王丹，王悅欣，汪熠，李連保

1昆明醫(yī)科大學(xué)附屬甘美醫(yī)院/昆明市第一人民醫(yī)院生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，昆明 650000

2昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院胃腸外科，昆明 650000

基底細(xì)胞癌又稱基底細(xì)胞上皮瘤，具有較大的破壞性，其發(fā)病與日光照曬有密切關(guān)系，多見(jiàn)于老年人，好發(fā)于面部較突出的部位，目前學(xué)者們普遍認(rèn)為它是來(lái)自表皮多潛能細(xì)胞的腫瘤。鞣花酸是一種多酚二內(nèi)酯，是沒(méi)食子酸的二聚體衍生物，廣泛存在于各種軟果、堅(jiān)果等植物組織中。鞣花酸具有多種生物活性功能，如抗氧化、抗肝毒性、抗脂肪變性、抗膽汁淤積、抗纖維化、抗肝癌和抗病毒，可改善肝臟結(jié)構(gòu)和病理狀態(tài)[1]。鞣花酸通過(guò)核因子紅細(xì)胞2相關(guān)因子2的轉(zhuǎn)錄激活增加抗氧化反應(yīng)，并具有清除多種活性氧物質(zhì)的活性。鞣花酸的應(yīng)用有效地降低了循環(huán)中的脂質(zhì)水平，防止了脂質(zhì)過(guò)氧化[2-3]。段婧和黃衛(wèi)東[4]認(rèn)為鞣花酸具有廣泛的抗腫瘤活性。有研究發(fā)現(xiàn)，鞣花酸可明顯抑制雌激素誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞MCF-7的增殖，并抑制p-胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）1/2的表達(dá)，且呈劑量依賴性[5-6]。另有研究表明，鞣花酸能夠明顯抑制4T1細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，還可明顯提高荷瘤小鼠的特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)[7]。多種植物化學(xué)物質(zhì)已被廣泛用于應(yīng)對(duì)生物系統(tǒng)中的各種氧化應(yīng)激。鞣花酸是廣泛研究的酚類抗氧化劑之一，已用于抵抗由不同化學(xué)物質(zhì)或應(yīng)激物誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激[4-5]。本研究以表皮癌細(xì)胞系A(chǔ)431和皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞HSC-2為研究對(duì)象，觀察鞣花酸對(duì)其增殖、凋亡、侵襲能力的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑及儀器

表皮癌細(xì)胞系A(chǔ)431和皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞HSC-2均購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司。鞣花酸購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，DMEM高糖培養(yǎng)基、青鏈霉素、胎牛血清和胰蛋白酶均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司，噻唑藍(lán)（methylthiazolyldiphenyl- tetrazolium bromide，MTT）試劑、吉姆薩染色試劑盒均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，膜連蛋白Ⅴ（AnnexinⅤ）-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)ThermoFisher Scientific公司，Matrigel膠購(gòu)自美國(guó)Beckman公司。多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，倒置光學(xué)顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司，流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Beckman公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物干預(yù) 使用含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)A431和HSC-2細(xì)胞，使其貼壁生長(zhǎng)，置于37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。本研究選擇10 μg/ml的鞣花酸干預(yù)A431和HSC-2對(duì)數(shù)期細(xì)胞。

1.2.2 MTT 檢測(cè)細(xì)胞增殖 為評(píng)估細(xì)胞增殖情況，將對(duì)數(shù)期細(xì)胞以每孔1×104個(gè)接種于96孔平板中，加入200 μl新鮮培養(yǎng)基和20 μl MTT溶液，然后37 ℃溫育4 h。除去孔中的培養(yǎng)基和MTT溶液，加入二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶液。分別在0、3、6、12、24、48 h時(shí)測(cè)量595 nm處的吸光度（optical density，OD）。抑制率=[1-（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值）（/對(duì)照組OD值-空白組OD值）]×100%。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將單細(xì)胞懸液用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗2次，然后加入1×結(jié)合緩沖液1 ml重懸細(xì)胞。取 100 μl加入到 5 ml的培養(yǎng)管中，加入 5 μl FITC標(biāo)記的AnnexinⅤ和5 μl PI，混勻后室溫下避光孵育15 min，然后再加入400 μl的1×結(jié)合緩沖液。整個(gè)操作過(guò)程動(dòng)作要盡量輕柔，勿用力吹打細(xì)胞。反應(yīng)完畢后盡快在1 h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)，用FL1通道檢測(cè)FITC-AnnexinⅤ熒光，F(xiàn)L2通道檢測(cè)PI熒光。同時(shí)以不加FITC-AnnexinⅤ及PI的樣本管作為陰性對(duì)照。結(jié)果判斷：中晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞的細(xì)胞膜有損傷，PI能夠穿透細(xì)胞膜而使DNA被PI染色產(chǎn)生紅色熒光。而細(xì)胞膜保持完好的早期凋亡細(xì)胞對(duì)PI有抗染性，不會(huì)產(chǎn)生紅色熒光，正?；罴?xì)胞與之相似。在雙變量流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖上，左下象限（FITC-/PI-）顯示活細(xì)胞，右下象限（FITC+/PI-）為早期凋亡細(xì)胞，右上象限（FITC+/PI+）為晚期凋亡細(xì)胞。

1.2.4 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲 將細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸，并在鋪有基底膜基質(zhì)膠的Transwell上室中接種，下室中加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。24 h后，用棉簽刮下上室細(xì)胞，采用4%多聚甲醛固定下室細(xì)胞，用吉姆薩染色試劑染色。將小室翻轉(zhuǎn)后置于倒置顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Graphpad 5.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鞣花酸干預(yù)對(duì)A431和HSC-2細(xì)胞增殖的影響

MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，與干預(yù)前（0 h）比較，鞣花酸干預(yù)6、12、24、48 h后，其對(duì)A431和HSC-2細(xì)胞的抑制率均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。隨著鞣花酸作用時(shí)間的延長(zhǎng)，A431和HSC-2細(xì)胞抑制率均逐漸增加，但當(dāng)作用時(shí)間超過(guò)24 h后，抑制率無(wú)明顯變化。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用24 h為干預(yù)時(shí)間。（表1）

表1 鞣花酸干預(yù)前和干預(yù)后不同時(shí)間點(diǎn)A431和HSC-2細(xì)胞抑制率的比較（%，±s）

表1 鞣花酸干預(yù)前和干預(yù)后不同時(shí)間點(diǎn)A431和HSC-2細(xì)胞抑制率的比較（%，±s）

注：*與同細(xì)胞0 h比較，P＜0.05

細(xì)胞A 4 3 1 H S C-2 0 0 4.0 1±0.5 8*2.3 3±0.3 3 1 1.6 7±0.8 0*7.7 7±0.5 5*2 1.8 0±0.4 2*1 5.6 1±0.5 5*2 8.4 8±0.4 6*2 1.4 7±1.0 2*2 8.6 7±0.8 2*2 0.7 0±0.8 4*0 h 3 h 6 h 1 2 h 2 4 h 4 8 h

2.2 鞣花酸干預(yù)對(duì)A431和HSC-2細(xì)胞凋亡的影響

細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果表明，鞣花酸干預(yù)后A431活細(xì)胞比例為（63.21±4.35）%，明顯低于干預(yù)前的（90.37±2.35）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=41.223，P＜0.01）。鞣花酸干預(yù)后HSC-2活細(xì)胞比例為（79.21±2.32）%，低于干預(yù)前的（85.37±1.55）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=29.557，P＜0.05）。（圖1）

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)鞣花酸干預(yù)前后A431和HSC-2細(xì)胞凋亡

2.3 鞣花酸干預(yù)對(duì)A431和HSC-2細(xì)胞侵襲能力的影響

鞣花酸干預(yù)后A431侵襲細(xì)胞個(gè)數(shù)為（23.26±7.23）/HP，明顯低于干預(yù)前的（58.24±4.23）/HP，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=15.324，P＜0.01）。鞣花酸干預(yù)后HSC-2侵襲細(xì)胞個(gè)數(shù)為（22.56±2.23）/HP，明顯低于干預(yù)前的（48.44±3.13）/HP，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=27.881，P＜0.01）。（圖2）

3 討論

鞣花酸是一種天然酚類抗氧化劑，存在于眾多水果和蔬菜中。鞣花酸是沒(méi)食子酸的二聚體衍生物，很少在飲食作物中自由存在，但通常發(fā)生在與糖苷部分（葡萄糖、木糖）結(jié)合的食品中或形成鞣花單寧的一部分。這些化合物通常出現(xiàn)在水果（如石榴、柿子、覆盆子、黑莓、草莓、桃子）、堅(jiān)果（如核桃、杏仁）、蔬菜和葡萄酒中[8-10]。有研究表明，鞣花酸具有與沒(méi)食子酸、咖啡酸、原兒茶酸、表兒茶素和山奈酚相似的抗氧化活性，但活性高于阿魏酸[11-13]。鞣花酸具有抗增殖和抗氧化特性，是一種非常有前途的治療慢性疾病的藥物，尤其是潰瘍性結(jié)腸炎、阿爾茨海默病和糖尿病[14-17]。鞣花酸的抗糖尿病潛力使其成為傳統(tǒng)降糖藥物的潛在替代品，也是糖尿病藥物研究的有力候選者[18]。鞣花酸也具有保肝和抗癌特性。然而，在應(yīng)用于人類疾病的治療前，需要進(jìn)行詳細(xì)的毒性評(píng)估，驗(yàn)證其安全性和有效性。

圖2 Transwell 小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)鞣花酸干預(yù)前后A431和HSC-2細(xì)胞侵襲能力（吉姆薩染色，×20）

基底細(xì)胞癌是皮膚癌最常見(jiàn)的類型之一，也被稱為基底細(xì)胞上皮瘤、基底細(xì)胞樣細(xì)胞瘤浸潤(rùn)性潰瘍等?；准?xì)胞癌是由未成熟、非間變的類似基底細(xì)胞構(gòu)成的局部破壞性癌。1902年Krompecher將其與其他上皮性腫瘤進(jìn)行了明確的區(qū)分，其特征是發(fā)展緩慢，呈現(xiàn)浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，但血液或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移少，惡性程度低[19-20]。基底細(xì)胞癌多發(fā)生在頭部、面部，開(kāi)始呈現(xiàn)較硬的斑狀丘疹或呈疣狀突起，逐漸形成潰瘍。早期手術(shù)切除是合適的治療方法，骨浸潤(rùn)時(shí)必須輔助全身化療。

本研究的MTT實(shí)驗(yàn)表明，鞣花酸可以抑制A431和HSC-2細(xì)胞增殖，24 h為最佳抑制時(shí)間。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，鞣花酸對(duì)A431和HSC-2細(xì)胞具有促凋亡作用。Transwell小室實(shí)驗(yàn)表明，鞣花酸可以在一定程度上抑制A431和HSC-2細(xì)胞的侵襲能力。

綜上所述，鞣花酸不僅能夠抑制A431和HSC-2細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡，還能夠抑制其侵襲，有望成為治療皮膚基底細(xì)胞癌的新藥物，為臨床治療皮膚基底細(xì)胞癌提供了新思路。