曾堅 廖鳳鳳 吳春來 胡偉

摘要：【目的】克隆木薯熱激轉錄因子（HSF）基因MeHSF7并分析其在抗逆響應和采后生理性變質（PPD）過程中的表達情況，為研究MeHSF7基因在響應干旱脅迫及延緩生理性變質的調控機制提供理論參考?！痉椒ā客ㄟ^同源克隆從木薯葉片克隆MeHSF7基因，對其生物信息學和組織表達特性進行分析，并明確其在干旱和脫落酸（ABA）處理下及PPD過程中的表達模式?！窘Y果】克隆獲得的MeHSF7基因開放閱讀框（ORF）為1206 bp，編碼401個氨基酸殘基，與參考序列（Manes.02G087400.1）僅存在2個堿基差異，位于第2染色體上，含有1個內含子和2個外顯子。MeHSF7蛋白理論分子量46.1 kD，理論等電點（pI）5.95，為不穩(wěn)定蛋白，定位于細胞核，無跨膜區(qū)域，含有HSF蛋白的保守結構域DBD（DNA結合功能域）、HR-A Core和HR-B Core，屬于HSFA亞家族，與橡膠樹和麻瘋樹HSF蛋白的氨基酸序列同源性最高，分別為79.20%和64.95%，在系統(tǒng)發(fā)育進化樹上與橡膠樹HSF蛋白聚在同一小分支，表明二者親緣關系較近。MeHSF7基因在不同組織中的表達量均較低，但不同組織間存在明顯差異，在松散性胚性愈傷組織、分化胚組織、須根和根頂端分生組織中的表達量相對較高，在葉柄中的表達水平最低。MeHSF7基因啟動子區(qū)域含有ABA響應元件（ABRE）、干旱誘導元件（MBS）和光響應元件（ACE、Box 4）等。干旱處理下，MeHSF7基因表達量隨處理時間的增加整體上呈升高趨勢，在處理7 d后達峰值;在ABA處理下，處理5和7 d后MeHSF7基因表達量較處理0和3 d后明顯上調，尤其在處理5 d后達峰值，表明MeHSF7基因表達受干旱和ABA處理的誘導。在木薯塊根的PPD過程中，MeHSF7基因表達量隨暗培養(yǎng)時間的增加而升高，處理6、12和48 h的表達量分別是處理0 h的2.1、2.2和3.2倍。【結論】MeHSF7基因可能在轉錄水平通過依賴于ABA信號通路的途徑響應干旱脅迫及木薯塊根的氧化脅迫，可作為候選基因用于研究其在木薯抗逆和采后儲存中的調控功能。

關鍵詞： 木薯;熱激轉錄因子（HSF）;MeHSF7基因;克隆;干旱脅迫;采后生理性變質（PPD）;表達分析

Abstract：【Objective】In order to analyze the function of cassava heat shock transcription factor（HSF） gene MeHSF7 during drought stress and post-harvest physiological deterioration（PPD） process， MeHSF7 gene was cloned and analyzed the expression in stress response and PPD. 【Method】In this paper，MeHSF7 was cloned from cassava through homologous cloning method. The bioinformatic analysis and tissues expression pattern of MeHSF7 were conducted， the expression of MeHSF7 gene was also analyzed under drought and abscisic acid（ABA） treatments and in PPD. 【Result】The open reading frame（ORF） of MeHSF7 was 1206 bp， encoded 401 amino acid residues. MeHSF7 located on chromosome 2 and contained one intron and two exons， which had only two base differences from the reference sequence （Manes.02G087400.1）. MeHSF7 protein theoretical molecular weight was 46.1 kD， theoretical isoelectric point（pI） was 5.95. It was an unstable protein and located in the nucleus with no transmembrane domains，which contained conserved domain with HSF protein， such as DNA binding domain （DBD）， HR-A Core， HR-B Core， belonging to HSFA family. Multiple protein sequence alignment presented that MeHSF7 showed a high sequence similarity with HSF proteins in Hevea brasiliensis （79.20%） and Jatropha curcas （64.95%）， and clustered in the same small branch with H. brasiliensis HSF，suggesting close genetic relationship. The expression of MeHSF7 was low in different tissues， but there were obvious differences among different tissues. The expression of MeHSF7 was relatively high in friable embryogenic calli， organized embryogenic structure， fibrous roots and root apical meristem， while the expression level was the lowest in petiole. Results of promoter element analysis revealed that MeHSF7 contained ABA responsive motif （ABRE）， drought-induced motif （MBS）， and several light-responsive motifs（ACE and Box 4）. The expression of MeHSF7 was up-regulated accompanying with PEG treatment time increased and reached its peak at 7 d under drought treatment. The expression of MeHSF7 gene was also up-regulated 5 and 7 d after ABA treatment compared with that on day 0 and day 3， and reached its peak at 5 d. These results showed that MeHSF7 was induced by drought stress and ABA treatment. The expression of MeHSF7 was up-regulated as dark culture time expanded under cassava root PPD， and reached 2.1 times， 2.2 times and 3.2 times at 6，12 and 48 h of PPD process， respectively. 【Conclusion】MeHSF7 might responds to drought stress and cassava root oxidative stress relying on ABA signal path way at transcription level， and it can be regarded as a candidate gene for future function analysis in cassava stress tolerance and post-harvest storage.

Key words： cassava; heat shock transcription factor（HSF）;MeHSF7 gene; cloning; drought stress; post-harvest physiological deterioration（PPD）; expression analysis

0 引言

【研究意義】木薯（Manihot esculenta）作為三大薯類作物之一，在熱帶及亞熱帶地區(qū)廣泛種植，具有較強的抗旱性和耐貧瘠性，是全世界約7億人口的主食，同時是生產(chǎn)酒精等產(chǎn)品的重要工業(yè)原料（Oliveira et al.，2014;張鵬等，2014;Hu et al.，2016;韋祖生等，2017;胡廣和梁大成，2019）。研究發(fā)現(xiàn)，植物為適應生長過程中的生物逆境脅迫和非生物逆境脅迫，已進化出許多抵御機制（Bartels and Sunkar，2005;Ohama et al.，2017），其中，熱休克反應是植物體內非常重要的一種抵御機制，而作為調節(jié)熱休克反應中的關鍵蛋白——熱激轉錄因子（Heat shock transcription factor，HSF）通過轉錄水平調控不同抗逆基因表達，可提高植物在高溫、干旱和氧化損傷等逆境中的適應能力（Guo et al.，2016;Jiang et al.，2017;Li et al.，2018;Zhou et al.，2018）?？梢?，HSF在植物應對非生物逆境脅迫中發(fā)揮重要作用。此外，由于木薯塊根易氧化發(fā)生采后生理性變質（Post-harvest physiological deterioration，PPD），難以儲藏，極大限制其加工利用（馬秋香等，2009;Salcedo and Siritunga，2011;張振文和李開綿，2012）。因此，克隆木薯HSF基因并進行表達分析，對深入研究其在木薯PPD過程和抗非生物脅迫中的調控機制具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】HSF是植物中的重要轉錄因子，含有DNA結合功能域（DNA bingding domain，DBD）、寡聚化功能域（Oligomerization domain，OD）和核定位信號（Nuc-lear localization signal，NLS）等（Guo et al.，2016）。大量研究表明，HSF能顯著提高植物應對非生物脅迫的能力（Guo et al.，2016;Ohama et al.，2017;Albihlal et al.，2018）。水稻過表達TaHSFA4a基因能提高植株在高濃度重金屬環(huán)境中的耐受性（Shim et al.，2009）;番茄過表達SlHsfA1基因能提高植株的耐熱性（Scharf et al.，2012）;擬南芥過表達不同HSF基因可提高植株對不同逆境的耐受性（Ohama et al.，2017;Albihlal et al.，2018），其中，過表達HSFA2基因可提高植株對高鹽、滲透脅迫和高氧化環(huán)境的耐受性（Miller and Mittler，2006），而過表達HSFA6a和HSFA6b基因可提高植株對高鹽和低溫的耐受性（Banti et al.，2010）;玉米過表達ZmHSF04基因可提高植株對高鹽脅迫的耐受性（Jiang et al.，2017）;在擬南芥中過表達百合HsfA3s基因可改變擬南芥植株中脯氨酸的代謝水平以提高植株對高鹽脅迫的耐受性（Wu et al.，2018）?？梢姡琀SF在不同植物中具有不同的抗逆能力，特別是參與干旱脅迫響應過程（Wei et al.，2018，Yu et al.，2019）?！颈狙芯壳腥朦c】目前，有關木薯HSF基因克隆并探究其在植株干旱脅迫響應及塊根PPD中的表達水平研究鮮見報道?！緮M解決的關鍵問題】通過同源克隆方法從木薯葉片克隆HSF基因MeHSF7，對其生物信息學和組織表達特性進行分析，并明確其在干旱和脫落酸（ABA）處理下及PPD過程中的表達模式，為研究MeHSF7基因在響應非生物脅迫及PPD過程中的調控機制提供參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試木薯品種為SC124，由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術研究所提供。植物RNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司;反轉錄試劑盒購自Fermentas公司。PCR引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 材料處理 將木薯莖稈切成長度約15 cm的小節(jié)（包含3～4個芽點），將其種植于蛭石和營養(yǎng)土比例為1∶1的基質中。待生長約60 d后，選取生長狀況一致的木薯幼苗用于后續(xù)試驗。干旱處理：采用20% PEG-6000對木薯幼苗進行干旱模擬處理，以正常澆灌水的植株為對照，分別在處理0、3、5和7 d后采集木薯葉片樣品，經(jīng)液氮速凍后置于超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。ABA處理：用100 μmol/L ABA澆灌木薯幼苗，以正常澆灌水的植株為對照，分別在處理0、3、5和7 d后采集木薯葉片，經(jīng)液氮速凍后置于超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩PD處理：取生育期10個月的木薯塊根，將其中間部分切成5 mm左右的薄片，置于25 ℃、70%相對濕度的培養(yǎng)箱內進行暗培養(yǎng)，分別在0、6、12和48 h時取樣，經(jīng)液氮速凍后置于超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。每個樣品設3次生物學重復。

1. 2. 2 基因克隆 以水稻OsHSFA5基因（登錄號Os02g29340）編碼蛋白氨基酸序列為參考，在Phytozome數(shù)據(jù)庫中進行BLASTp比對，搜索到木薯同源序列（Manes.02G087400.1）;再以此為參考序列，使用Primer 5.0設計引物（F：5'-ATGGATGGTTCACAAG GTAGTAGT-3';R：5'-TCATACTCTTTCAGCCGGT GCAAGG-3'）。使用RNA提取試劑盒提取木薯葉片RNA，利用反轉錄試劑盒反轉錄合成cDNA。以木薯葉片cDNA為模板進行PCR擴增。反應體系20.0 μL： 2×Taq MasterMix 10.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，cDNA 1.0 μL，ddH2O補足至20.0 μL。擴增程序：94 ℃預變性5 min; 94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，共進行35個循環(huán); 72 ℃延伸5 min。擴增產(chǎn)物連接至pMD18-T載體，轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，并挑選陽性單克隆送至深圳華大基因科技有限公司測序。

1. 2. 3 生物信息學分析 在NCBI數(shù)據(jù)庫中以MeHSF7蛋白氨基酸序列為參考序列進行BLASTp比對，搜索出其他物種同源序列。利用Plant-mPLoc對MeHSF7蛋白進行亞細胞定位;使用NCBI數(shù)據(jù)庫CDD預測其保守結構域;運用ExPASy ProtParam預測其理化性質;采用TMPRED對其跨膜結構域進行預測;利用SWISS-MODEL對其三級結構進行預測。最后，利用DNAMAN對MeHSF7蛋白與其同源蛋白進行氨基酸序列多重比對，并以MEGA 7.0中的鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構建其系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1. 2. 4 基因組織表達分析 為分析MeHSF7基因在木薯不同組織中的表達情況，從Bart Lab Cassava Atlas數(shù)據(jù)庫（shiny.danforthcenter.org/cassava_atlas/）中下載得到未經(jīng)任何處理下10個木薯組織的表達數(shù)據(jù)（Wilson et al.，2017），分別是葉（Leaf）、中脈（Midvein）、葉柄（Petiole）、莖（Stem）、側芽（Lateral bud）、塊根（Storage root，SR）、須根（Fibrous root，F(xiàn)R）、根頂端分生組織（Root apical meristem，RAM）、分化胚組織（Organized embryogenic structure，OES）和松散性胚性愈傷組織（Friable embryogenic calli，F(xiàn)EC）?；虮磉_量用FPKM（Fragments per kilobase per million mapped reads）表示。

1. 2. 5 基因表達分析 使用RNA提取試劑盒提取上述樣品RNA，構建RNA文庫，并送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測序（測序平臺為Illumina GAII）。然后，使用FASTX-toolkit和FastQC移除接頭序列和低質量序列，利用Tophat 2.0將Clean reads與木薯基因組參考序列進行比對，比對結果使用Cu-fflinks進行組裝從而獲得轉錄組數(shù)據(jù)?；虮磉_量以FPKM表示。

2 結果與分析

2. 1 MeHSF7基因克隆結果

由圖1-A可知，PCR擴增獲得的基因片段約1200 bp，與預期結果相符。測序結果（圖2）顯示，克隆獲得的基因片段開放閱讀框（ORF）為1206 bp，編碼401個氨基酸殘基，與參考序列（Manes.02G087 400.1）僅存在2個堿基差異，其中一個為非同義突變，表明該片段即為目的基因MeHSF7。將MeHSF7基因與木薯基因組序列進行比對，結果發(fā)現(xiàn)MeHSF7基因位于第2染色體上，含有1個內含子和2個外顯子（圖1-B）。生物信息學分析結果顯示，MeHSF7蛋白的分子式C2025H3134N566O635S15，理論分子量46.1 kD，理論等電點（pI）5.95，不穩(wěn)定系數(shù)61.29，為不穩(wěn)定蛋白，定位于細胞核，無跨膜區(qū)域（圖3），含有HSF家族保守結構域（圖4），進一步證明克隆得到的基因片段為MeHSF7基因。采用SWISS-MODEL對MeHSF7蛋白進行同源建模，其三級結構如圖5所示。

2. 2 MeHSF7蛋白同源性比對及進化分析結果

在NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索獲得的MeHSF7蛋白同源序列中，同源性最高的是橡膠樹（XP_021678492.1）和麻瘋樹（XP_012070195.1）HSF蛋白，分別為79.20%和64.95%。從中挑選與MeHSF7蛋白同源性較高（47.31%～79.20%）的HSF蛋白序列進行多重序列比對分析，結果（圖6）顯示均含有HSF蛋白家族的保守結構域，且在N端第8～121位氨基酸殘基位置含有高度保守的DBD，在N端第136～185位氨基酸殘基位置含有HR-A Core、插入序列和HR-B Core，表明MeHSF7蛋白屬于HSFA家族;在C端第204～224位氨基酸殘基位置含有NLS。由圖7可知，MeHSF7蛋白和橡膠樹HSF蛋白聚在同一小分支，表明二者氨基酸序列差異較小，親緣關系較近。

2. 3 MeHSF7基因組織表達分析結果

由圖8可知，未經(jīng)任何處理下，MeHSF7基因在木薯不同組織中的相對表達量存在明顯差異，在松散性胚性愈傷組織、分化胚組織、須根和根頂端分生組織中的表達量相對較高，在葉柄中的相對表達量最低。可見，MeHSF7基因具有明顯的組織表達特異性，推測MeHSF7基因在分化程度較低的組織中具有重要的調控功能。

2. 4 MeHSF7基因在不同條件下的表達分析

通過對MeHSF7基因啟始密碼子上游1500 bp的序列進行啟動子元件分析，結果（表1）發(fā)現(xiàn)啟動子區(qū)域含有干旱誘導元件（MBS）、ABA響應元件（ABRE）和光響應元件（ACE和Box 4）等。因此，對MeHSF7基因在ABA和干旱處理下的表達水平進行分析，結果顯示，在干旱處理下，MeHSF7基因表達量隨處理時間的增加整體上呈升高趨勢，在處理7 d后達峰值（圖9-A）;在ABA處理下，處理5和7 d后的MeHSF7基因表達量較處理0和3 d后明顯上調，尤其在處理5 d后達峰值（圖9-B）。故推測木薯MeHSF7基因通過ABA信號通路響應干旱脅迫。

木薯塊根采后1～3 d內易出現(xiàn)PPD現(xiàn)象，對木薯的存儲利用產(chǎn)生嚴重影響。其中，活性氧（Reactive oxygen species，ROS）導致的氧化損傷是木薯采后生理性變質的主要因素之一，而HSF能調控植株響應氧化脅迫。因此，對MeHSF7基因在木薯塊根的PPD過程中的表達水平進行分析，結果（圖10）顯示，MeHSF7基因表達量隨暗培養(yǎng)時間增加而升高，處理6、12和48 h的表達量分別是0 h的2.1、2.2和3.2倍，推測MeHSF7基因通過轉錄水平調控延緩木薯塊根的生理性變質。

3 討論

HSF轉錄因子廣泛存在于植物體內，在響應非生物脅迫過程中發(fā)揮重要調控作用，根據(jù)其結構特征可將HSF基因家族分為HSFA，HSFB和HSFC亞家族（Guo et al.，2016），且不同植物中的HSF家族成員種類和數(shù)量存在明顯差異，如擬南芥有21個（Guo et al.，2008），水稻有25個（Mittal et al.，2009），玉米有25個（Lin et al.，2011），小麥有56個（Xue et al.，2014）。已有研究表明，HSF基因在不同物種不同組織中的表達水平均有所不同，如在擬南芥和向日葵中，HSF9基因在種子中特異性表達，而在水稻中HSF基因在所有組織均有表達（Almoguera et al.，2002;Scharf et al.，2012），HSFA2基因在番茄花粉中的表達水平比其他花組織高（Guo et al.，2016）。目前，有關木薯基因組中HSF基因家族成員數(shù)量及其克隆研究尚無報道。本研究克隆獲得的MeHSF7基因cDNA全長為1206 bp，編碼401個氨基酸殘基，其編碼蛋白序列含有HSF蛋白的保守結構域DBD、HR-A Core和HR-B Core，屬于HSFA亞家族（Scharf et al.，2012）。MeHSF7基因在不同木薯組織中的表達水平存在明顯差異，在分化程度較低的組織（松散性胚性愈傷組織和分化胚組織）和根相關組織（須根和根頂端分生組織）中表達量較高，在葉柄中的表達水平最低，故推測該基因在木薯塊根中發(fā)揮作用，間接證實HSF基因的生物學功能具有多樣性。

由于植物是固定生長在一個地方，不能像動物一樣遷徙，所以其必須適應突然變化的環(huán)境。在此適應過程中，HSF是植物應對非生物脅迫重要的調節(jié)因子，低溫、高鹽、干旱及植物激素（ABA、水楊酸和乙烯）等均可調控HSF基因表達（Guo et al.，2016;Ohama et al.，2017）。在擬南芥中過表達AtHSFA2、AtHSFA8和AtHsfA9基因可分別提高植株應對高鹽、滲透脅迫和干旱脅迫下的耐受性（Guo et al.，2008）;水稻過表達OsHSF17和OsHSF29基因能提高植株對高鹽和高滲透脅迫的耐受性（Jin et al.，2013）。此外，HSF可調控植物應對氧化脅迫的能力。如水稻中OsHsfC2a和OsHsfA5蛋白可感知ROS的存在及積累含量變化，當ROS增加時會誘導其基因表達（Miller et al.，2008;Mittal et al.，2009）;擬南芥中過表達HsfA1b基因能直接提高植株中抗壞血酸過氧化物酶基因APX1和APX2的表達量（Albihlal et al.，2018）;在煙草植株中過表達胡楊PeHSF基因可調節(jié)葉片中的ROS平衡（Shen et al.，2013）。本研究結果與上述的研究結果基本一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，MeHSF7基因啟動子序列含有干旱誘導元件（MBS）和ABA響應元件（ABRE）等，在干旱和ABA處理下，MeHSF7基因的表達水平整體上呈上升趨勢，推測木薯MeHSF7基因通過ABA信號通路響應干旱脅迫，以提高植株的耐干旱能力，但具體是哪些基因參與MeHSF7介導的分子調控機制尚不清楚。此外，MeHSF7基因在木薯PPD過程中的表達量也明顯升高，說明該基因響應木薯塊根的生理性變質，但具體響應機制尚未明確。因此，今后應深入研究MeHSF7基因在木薯抗旱和延緩生理性變質中的調控機制。

4 結論

MeHSF7基因可能在轉錄水平通過依賴于ABA信號通路的途徑來響應干旱脅迫及木薯塊根的氧化脅迫，可作為候選基因用于研究其在木薯抗逆和采后儲存中的調控功能。

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（責任編輯 陳 燕）