羅惠娜 樊全寶 江文康 趙明明 王靜靜 羅冬章 王丙云

摘要：【目的】建立奶牛脂肪間充質干細胞（AD-MSCs）體外分離培養(yǎng)體系，并進行增殖能力檢測、分化能力鑒定及生物學特性研究，為推廣AD-MSCs在畜牧生產及其疾病治療等方面的應用提供理論依據?！痉椒ā客ㄟ^I型膠原酶消化法分離奶牛AD-MSCs并進行代傳培養(yǎng)，繪制P3、P6和P9代奶牛AD-MSCs的生長曲線及測定其群體倍增時間，分別采用流式細胞術及RT-PCR檢測細胞表面標志物;使用干細胞成骨/成脂誘導分化完全培養(yǎng)基進行奶牛AD-MSCs成骨成脂誘導分化，經茜素紅和油紅O染色后鑒定其成骨成脂分化能力;并檢測凍存奶牛AD-MSCs復蘇后的存活率?！窘Y果】分離及傳代培養(yǎng)獲得的奶牛AD-MSCs在體外培養(yǎng)條件下呈長梭形，折光性強，生長狀態(tài)良好，其生長曲線呈典型的S形，符合Logistic生長規(guī)律。奶牛AD-MSCs高表達MSCs表面標志物CD44、CD73、CD90和CD105，但不表達白細胞表面標志物CD45;分別使用干細胞成骨/成脂誘導分化完全培養(yǎng)基誘導的奶牛AD-MSCs經茜素紅和油紅O染色后，顯微鏡下可觀察到大量的鈣結節(jié)和紅色脂肪滴。凍存6個月后進行細胞復蘇，奶牛AD-MSCs的存活率高達96%;復蘇奶牛AD-MSCs培養(yǎng)4 h內貼壁，呈典型的長梭形，生長狀態(tài)良好，培養(yǎng)72 h細胞融合達80%～90%?！窘Y論】通過I型膠原酶消化法從奶牛腹部脂肪組織分離獲得的奶牛AD-MSCs具有良好的體外增殖能力及多向分化潛能，為畜牧生產研究及奶牛疾病治療提供了一種良好的種子細胞來源。

關鍵詞： 奶牛;脂肪;間充質干細胞（MSCs）;生物學特性;體外增殖能力;分化潛能

Abstract：【Objective】This study aimed to establish in vitro culture system for dairy cow adipose-derived mesenchymal stem cells（AD-MSCs） and conduct proliferation ability detection， differentiation ability identification and the biological characteristics of these cells， provide a theoretical basis for promoting the application of AD-MSCs in animal husban-dry production and disease treatment. 【Method】Collagenase type I digestion method was applied to separate dairy cow AD-MSCs and then sub-cultured in vitro，and then plotted the growth curves，determined its population doubling time of P3， P6 and P9 generation of AD-MSCs. Membrane markers of the cells were identified by flow cytometric analysis and RT-PCR. The ability of osteogenic/adipogenic differentiation was detected by alizarin red stainingand oil red O， then livability of AD-MSCs in cryopreserved cow milk after resuscitation. 【Result】The results revealed that the cultured dairy cow AD-MSCs presented typical long spindle shape， strong refractivity and fine growth status. The growth curve showed a typical S shape， which was in line with the law of Logistic growth curve. The MSCs surface markers CD44， CD73， CD90 and CD105 were highly expressed， while white blood cell surface marker CD45 was rarely detected. After being stained with alizarin red and oil red O using stem cell osteogenic/adipogenic differentiation-inducing complete media， a large number of calcium nodules and red fat droplets were observed under the microscope. After 6 months of cryopreservation， the cells were recovered and the cell survival rate was as high as 96%. The recovered AD-MSCs adhered to the wall after 4 h of culture and showed a typical long spindle shape with good growth status. The AD-MSCs were confluent by 80%-90% after 72 h of culture. 【Conclusion】The AD-MSCs of cows isolated from the abdomen adipose tissue of cows by type I collagenase digestion method have good in vitro proliferation ability and multi-directional differentiation potential， which provides a good seed cell source for animal husbandry production research and cow disease treatment.

Key words： dairy cow;adipose;mesenchymal stem cells（MSCs）;biological characteristics; in vitro proliferation ability; differentiation potential

0 引言

【研究意義】間充質干細胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）是一種理想的組織工程種子細胞，具有自我更新及分化為脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞及其他胚層細胞的潛能（Samsonraj et al.，2017;劉超等，2019），在多種組織損傷修復與再生方面發(fā)揮著重要作用（Cosenza et al.，2017;Gao et al.，2017;Wang et al.，2017;Zheng et al.，2017;Radwan and Mohamed，2018），是目前應用最廣泛的成體干細胞之一。此外，MSCs在體外易于培養(yǎng)，擴增迅速，可分化為多種類型的細胞。因此，加強MSCs生物學特性研究具有重要的臨床應用及科學研究意義。【前人研究進展】骨髓和脂肪組織是MSCs的主要來源，其中來源于脂肪組織的MSCs（AD-MSCs）具有來源豐富、易獲得、增殖能力強等特點（Wilson et al.，2019）。近年來，MSCs一直是干細胞研究的熱點，有關MSCs的體外培養(yǎng)體系、分化潛能、生物學特性及其應用等已得到深入認識。Palumbo等（2018）研究表明，MSCs可通過細胞間直接接觸和旁分泌多種細胞因子，促進其他細胞的增殖或遷移，加速傷口愈合及其他組織的修復;羅冬章等（2019）研究發(fā)現(xiàn)，與臍帶、羊膜、骨髓來源的MSCs相比，AD-MSCs的體外擴增能力更強，群體倍增時間最短，具有更高的臨床應用價值。此外，已有大量臨床試驗證實，MSCs對自身免疫性疾病及運動系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)等多種疾病有良好的治療效果（Buehrer and Cheatham，2013），也可通過MSCs建立大動物模型用于人類和動物的常見疾病研究，同時在提高家畜繁殖力及改造家畜遺傳性狀等方面均具有重要意義（Hill et al.，2019）。有研究表明，通過回輸經藥物修飾的MSCs可替換或修復受損的奶牛乳腺組織，并且可增強機體的自身免疫以對抗乳房內感染（Peroni and Borjesson，2011;Gao et al.，2014）。在獸醫(yī)臨床學方面，干細胞治療大家畜骨關節(jié)炎的療效已得到初步證實，其機理在于MSCs具有強大的免疫調節(jié)和抗炎作用，能通過細胞間相互作用及多種因子分泌來調節(jié)關節(jié)局部內環(huán)境和活化內源性祖細胞，從而發(fā)揮修復受損軟骨的作用（Glenn and Whartenby，2014）。MSCs還可應用于轉基因動物生產，培育具有抵抗多種疾病的畜群和研制動物生物反應器，促使轉基因動物生產人源α-乳白蛋白等（Donovan et al.，2005;Yang et al.，2011）?！颈狙芯壳腥朦c】奶牛作為重要的畜產品來源動物，在畜牧業(yè)中扮演著重要角色，而MSCs在奶牛遺傳育種、品種改良、抗病研究、奶品質調控、體細胞克隆和轉基因技術等領域具有廣闊的應用前景（Singh et al.，2010;Capuco et al.，2012;H?eussler et al.，2013），但目前國內有關MSCs的研究主要集中在人類及豬（張慶美等，2015）、犬（Endo et al.，2019）等動物上，針對奶牛MSCs的研究相對較少。【擬解決的關鍵問題】以奶牛腹部脂肪中的AD-MSCs為研究對象，通過膠原酶消化法分離奶牛AD-MSCs，并進行增殖能力檢測、分化能力鑒定及生物學特性研究，以期為推廣AD-MSCs在畜牧生產及其疾病治療等方面的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

奶牛脂肪組織由廣東省佛山市南海區(qū)獅山江仔奶牛場提供，取自30日齡荷斯坦小公牛。DMEM/F12基礎培養(yǎng)基、青鏈霉素雙抗和0.25%胰蛋白酶購自美國HyClone公司，胎牛血清（FBS）購自以色列Biologi-cal Industries（BI）公司，0.1% I型膠原酶購自Sigma公司，干細胞成脂誘導分化完全培養(yǎng)基和干細胞成骨誘導分化完全培養(yǎng)基購自Cyagen公司，RNA提取試劑盒和反轉錄試劑盒購自TaKaRa公司，CD90、CD45、CD105和CD44抗體購自Abcam公司。主要儀器設備有超凈工作臺（蘇州蘇凈儀器自控設備有限公司）、超速低溫離心機（美國Beckman公司）、PCR儀（Thermofisher公司）及流式細胞儀（美國BD公司）。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 I型膠原酶消化法分離奶牛AD-MSCs及傳代培養(yǎng) 手術采集奶牛腹部脂肪組織，置于裝有10%青鏈霉素雙抗的組織保護液中，低溫運回實驗室，75%酒精噴灑離心管后轉入超凈臺，后續(xù)操作均在無菌條件下進行?；蝿与x心管以清洗脂肪組織表面的血細胞2～3次，以含10%青鏈霉素雙抗的PBS浸泡5 min后轉移至100 mm的培養(yǎng)皿中，無菌手術剪將組織剪碎成1 mm3，轉移至15 mL離心管中，0.1%（1 mg/mL）I型膠原酶37 ℃下消化2～3 h，直至肉眼無明顯可見組織塊。組織塊與膠原酶體積比1∶3。經100目細胞篩過濾后1000 r/min離心5 min，棄上清液;以完全培養(yǎng)基重懸，調整細胞密度至1×107 Cells/mL，轉移至60 mm培養(yǎng)皿，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)體系含DMEM/F12基礎培養(yǎng)基、10% FBS、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素，置于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)48 h后，首次半量更換培養(yǎng)基除去大部分血細胞，以后每3 d更換一次培養(yǎng)液。倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及生長情況，此時為P0代奶牛AD-MSCs。待細胞達80%～90%融合時，棄培養(yǎng)液，PBS清洗，經胰酶消化后進行傳代培養(yǎng)，此時培養(yǎng)的細胞為P1代奶牛AD-MSCs，以此類推，依次進行消化傳代培養(yǎng)。

1. 2. 2 細胞生長曲線制作及群體倍增時間測定 分別取處于對數(shù)生長期的P2、P5和P8代奶牛AD-MSCs，按5×104 Cells/mL的密度接種于24孔板中，每孔0.5 mL，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，隨后每天隨機消化3孔細胞，按細胞—臺盼藍體積分數(shù)比1∶1混勻，Counstar細胞計數(shù)儀進行計數(shù)。持續(xù)8 d，取平均值，繪制P3、P6和P9代奶牛AD-MSCs的生長曲線。

根據對數(shù)增殖期計算群體倍增時間，Patterson公式為DT=t×[lg2/（lgNt-lgNo）]。式中，t為培養(yǎng)時間，No為首次記錄的細胞數(shù)，Nt為培養(yǎng) t 時間后的細胞數(shù)。采用SPSS 17.0進行統(tǒng)計分析，組間比較以單因素方差分析（One-way ANOVA）進行檢驗。

1. 2. 3 表面標志物鑒定 采用流式細胞儀鑒定奶牛AD-MSCs表面標志物CD44、CD45、CD90和CD105的表達情況。消化P3代奶牛AD-MSCs，制成單細胞懸液，調整細胞密度至2×105 Cells/mL，并轉移至1.5 mL的EP管中，1000 r/min離心5 min，棄上清液，PBS清洗細胞，重復離心，連續(xù)洗滌2次;分別加入CD44-FITC、CD45-FITC、CD90-PE和CD105-FITC一抗稀釋液50 μL，常溫孵育30 min后以PBS清洗細胞，離心棄上清液，加入50 μL PBS，采用流式細胞術進行測定。

1. 2. 4 總RNA提取、cDNA合成及PCR檢測 引物設計如表1，采用常規(guī)PCR檢測CD90、CD44、CD73、CD105和CD45等表面標志物的相關基因。取P5代奶牛AD-MSCs，以RNA提取試劑盒提取總RNA，分光光度計檢測RNA濃度后反轉錄合成cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆?。以cDNA為模板進行PCR擴增，擴增程序：95 ℃預變性5 min;94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 10 min，進行30個循環(huán);72 ℃延伸5 min，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物。

1. 2. 5 成骨誘導分化 取生長狀態(tài)良好的P3代奶牛AD-MSCs，0.25%胰酶消化后，調整細胞密度至1×105 Cells/mL，接種于24孔板中，每孔0.5 mL。試驗分為對照組和誘導組，每組3個重復。置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，棄原培養(yǎng)上清液，PBS清洗2遍，試驗組加入干細胞成骨誘導分化完全培養(yǎng)基（含F(xiàn)BS、青鏈霉素雙抗、谷氨酰胺、抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉和地塞米松），對照組加入含10% FBS的DMEM完全培養(yǎng)基。每3 d更換一次培養(yǎng)液，直至誘導組出現(xiàn)鈣結節(jié)。40 g/L多聚甲醛固定30 min，茜素紅染液染色10 min，PBS清洗后顯微鏡下觀察并拍照記錄。

1. 2. 6 成脂誘導分化 取生長狀態(tài)良好的P3代奶牛AD-MSCs，0.25%胰酶消化后，調整細胞密度至1×105 Cells/mL，接種于24孔板中，每孔0.5 mL。試驗分為對照組和誘導組，每組3個重復。置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，棄原培養(yǎng)上清液，PBS清洗2遍，試驗組加入干細胞成脂誘導分化完全培養(yǎng)基A液（含F(xiàn)BS、青鏈霉素雙抗、谷氨酰胺、胰島素、IBMX、羅格列酮和地塞米松），對照組加入含10% FBS的DMEM完全培養(yǎng)基。誘導3 d后吸走24孔板中的A液，加入0.5 mL干細胞成脂誘導分化完全培養(yǎng)基B液，24 h后吸走B液，換回A液繼續(xù)進行誘導。A液和B液交替作用3～5次，繼續(xù)用B液維持培養(yǎng)4～7 d直至脂滴變大變圓。誘導分化完成后，40 g/L多聚甲醛固定30 min，油紅O染色10 min，PBS清洗后顯微鏡下觀察并拍照記錄。

1. 2. 7 奶牛AD-MSCs凍存及存活率檢測 凍存體系：凍存液為60% FBS+30% DMEM基礎培養(yǎng)基+10% DMSO。取經形態(tài)學和細胞免疫表型鑒定的P3代奶牛AD-MSCs，常規(guī)方法收集對數(shù)生長期的貼壁細胞，置于離心管中，1000 r/min離心5 min。棄上清液，收集沉淀，根據細胞數(shù)量加入凍存液，調整細胞終濃度為1×106～1×107 Cells/mL，分裝至2 mL凍存管中，每管1.0 mL。置于程序降溫盒中，-80 ℃保存過夜，第2 d放入-196 ℃液氮保存。細胞復蘇：6個月后復蘇凍存細胞，37 ℃水浴鍋中快速溶解，離心后棄上清液，加入適量完全培養(yǎng)基并轉移至5 mL離心管中，取50 μL細胞懸液與0.4%臺盼藍按1∶1混合，細胞計數(shù)，死細胞被臺盼藍染成藍色，活細胞則無色，統(tǒng)計細胞存活率，重復3次。細胞存活率（%）=活細胞/總細胞數(shù)×100。

2 結果與分析

2. 1 奶牛AD-MSCs形態(tài)學觀察結果

經0.1% I型膠原酶消化得到的原代細胞（P0代奶牛AD-MSCs），培養(yǎng)24 h時其表面覆蓋大量懸浮圓形的脂肪細胞和少許紅細胞，培養(yǎng)液表面呈油狀;培養(yǎng)至48 h時，通過半數(shù)更換培養(yǎng)基除去大多數(shù)雜質細胞，此時細胞的貼壁狀態(tài)如圖1-A;原代培養(yǎng)至第4 d，細胞大量貼壁，形態(tài)呈典型的長梭形，折光性強（圖1-B）;培養(yǎng)至第8 d，細胞融合達80%～90%（圖1-C），即可傳代;傳代培養(yǎng)至P2代即可得到純化細胞，傳代細胞出現(xiàn)均勻分布的紡錘形，呈典型的漩渦狀生長（圖1-D和圖1-E）;傳代培養(yǎng)至P8代后，細胞融合的時間較前面代次變長，細胞形態(tài)較不規(guī)整，折光性開始下降（圖1-F），提示細胞開始出現(xiàn)老化。

2. 2 奶牛AD-MSCs的生長曲線及其群體倍增時間

繪制P3、P6和P9代奶牛AD-MSCs的生長曲線，結果發(fā)現(xiàn)各生長曲線均呈典型的S形（圖2），分別經歷潛伏期、對數(shù)生長期和平臺期。不同代次細胞的增殖趨勢差異不明顯，均存在2 d的潛伏期，從第3 d開始進入對數(shù)生長期，第7 d開始呈緩慢增長，生長曲線逐漸趨于平緩。如圖3所示，隨著奶牛AD-MSCs代次的增加，細胞群體倍增時間也逐漸增加，P3代奶牛AD-MSCs的群體倍增時間為21.73±0.56 h，P6代奶牛AD-MSCs的群體倍增時間為23.41±0.77 h，P9代奶牛AD-MSCs的群體倍增時間為28.65±1.30 h，其中，P9代奶牛AD-MSCs的群體倍增時間極顯著長于P3和P6代奶牛AD-MSCs，說明隨著細胞代次的增加，其增殖能力減弱。

2. 3 奶牛AD-MSCs表面標志物鑒定結果

為確認分離獲得的細胞即為奶牛AD-MSCs，對其進行表面標志物鑒定。流式細胞儀分析結果如圖4所示，其中，紅色曲線為未加入一抗的奶牛AD-MSCs細胞對照組，綠色曲線為檢測樣本。P3代奶牛AD-MSCs高表達MSCs表面標志物CD44、CD90和CD105，但不表達白細胞表面標志物CD45，即分離培養(yǎng)獲得的細胞符合AD-MSCs特性及鑒定標準。

2. 4 RT-PCR鑒定結果

根據奶牛CD105、CD90、CD73、CD44及CD45基因序列分別設計5對特異性引物，對P5代奶牛AD-MSCs進行RT-PCR擴增，結果顯示分離培養(yǎng)獲得的奶牛AD-MSCs表達CD105、CD90、CD73和CD44等MSCs特異性基因，但不表達CD45基因（圖5），符合MSCs的特性及鑒定標準。

2. 5 奶牛AD-MSCs的成骨成脂誘導鑒定結果

經干細胞成骨誘導分化完全培養(yǎng)基誘導5 d后，奶牛AD-MSCs的細胞形態(tài)發(fā)生變化，其體積變大，鋪滿培養(yǎng)皿。至誘導第7 d，細胞堆積連接成片，呈鱗片狀（圖6-A）;誘導第10 d出現(xiàn)鈣結節(jié)，以茜素紅進行礦化結節(jié)染色，顯微鏡觀察視野中可見大面積紅色致密結節(jié)（圖6-B）。經干細胞成脂誘導分化完全培養(yǎng)基誘導14 d后，大部分奶牛AD-MSCs的細胞形態(tài)呈卵圓形（圖6-C），胞質內出現(xiàn)許多大小不一的脂質顆粒，且脂肪滴隨誘導時間的延長逐漸變大，脂肪滴可被油紅O染成紅色（圖6-D）。

2. 6 奶牛AD-MSCs的凍存復蘇培養(yǎng)結果

復蘇液氮凍存6個月的奶牛AD-MSCs，經臺盼藍染色計數(shù)顯示細胞存活率可達96%。復蘇的奶牛AD-MSCs培養(yǎng)4 h內貼壁，呈典型的長梭形（圖7），形態(tài)單一，折光性強，生長狀態(tài)良好;培養(yǎng)72 h細胞融合達80%～90%。凍存前后奶牛AD-MSCs的細胞形態(tài)及生長狀態(tài)無明顯差異。

3 討論

從脂肪組織提取細胞是當前干細胞研究領域的熱點，自2001年Zuk等在吸脂術抽取的脂肪中發(fā)現(xiàn)脂肪干細胞以來，AD-MSCs的研究逐漸深入。AD-MSCs的分離、培養(yǎng)及凍存等技術也越來越完善，其分離方法包括組織塊貼壁法、酶消化法和機械分離法等（Buehrer and Cheatham，2013;羅冬章等，2019）。目前，有關動物AD-MSCs的研究主要集中在鼠、兔和豬等物種上，針對奶牛等大型家畜AD-MSCs的報道較少。王帥帥等（2019）采用胰蛋白酶消化法從3～4月齡初生犢牛腎周脂肪組織中分離獲得脂肪干細胞，并證實體外維持數(shù)代培養(yǎng)后細胞仍保持良好生長狀態(tài)。本研究采集奶牛腹部脂肪組織，使用I型膠原酶消化法分離培養(yǎng)獲得AD-MSCs。相對于胰蛋白酶，膠原酶較溫和，不受培養(yǎng)基中Ca2+、Mg2+及血清的抑制，且易于撐控濃度、溫度和時間，消化時不易對細胞造成損傷。本研究分離及傳代培養(yǎng)獲得的奶牛AD-MSCs呈長梭形，其生長曲線呈典型S形，符合Logistic生長曲線規(guī)律。

MSCs是一個異質細胞群，至今尚未發(fā)現(xiàn)特異性標志物，其鑒定方法主要是通過結合多方面因素進行綜合判定，有關AD-MSCs的表面標志物也尚無明確定論。2013年，國際脂肪應用技術協(xié)會（IFATS）宣布經體外培養(yǎng)的AD-MSCs表型為CD31?/CD44+/CD45?/CD73+/CD90+/CD105+（Bourin et al.，2013）。本研究采用流式細胞術檢測P4代奶牛AD-MSCs的表面標志物CD44、CD45、CD90和CD105，并通過RT-PCR測定CD44、CD73、CD90和CD105基因的表達情況，結果顯示，奶牛AD-MSCs高表達CD44、CD73、CD90和CD105特異性基因，但不表達CD45基因，與IFATS公布的結果一致。同時結合相差顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，奶牛AD-MSCs呈長梭形、漩渦狀盤旋排列，類似成纖維類細胞形態(tài)特征，因此可判定分離培養(yǎng)獲得的細胞即為奶牛AD-MSCs。

已有研究證實，多種動物的MSCs均可在體外誘導分化脂肪細胞、成骨細胞、軟骨細胞及神經細胞等（Vidal et al.，2012;羅冬章等，2019;Endo et al.，2019）。張慶美等（2015）使用地塞米松、吲哚美辛、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤等試劑成功誘導豬骨髓MSCs向脂肪細胞分化;朱雪敏等（2015）以吲哚美辛為主要的誘導試劑，體外誘導南陽牛骨髓MSCs 3～4 d后即可在顯微鏡下觀察到脂肪細胞小脂滴，同時使用β-巰基乙醇等誘導劑成功誘導其向神經細胞分化。本研究分別使用干細胞成骨/成脂誘導分化完全培養(yǎng)基進行奶牛AD-MSCs成骨成脂誘導分化，經茜素紅和油紅O染色后，顯微鏡下分別觀察到大量的鈣結節(jié)和紅色脂肪滴，說明奶牛AD-MSCs具有向脂肪細胞和成骨細胞分化的潛能，為今后的相關研究提供了一種前體種子細胞。

MSCs在體外多次傳代培養(yǎng)后常出現(xiàn)細胞老化、細胞分化及干性丟失等問題（Redondo et al.，2018）。細胞凍存是干細胞基礎研究的重要內容，在體外培養(yǎng)過程中，為避免細胞多次傳代，常在低代次將其凍存，使用時再進行復蘇。AD-MSCs的凍存及復蘇可保證其在生產應用的時效性、安全性及規(guī)模性，有效彌補AD-MSCs無法在體外持續(xù)擴增傳代的劣勢。本研究將P3代奶牛AD-MSCs通過程序降溫盒進行程序降溫，并置于-196 ℃液氮凍存，6個月后進行細胞復蘇，經臺盼藍染色計數(shù)顯示細胞存活率高達96%;復蘇奶牛AD-MSCs培養(yǎng)4 h內貼壁，呈典型的長梭形，形態(tài)單一，折光性強，生長狀態(tài)良好;培養(yǎng)72 h細胞融合達80%～90%。說明采用本研究的凍存方法可較長時間保持奶牛AD-MSCs的細胞活性，有利于其后續(xù)研究及應用。

4 結論

通過I型膠原酶消化法從奶牛腹部脂肪組織分離獲得的奶牛AD-MSCs具有良好的體外增殖能力及多向分化潛能，為畜牧生產研究及奶牛疾病治療提供了一種良好的種子細胞來源。

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（責任編輯 蘭宗寶）