杜書(shū)嵩，趙偉東

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)1.生命科學(xué)學(xué)院發(fā)育細(xì)胞生物學(xué)教研室，教育部醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨衛(wèi)健委細(xì)胞生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng) 110122；2.附屬第一醫(yī)院肛腸外科，沈陽(yáng) 110001）

肌動(dòng)蛋白是真核生物細(xì)胞骨架微絲的主要組成成分，肌動(dòng)蛋白單體形式稱(chēng)為球狀肌動(dòng)蛋白，能夠聚合成肌動(dòng)蛋白絲，進(jìn)而組裝形成微絲。肌動(dòng)蛋白參與多種細(xì)胞的生命活動(dòng)，包括維持細(xì)胞形狀、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞分裂、吞噬和細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)龋?］。為了對(duì)細(xì)胞中的肌動(dòng)蛋白進(jìn)行觀察，目前研究人員常用能夠與肌動(dòng)蛋白絲結(jié)合的熒光標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽對(duì)固定后的細(xì)胞進(jìn)行染色［2］，這樣能夠在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白絲的分布和變化。有研究［3］報(bào)道，細(xì)胞在固定過(guò)程中其肌動(dòng)蛋白結(jié)構(gòu)會(huì)受到一定程度的破壞，因此鬼筆環(huán)肽染色方法不一定能準(zhǔn)確顯示肌動(dòng)蛋白絲的變化。因此，很多學(xué)者嘗試?yán)没罴?xì)胞模型對(duì)肌動(dòng)蛋白進(jìn)行研究。為了在活細(xì)胞中分析肌動(dòng)蛋白絲的動(dòng)態(tài)變化，有學(xué)者通過(guò)向細(xì)胞內(nèi)注射微量熒光標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽對(duì)細(xì)胞中的肌動(dòng)蛋白絲進(jìn)行標(biāo)記，也有學(xué)者將編碼肌動(dòng)蛋白和綠色熒光蛋白 （green fluorescent protein，GFP） 融合基因的載體轉(zhuǎn)染至細(xì)胞內(nèi)，以實(shí)現(xiàn)在活細(xì)胞中對(duì)肌動(dòng)蛋白的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行檢測(cè)，然而上述方法對(duì)活細(xì)胞中肌動(dòng)蛋白的動(dòng)力學(xué)也有一定影響［4］。因此，目前亟需既能對(duì)活細(xì)胞中的肌動(dòng)蛋白進(jìn)行實(shí)時(shí)觀察，又不影響肌動(dòng)蛋白功能的方法。

腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞 （brain microvascular endothelial cell，BMEC） 是組成腦微血管的細(xì)胞，也是構(gòu)成血腦屏障的重要細(xì)胞組分。BMEC間存在緊密連接以及黏附連接結(jié)構(gòu)，而肌動(dòng)蛋白與緊密連接以及黏附連接均有關(guān)聯(lián)。肌動(dòng)蛋白與ZO蛋白家族 （包括ZO-1、ZO-2、ZO-3） 直接結(jié)合，并與緊密連接蛋白閉鎖蛋白和閉合蛋白一起維護(hù)緊密連接結(jié)構(gòu)，而且肌動(dòng)蛋白還與連環(huán)蛋白結(jié)合，參與黏附連接的形成［5］。有研究報(bào)道，細(xì)胞松弛素處理或缺血缺氧條件下都會(huì)導(dǎo)致BMEC肌動(dòng)蛋白絲解聚，通過(guò)破壞BMEC間的連接結(jié)構(gòu)從而導(dǎo)致血腦屏障滲漏［6］。另外，在生理和病理?xiàng)l件下的腦微血管新生過(guò)程中，位于新生血管芽末端的BMEC （也稱(chēng)尖端細(xì)胞） 會(huì)形成由肌動(dòng)蛋白組成的放射狀絲狀偽足，用于引導(dǎo)新生血管出芽的方向［7］。因此，肌動(dòng)蛋白在維護(hù)BMEC結(jié)構(gòu)和功能方面發(fā)揮重要作用。

Lifeact是從酵母菌中分離的由17個(gè)氨基酸組成的短肽，具有穩(wěn)定結(jié)合肌動(dòng)蛋白絲的特性［8］。本研究構(gòu)建了GFP標(biāo)記的Lifeact真核表達(dá)載體 （LifeactpEGFP），將其轉(zhuǎn)染至BMEC中，用于在活細(xì)胞中觀察肌動(dòng)蛋白的動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Lifeact-pEGFP可以有效地標(biāo)記BMEC中的肌動(dòng)蛋白絲，并能反映肌動(dòng)蛋白的動(dòng)態(tài)變化，且對(duì)細(xì)胞的存活沒(méi)有明顯影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞：人BMEC為美國(guó)約翰·霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院KIM博士惠贈(zèng)。

1.1.2 主要試劑：青霉素-鏈霉素雙抗購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清和胰酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Nu血清購(gòu)自美國(guó)BD Biosciences公司；Lipofectamine 2000和鬼筆環(huán)肽購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；CCK-8檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒構(gòu)建和鑒定：以pEGFP-N1為載體，選擇多克隆位點(diǎn)中的XhoⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)，以無(wú)縫克隆方法，把Lifeact的編碼序列克隆至pEGFP-N1載體中；然后提取重組質(zhì)粒，以限制性?xún)?nèi)切酶BamHⅠ進(jìn)行酶切反應(yīng)，將反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，利用凝膠電泳成像系統(tǒng)對(duì)酶切結(jié)果進(jìn)行分析。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)：BMEC培養(yǎng)于含10%胎牛血清、10%Nu血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，置于37 ℃、5%CO2、100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d更換新鮮培養(yǎng)液。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：將BMEC以1×106/孔接種于6孔板，待細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前1 h更換RPMI 1640培養(yǎng)基，將Lipofectamine 2000與Lifeact-pEGFP質(zhì)?；騪EGFP-N1載體質(zhì)粒按一定比例混合后轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染5 h后，更換為含血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.4 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：將BMEC分為2組，分別轉(zhuǎn)染Lifeact-pEGFP質(zhì)粒和pEGFP-N1空載體質(zhì)粒，消化并接種在96孔板中，2×103/孔，體積為100 μL，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。分別在24、48、72和96 h后每孔加入10 μL CCK-8溶液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育1 h，隨后采用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處吸光度值。

1.2.5 免疫熒光染色：將BMEC分為2組，分別轉(zhuǎn)染Lifeact-pEGFP質(zhì)粒和pEGFP-N1空載體，24 h后 用PBS洗3次，隨后用4%甲醛于室溫固定30 min。固定后的細(xì)胞用PBS洗3次，每次5 min。加入0.1% Triton X-100處理5 min，細(xì)胞用PBS洗3次，用5%牛血清白蛋白于室溫封閉30 min。加入1 ∶1 000稀釋的羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽，避光孵育1 h。PBS洗3次，用封片劑封片，以共聚焦激光掃描顯微鏡 （型號(hào)Ti2，日本Nikon公司） 觀察并采集圖像。

1.2.6 細(xì)胞伸展實(shí)驗(yàn)：為了實(shí)時(shí)評(píng)估細(xì)胞黏附伸展情況，將轉(zhuǎn)染的BMEC消化后接種于玻璃底面的共聚焦專(zhuān)用直徑35 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，并將其置于安裝在顯微鏡載物臺(tái)上的37 ℃培養(yǎng)小室中，每30 s成像1次，以倒置共聚焦激光掃描顯微鏡成像60 min。成像過(guò)程中以細(xì)胞初始位置為中心，觀察細(xì)胞向外周的伸展情況。

1.2.7 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)：將BMEC接種于玻璃底細(xì)胞培養(yǎng)皿中，于轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后24 h，用無(wú)菌吸頭在長(zhǎng)滿(mǎn)細(xì)胞的培養(yǎng)皿上均勻地劃一道直線。用PBS洗細(xì)胞3次，加入無(wú)血清培養(yǎng)基，置于安裝在顯微鏡載物臺(tái)上的37 ℃培養(yǎng)小室中，設(shè)定拍攝間隔60 s，累計(jì)成像60 min。共聚焦顯微鏡成像過(guò)程中以細(xì)胞初始位置為中心，觀察細(xì)胞向劃痕方向的遷移情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，使用GraphPad Prism 6軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。2組比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Lifeact-pEGFP質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定

利用pEGFP-N1載體的多克隆位點(diǎn)中的XhoⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)，把Lifeact的編碼序列 （54 bp）克隆至載體中，獲得重組質(zhì)粒Lifeact-pEGFP （4 754 bp） 后，將質(zhì)粒DNA以BamHⅠ進(jìn)行酶切，采用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析，利用紫外凝膠電泳成像系統(tǒng)拍照記錄，在5 000 bp處可見(jiàn)清晰DNA條帶 （圖1A）。將Lifeact-pEGFP質(zhì)粒進(jìn)行DNA測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)插入序列與酵母的Lifeact的序列一致 （圖1B），說(shuō)明Lifeact-pEGFP重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 Lifeact-pEGFP質(zhì)粒的鑒定Fig.1 Identification of the recombinant Lifeact-pEGFP construct

2.2 Lifeact-pEGFP的表達(dá)不影響B(tài)MEC的存活

為了探討Lifeact-pEGFP重組質(zhì)粒的表達(dá)是否對(duì)BMEC存活產(chǎn)生影響，在BMEC轉(zhuǎn)染Lifeact-pEGFP質(zhì)粒和pEGFP-N1空載體質(zhì)粒后24、48、72、96 h，利用CCK-8試劑進(jìn)行檢測(cè)，判斷活細(xì)胞的數(shù)量。與轉(zhuǎn)染pEGFP-N1載體質(zhì)粒的BMEC相比，轉(zhuǎn)染LifeactpEGFP后的BMEC在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的存活水平?jīng)]有明顯變化，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （P> 0.05），見(jiàn)圖2。說(shuō)明LifeactpEGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至BMEC后，表達(dá)產(chǎn)生的LifeactpEGFP融合蛋白對(duì)細(xì)胞的存活沒(méi)有明顯影響，可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

2.3 BMEC中表達(dá)的Lifeact-pEGFP與肌動(dòng)蛋白絲呈共定位

圖2 Lifeact-pEGFP質(zhì)粒表達(dá)對(duì)BMEC存活的影響Fig.2 Survival of BMECs transfected with Lifeact-pEGFP

為了分析在BMEC中表達(dá)的Lifeact-pEGFP與肌動(dòng)蛋白的相關(guān)性，分別將轉(zhuǎn)染pEGFP-N1空載體質(zhì)粒和Lifeact-pEGFP質(zhì)粒的BMEC固定后以紅色熒光標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽進(jìn)行染色，在激光共聚焦顯微鏡下觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Lifeact-pEGFP的綠色熒光信號(hào)與鬼筆環(huán)肽的紅色熒光信號(hào)位置分布一致，而pEGFP-N1空載體無(wú)上述分布特點(diǎn) （圖3A、3C）。進(jìn)一步對(duì)圖3A和3C中白色虛線位置進(jìn)行雙通道熒光譜線分析，結(jié)果顯示，pEGFP-N1空載體質(zhì)粒與鬼筆環(huán)肽信號(hào)無(wú)共定位，Lifeact-pEGFP與鬼筆環(huán)肽的熒光信號(hào)呈明顯共定位 （圖3B、3D）。以上結(jié)果顯示，Lifeact-pEGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BMEC后表達(dá)的Lifeact-pEGFP融合蛋白能夠顯示BMEC中的肌動(dòng)蛋白絲，主要表現(xiàn)為分布于胞質(zhì)內(nèi)的應(yīng)力纖維，以及分布于細(xì)胞邊緣的皮質(zhì)纖維，而細(xì)胞核區(qū)域的肌動(dòng)蛋白絲則很少，這與鬼筆環(huán)肽染色標(biāo)記的肌動(dòng)蛋白絲一致，即利用Lifeact-pEGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方法可以對(duì)BMEC中的肌動(dòng)蛋白絲進(jìn)行標(biāo)記。

圖3 BMEC中表達(dá)的Lifeact-pEGFP能夠標(biāo)記肌動(dòng)蛋白絲Fig.3 Localization of F-actin in BMECs by the expression of Lifeact-pEGFP

2.4 Lifeact-pEGFP的表達(dá)可以顯示BMEC在伸展過(guò)程中肌動(dòng)蛋白絲的動(dòng)態(tài)變化

為了分析Lifeact-pEGFP是否可以用來(lái)檢測(cè)肌動(dòng)蛋白的動(dòng)態(tài)變化，將轉(zhuǎn)染Lifeact-pEGFP質(zhì)粒的BMEC消化后重新接種于培養(yǎng)皿中，置于37 ℃的培養(yǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)，此時(shí)可以觀察到細(xì)胞從懸浮至貼壁的整個(gè)過(guò)程，即細(xì)胞伸展，同時(shí)利用激光共聚焦顯微鏡對(duì)活細(xì)胞和GFP熒光信號(hào)進(jìn)行連續(xù)觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞逐漸伸展的過(guò)程中，肌動(dòng)蛋白絲主要分布于細(xì)胞邊緣，對(duì)熒光信號(hào)的分布進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，Lifeact-pEGFP主要分布于細(xì)胞外周皮質(zhì)區(qū) （圖4A、4B）。BMEC伸展時(shí)，在細(xì)胞外周皮質(zhì)區(qū)形成片狀偽足和絲狀偽足的結(jié)構(gòu)，且片狀偽足和絲狀偽足內(nèi)的Lifeact-pEGFP標(biāo)記的肌動(dòng)蛋白絲并不是恒定不變，而是呈現(xiàn)出高度動(dòng)態(tài)的變化 （圖4A）。在細(xì)胞伸展早期，肌動(dòng)蛋白絲均勻分布于細(xì)胞皮質(zhì)區(qū)并參與形成較多絲狀偽足；在細(xì)胞伸展的晚期，隨著細(xì)胞面積逐漸增大，肌動(dòng)蛋白絲的分布出現(xiàn)極性分布，細(xì)胞形態(tài)也由圓形逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)樯刃位蛩笮巍＜?xì)胞面積的測(cè)量結(jié)果顯示，隨著時(shí)間的進(jìn)展，BMEC的面積逐漸增大，在60 min內(nèi)呈線性增長(zhǎng)趨勢(shì) （圖4C）。以上結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染Lifeact-pEGFP可以用來(lái)分析細(xì)胞伸展時(shí)肌動(dòng)蛋白絲的動(dòng)態(tài)變化。

2.5 Lifeact-pEGFP能夠標(biāo)記運(yùn)動(dòng)細(xì)胞前導(dǎo)緣肌動(dòng)蛋白絲的動(dòng)態(tài)變化

為了分析Lifeact-pEGFP是否可以用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞遷移時(shí)肌動(dòng)蛋白的動(dòng)態(tài)變化，將轉(zhuǎn)染LifeactpEGFP質(zhì)粒的BMEC消化后重新接種于玻璃底培養(yǎng)皿中，繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞接近長(zhǎng)滿(mǎn)時(shí)進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)。然后在37 ℃的培養(yǎng)小室中以激光共聚焦顯微鏡對(duì)活細(xì)胞和GFP的熒光信號(hào)進(jìn)行連續(xù)觀察，主要關(guān)注向劃痕區(qū)域逐漸移動(dòng)的單個(gè)細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在BMEC逐漸向劃痕區(qū)遷移的過(guò)程中，Lifeact-pEGFP顯示的肌動(dòng)蛋白絲主要分布于細(xì)胞的前導(dǎo)緣 （即朝向劃痕方向的細(xì)胞邊緣），且構(gòu)成前導(dǎo)緣的片狀偽足內(nèi)的肌動(dòng)蛋白絲呈高度動(dòng)態(tài)的變化 （圖5A、5B）。以上結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染Lifeact-pEGFP可以用來(lái)分析BMEC遷移時(shí)前導(dǎo)緣肌動(dòng)蛋白絲的動(dòng)態(tài)變化。

3 討論

圖4 BMEC在貼壁伸展過(guò)程中Lifeact-pEGFP標(biāo)記的肌動(dòng)蛋白絲的變化Fig.4 Changes of Lifeact-pEGFP labeled F-actin in BMECs during cell spreading

圖5 轉(zhuǎn)染Lifeact-pEGFP后可以標(biāo)記細(xì)胞遷移過(guò)程中BMEC肌動(dòng)蛋白絲的變化Fig.5 F-actin dynamics in migrating BMECs indicated by the expression of Lifeact-pEGFP

Lifeact是在酵母菌中發(fā)現(xiàn)的一種含有17個(gè)氨基酸的短肽，具有穩(wěn)定結(jié)合肌動(dòng)蛋白絲的特性［8-9］。本研究構(gòu)建了GFP標(biāo)記Lifeact的真核表達(dá)載體即Lifeact-pEGFP，并成功將Lifeact-pEGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至人BMEC中。細(xì)胞存活實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染LifeactpEGFP后BMEC存活未受到影響，因此在細(xì)胞轉(zhuǎn)染Lifeact-pEGFP質(zhì)粒后，可以在活細(xì)胞水平進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間實(shí)時(shí)檢測(cè)，從而可以觀察細(xì)胞伸展和遷移過(guò)程中肌動(dòng)蛋白絲的動(dòng)態(tài)變化，在BMEC活細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)對(duì)肌動(dòng)蛋白絲的可視化研究，為研究血管內(nèi)皮細(xì)胞中肌動(dòng)蛋白絲的動(dòng)態(tài)變化提供了直觀高效的手段。

肌動(dòng)蛋白絲在BMEC中主要呈現(xiàn)為橫貫細(xì)胞的聚集而成的應(yīng)力纖維，以及沿著細(xì)胞邊緣聚集形成的皮質(zhì)纖維。在Lifeact-pEGFP轉(zhuǎn)染的BMEC中，細(xì)胞中的GFP熒光信號(hào)能夠反映應(yīng)力纖維和皮質(zhì)纖維的分布，且與鬼筆環(huán)肽染色的信號(hào)能夠?qū)崿F(xiàn)明顯的共定位，這說(shuō)明Lifeact-pEGFP融合蛋白能夠與肌動(dòng)蛋白絲直接結(jié)合，從而能夠反映肌動(dòng)蛋白絲分布的部位。而且，Lifeact-pEGFP熒光信號(hào)的強(qiáng)弱還能用來(lái)判斷肌動(dòng)蛋白的聚合程度，即在有較多肌動(dòng)蛋白分子聚集的部位，其能夠結(jié)合的Lifeact-pEGFP也較多，因此熒光信號(hào)也較強(qiáng)；反之則較弱。

細(xì)胞在遷移過(guò)程中形態(tài)出現(xiàn)明顯變化，朝向細(xì)胞遷移方向的細(xì)胞邊緣稱(chēng)為前導(dǎo)緣，是決定細(xì)胞遷移的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)［10］。本研究顯示，Lifeact-pEGFP在正常培養(yǎng)的BMEC中主要以應(yīng)力纖維和皮質(zhì)纖維的形式呈現(xiàn)，在細(xì)胞中央和細(xì)胞周邊均有分布；然而，在遷移的BME中，Lifeact-pEGFP主要分布于前導(dǎo)緣，說(shuō)明細(xì)胞遷移過(guò)程中肌動(dòng)蛋白單體發(fā)生了重新分布，形成應(yīng)力纖維和皮質(zhì)纖維的肌動(dòng)蛋白絲發(fā)生了解聚，解聚后的肌動(dòng)蛋白單體則在前導(dǎo)緣重新組裝。研究［11-12］顯示，導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白組裝的上游因子主要是Wiskott-Aldrich綜合征蛋白和Wiskott-Aldrich Verprolin蛋白被激活后引起的肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白2/3復(fù)合體的活化，從而使新的肌動(dòng)蛋白絲在與原有肌動(dòng)蛋白絲呈70°的方向延長(zhǎng)，推動(dòng)前導(dǎo)緣向前移動(dòng)。

需要指出的是，也有研究［13］報(bào)道過(guò)表達(dá)Lifeact-GFP能夠使coffilin與肌動(dòng)蛋白的結(jié)合增多，從而對(duì)肌動(dòng)蛋白絲的組裝有一定的抑制效應(yīng)。因此，筆者建議在實(shí)際進(jìn)行Lifeact-pEGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)時(shí)，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的劑量不應(yīng)過(guò)多。