(fā)酵液染菌的幾率。接種量≥2.5%時，發(fā)酵液糖度迅速下降，發(fā)酵快速啟動，雖然縮短了發(fā)酵周期，但過快的發(fā)酵對酒體風味物質(zhì)的形成不利，從而降低酒的感官品質(zhì)[20]。當接種量為1.5%～2.0%時，發(fā)酵速度適中，這有利于形成高質(zhì)量的酒，當發(fā)酵至第9天時，該接種量范圍的發(fā)酵液糖度已低于1°Bx，可在此時停止發(fā)酵。

圖1 接種量對發(fā)酵的影響Fig.1 Effects of yeast inoculums on fermentation

2.1.2 溫度對發(fā)酵的影響

溫度對發(fā)酵的影響見圖2。

圖2 溫度對發(fā)酵的影響Fig.2 Effects of temperature on fermentation

從圖2中可以看出，發(fā)酵溫度為16℃和18℃時，發(fā)酵啟動及整個發(fā)酵過程都比較緩慢，第9天時的發(fā)酵液糖度還高于1°Bx，發(fā)酵不完全。而當發(fā)酵溫度為22℃和24℃時，發(fā)酵啟動較快，分別在第8天和第7天時發(fā)酵液糖度便降到了1°Bx以下，過快的發(fā)酵不僅不利于風味物質(zhì)的形成，而且酒體會有較強的刺激口感，影響酒的感官品質(zhì)[11]。當發(fā)酵溫度為20℃時，發(fā)酵降糖速度較適中，有利于后期酒中風味成分的形成，酒的口感比較柔和，同時，酒液清澈度好，有利于后期的過濾澄清。

2.1.3 發(fā)酵液初始pH值對發(fā)酵的影響

發(fā)酵液初始pH值對發(fā)酵的影響見表3。

從表3可看出，發(fā)酵液初始pH值為2.7、3.0、4.2時，酵母繁殖較慢，較低的菌體濃度導致發(fā)酵液糖度下降很慢，發(fā)酵周期會比較長。當pH值為3.3、3.6、3.9時，48 h內(nèi)菌體濃度增加較快，加速了發(fā)酵液糖度的下降。這可能是因為pH值較低或較高時，不利于該釀酒酵母的生長繁殖，從而影響了其發(fā)酵能力。

表3 發(fā)酵液初始pH值對發(fā)酵的影響Table 3 Effects of initial pH of fermentation broth on fermentation

2.2 正交試驗結(jié)果與分析

在單因素試驗確定的各因素參數(shù)范圍內(nèi)，以百香果酒的感官評分為指標設(shè)計正交試驗結(jié)果如表4。

表4 正交試驗設(shè)計和結(jié)果Table 4 Orthogonal test design and results

由表4可看到，9次試驗得到的百香果酒的感官評分均超過了80分，這說明，在各因素選定的水平范圍內(nèi)，釀出的百香果酒質(zhì)量都比較好。通過進一步對比，可以看出3個因素的最優(yōu)水平分別為A2（接種量1.8%）、B2（發(fā)酵溫度20℃）、C2（pH 3.6），且因素A即接種量對酒體感官質(zhì)量的影響最大，而B發(fā)酵溫度及C發(fā)酵液pH值影響較小，這可能是因為當接種量不同時，酵母經(jīng)生長繁殖其菌體濃度不同，而菌體濃度對降糖影響最大，最終導致發(fā)酵差異較大。而溫度在（20±1）℃范圍內(nèi)時，對釀酒酵母的生長代謝影響較小，因而其發(fā)酵程度變化不大。在A2B2C2發(fā)酵工藝參數(shù)下進行驗證試驗，制備的酒的感官評分為92.45±3.75，高于表4中各次試驗的感官評分，因此該條件可最終確定為百香果酒最優(yōu)發(fā)酵工藝參數(shù)。

2.3 質(zhì)量檢測結(jié)果

最優(yōu)發(fā)酵工藝條件下獲得的百香果酒，質(zhì)量檢測結(jié)果顯示：酒精度為11.5%Vol、總酸為6.18 g/L（以酒石酸計）、殘?zhí)恰? g/L（以葡萄糖計）、菌落總數(shù)≤10 cfu/mL、大腸菌群≤2 cfu/mL。本工藝制備的百香果酒，呈明亮橙黃色，酒液透明清澈。另外，本產(chǎn)品具有濃郁的百香果特征香氣，無異味，酸甜可口，酒體柔和爽口。

3 結(jié)論

本研究通過釀酒酵母發(fā)酵百香果汁研制出一款發(fā)酵型百香果酒，重點對發(fā)酵工藝進行了優(yōu)化。首先通過單因素試驗考察了接種量、發(fā)酵溫度及發(fā)酵液初始pH值3個重要因素對發(fā)酵液糖度變化的影響，然后在此基礎(chǔ)上設(shè)計L9（34）正交試驗進一步優(yōu)化工藝，最終確定最優(yōu)發(fā)酵工藝參數(shù)為：酵母接種量為體積百分比1.8%、發(fā)酵溫度為20℃、發(fā)酵液初始pH值為3.6，在此條件下獲得的百香果酒感官評分最高，為92.45±3.75。質(zhì)量檢測結(jié)果顯示，本產(chǎn)品酒精度為11.5%Vol，具有本產(chǎn)品的典型風格。