何云華，石紅霞，刁本恕，楊 林△

（1. 四川大學(xué)華西醫(yī)院臨床藥學(xué)部，四川 成都 610041； 2. 四川省成都市第七人民醫(yī)院刁本恕名醫(yī)工作室，四川 成都 610072）

山參飲為四川省名中醫(yī)刁本恕主任醫(yī)師的臨床驗(yàn)方，由山藥、山楂、郁李仁、人參等10 味中藥組方，具有開胃健脾、潤腸通便功效，用于腫瘤放化療、老年病、術(shù)后食欲不振、腸道功能差、消化不良、便秘等。該方臨床使用已有10 余年，療效顯著，安全性好，為方便服用，將其研制成質(zhì)量可控的中藥顆粒劑。質(zhì)量源于設(shè)計(jì)理念是應(yīng)用質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)管理知識(shí)，重點(diǎn)控制產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝，以達(dá)到預(yù)定目標(biāo)的產(chǎn)品研發(fā)過程，其主要途徑是根據(jù)關(guān)鍵質(zhì)量屬性，確定關(guān)鍵工藝參數(shù)，然后采用多種試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法和數(shù)據(jù)分析方法開發(fā)產(chǎn)品生產(chǎn)工藝［1-4］。目前，質(zhì)量源于設(shè)計(jì)理念已應(yīng)用于中藥的干燥［5-6］、包衣［7］等生產(chǎn)過程。本研究中基于質(zhì)量源于設(shè)計(jì)理念，優(yōu)化山參飲提取工藝?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1260 型高效液相色譜儀（包括DAD 檢測器，美國安捷倫科技有限公司）；BT25S 型電子分析天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，精度為十萬分之一）；JA2003 型電子分析天平（上海良平儀器儀表有限公司，精度為千分之一）；YPR -10T 型超純水器（北京英普瑞環(huán)保設(shè)備有限公司）；AS20500T 型超聲波清洗器（天津奧特賽恩斯儀器有限公司，功率為300 W，頻率為40 kHz）。

1.2 試藥

山藥飲片（批號為18060806，四川禾一天然藥業(yè)有限公司）；山楂飲片（批號為180927-8），郁李仁飲片（批號為180528-8），麥芽飲片（批號為180829-8），均購自瀘州百草堂中藥飲片有限公司；人參飲片（批號為180301941），白扁豆飲片（批號為180100032），薏苡仁飲 片（批 號 為 180800871），砂 仁 飲 片（批 號 為180701701），火麻仁飲片（批號為180800781），均購自成都康美藥業(yè)有限公司；生姜飲片（自制）。所有藥材經(jīng)四川大學(xué)華西醫(yī)院楊林副主任藥師鑒定為正品?？嘈尤受諏φ掌罚ㄅ枮?10820 -201506，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為93.4%，中國食品藥品檢定研究院）；乙腈（色譜純，賽默飛世爾科技有限公司）；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 有機(jī)酸含量測定

參照2015年版《中國藥典（一部）》山楂含量測定方法［8］，按處方比例稱取藥材（山藥30 g，山楂12 g，郁李仁10 g，人參3 g，麥芽15 g，白扁豆15 g，火麻仁15 g，薏苡仁30 g，砂仁3 g，生姜3 g）進(jìn)行煎煮，過濾，取濾液適量，置容量瓶中，加純水定容，搖勻，加酚酞指示液2 滴，用氫氧化鈉滴定液（0.1 mol/L）滴定［每l mL 氫氧化鈉滴定液（0.1 mol/L）相當(dāng)于6.404 mg 的枸櫞酸（C6H8O7）］，即得有機(jī)酸含量。

2.2 苦杏仁苷含量測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent extend -C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（12∶88，V/ V）；流速：1.0mL/min；檢測波長：210 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2.2 溶液制備

取苦杏仁苷對照品（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為93.4%）20.02 mg，精密稱定，置25 mL 容量瓶中，加甲醇溶解至刻度，制成質(zhì)量濃度為0.747 947 2 mg/mL 的溶液，即得對照品溶液。按處方比例稱取藥材（山藥30 g，山楂12 g，郁李仁10 g，人參3 g，麥芽15 g，白扁豆15 g，火麻仁15 g，薏苡仁30 g，砂仁3 g，生姜3 g）進(jìn)行煎煮，過濾，取適量濾液，置水浴上蒸干，加甲醇溶解于容量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按處方比例稱取郁李仁以外的其他藥材，按供試品溶液的制備方法制備陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：分別精密吸取2.2.2 項(xiàng)下3 種溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜圖。可見，陰性對照無干擾，表明該方法專屬性良好。詳見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察：精密吸取2.2.2 項(xiàng)下對照品溶液，加甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為74.794 72，149.589 44，299.178 88，448.768 32，598.357 76，747.947 20 μg/mL的對照品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)行測定。以質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=1 324.6X-19.127，r=0.999 1（n=6）。結(jié)果表明，苦杏仁苷質(zhì)量濃度在74.79472 ～747.94720μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取2.2.2 項(xiàng)下的對照品溶液，按擬訂色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄峰面積。結(jié)果苦杏仁苷峰面積的RSD為1.13%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取樣品（批號為180528-8），按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于制備后0，2，4，6，8，12，24 h 時(shí)按擬訂色譜條件測定，各進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積。結(jié)果苦杏仁苷峰面積的RSD為1.56%（n=7），表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（批號為180528-8），按2.2.2項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6 份，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果苦杏仁苷峰面積的RSD為2.52%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取同一批（批號為180528-8）樣品0.2 g，精密稱定，共6 份，精密加入對照品溶液4 mL（質(zhì)量濃度為1.850 067 2 mg/mL），按2.2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果苦杏仁苷的平均回收率為99.61%，RSD為1.60% （n=6）。

2.3 吸水率計(jì)算

吸水率（%） =（處方飲片浸泡后質(zhì)量-處方飲片浸泡前質(zhì)量）/處方飲片浸泡前質(zhì)量×100%

2.4 浸膏得率測定

參照2015年版《中國藥典（四部）》浸出物測定法項(xiàng)下方法，精密吸取各試驗(yàn)項(xiàng)下濾液25 mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，于105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定質(zhì)量，計(jì)算供試品中水溶性浸出物含量和浸膏得率。

2.5 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)本研究指標(biāo)有機(jī)酸、苦杏仁苷的含量和浸膏得率在處方中的地位，設(shè)定滿分為100 分，其權(quán)重系數(shù)分別為苦杏仁苷含量50，有機(jī)酸含量30，浸膏得率20，進(jìn)行綜合評分［9］。綜合評分=（苦杏仁苷含量/最大值） ×50+ （有機(jī)酸含量/最大值） ×30+ （浸膏得率/最大值） ×20。

2.6 影響因素分析

中藥提取過程中會(huì)受到多種因素影響，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)研究，結(jié)合生產(chǎn)環(huán)境，將山參飲提取過程的影響因素歸結(jié)為5 個(gè)方面，將其細(xì)化分類繪成魚骨圖（見圖2）。其中，環(huán)境、飲片、設(shè)備和溶劑為客觀因素，故本試驗(yàn)對工藝參數(shù)進(jìn)行考察［10］。

圖2 山參飲提取工藝魚骨圖

2.7 單因素考察

浸泡時(shí)間：以吸水率為指標(biāo)考察。按處方比例稱取飲片100 g，分別置同一規(guī)格燒杯中，加10 倍量水，浸泡30，60，90，120，150，180 min，按2.3 項(xiàng)下公式計(jì)算飲片的吸水率。結(jié)果見圖3 A?？梢?，90 min 前吸水率呈上升趨勢，超過90 min 后趨于平穩(wěn)，故選浸泡時(shí)間為60 min和90 min。

加水量：以有機(jī)酸、苦杏仁苷的含量和浸膏得率為指標(biāo)考察。按處方比例稱取飲片100 g，置燒杯中，分別加水8，10，12，14 倍，浸泡90 min，提取2 次，每次60 min，依法測定有機(jī)酸含量，測定苦杏仁苷含量及浸膏得率。結(jié)果見圖3 B?？梢?，加8 ～12 倍水時(shí)，各指標(biāo)呈上升趨勢，超過12 倍水后趨于平穩(wěn)，故選加水量為12 倍和8 倍。

圖3 提取影響因素考察結(jié)果

提取時(shí)間：以有機(jī)酸、苦杏仁苷的含量和浸膏得率為指標(biāo)考察。按處方比例稱取飲片100 g，置燒杯中，加水12 倍，浸泡90 min，分別提取30，60，90，120 min，提取2 次，依法測定有機(jī)酸含量、苦杏仁苷含量及浸膏得率。結(jié)果見圖3 C?？梢?，提取時(shí)間為30 ～90 min 時(shí)，各指標(biāo)呈上升趨勢，超過90 min 后下降，故選提取時(shí)間為90 min 和30 min。

提取次數(shù)：以有機(jī)酸、苦杏仁苷的含量和浸膏得率為指標(biāo)考察。按處方比例稱取飲片100 g，置燒杯中，加水12 倍，浸泡90 min，提取90 min，分別提取1，2，3 次，依法測定有機(jī)酸含量、苦杏仁苷含量及浸膏得率。結(jié)果見圖3 D?？梢姡崛〈螖?shù)為1 ～3 次時(shí)，各指標(biāo)呈上升趨勢，故選提取次數(shù)為3 次和1 次。

提取溫度：提取方法為煎煮提取法，根據(jù)生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)，提取溫度為100 ℃和90 ℃進(jìn)行試驗(yàn)。

2.8 Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選關(guān)鍵工藝參數(shù)

試驗(yàn)設(shè)計(jì)：采用Plackett -Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，根據(jù)檢測指標(biāo)篩選顯著影響的因素［11］。以有機(jī)酸的含量、苦杏仁苷的含量和浸膏得率為指標(biāo)，以浸泡時(shí)間（因素A）、加水量（因素B）、提取時(shí)間（因素C）、提取次數(shù)（因素D）、提取溫度（因素E）為影響因素。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇各影響因素水平，采用Plackett-Burman 設(shè)計(jì)篩選關(guān)鍵工藝參數(shù)，因素水平見表1。本試驗(yàn)中采用綜合評分作為響應(yīng)值，采用Mintab 16.0 軟件進(jìn)行分析。

表1 Plackett-Burman 試驗(yàn)因素水平表

試驗(yàn)結(jié)果：試驗(yàn)見表2 和表3。由表3 可見，因素B，C，D 有顯著影響，因素A，E 無顯著影響，故篩選加水量、提取時(shí)間和提取次數(shù)為關(guān)鍵工藝參數(shù)。浸泡時(shí)間根據(jù)單因素篩選結(jié)果選浸泡90 min；根據(jù)生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)，提取加熱方式采用先武火后文火。

表2 Plackett-Burman 試驗(yàn)結(jié)果

表3 Plackett-Burman 試驗(yàn)方差分析結(jié)果

2.9 Box-Behnken 優(yōu)化提取工藝

根據(jù)Plackett-Burman 試驗(yàn)結(jié)果，采用Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)［12-14］，以綜合評分為響應(yīng)值［15-18］，優(yōu)化山參飲提取工藝。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表4。

表4 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

采用Mintab 16.0 軟件，對Box-Behnken 試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面分析，由響應(yīng)面分析得回歸方程Y=98.43-2.29B-0.038C-2.16D-0.58BC+1.28BD-3.52CD-4.89B2-13.21C2-11.66D2，P＜0.01 表明模型擬合度較好。結(jié)果見表5，響應(yīng)面3D 圖見圖4。可見，優(yōu)選的最佳工藝為加9.96 倍量水，提取62.47 min，提取2.14 次。依據(jù)實(shí)際生產(chǎn)情況，修正提取參數(shù)為加10 倍量水，提取60 min，提取2 次。

2.10 驗(yàn)證試驗(yàn)

通過以上試驗(yàn)及數(shù)據(jù)分析，得到山參飲最佳提取工藝條件為加10 倍量水，提取60 min，提取2 次。結(jié)合實(shí)際操作，將優(yōu)化后的工藝參數(shù)修正為加水量、提取時(shí)間、提取次數(shù)，重復(fù)試驗(yàn)3 次。結(jié)果有機(jī)酸含量分別為45.52，44.78，45.36 mg/g，平均值為45.22 mg/g；苦杏仁苷含量分別為23.87，23.96，23.51 mg/g，平均值為23.7 mg/g；浸 膏 得 率 分 別 為27.09% ，27.15% ，26.86%，平均值為27.03%。與理論預(yù)測值相比，相對誤差小于1.0%。表明該方法所建立的數(shù)學(xué)模型具有良好的預(yù)測性，優(yōu)化工藝條件重復(fù)性好。

圖4 Box-Behnken 試驗(yàn)響應(yīng)面3D 圖

表5 Box-Behnken 試驗(yàn)方差分析結(jié)果

3 討論

采用魚骨圖列出各因素，篩選主要影響因素，再進(jìn)行單因素影響試驗(yàn)，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果確定各影響因素試驗(yàn)水平，采用Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選顯著影響因素，對顯著影響因素采用Box -Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行優(yōu)化。最終得到最優(yōu)提取工藝為加10 倍量水，浸泡90 min，提取2 次，每次60 min，先武火后文火。通過驗(yàn)證，該工藝穩(wěn)定、可靠。

質(zhì)量源于設(shè)計(jì)作為一種先進(jìn)的國際制劑研究理念，能完成藥品質(zhì)量從檢驗(yàn)出來到設(shè)計(jì)出來的策略要求，采用一系列科學(xué)推理和分析方法，達(dá)到藥品質(zhì)量批間一致性高的目的。本研究中基于質(zhì)量源于設(shè)計(jì)理念優(yōu)化山參飲提取工藝，可推廣到實(shí)際生產(chǎn)中，提高提取產(chǎn)物質(zhì)量的穩(wěn)定性，保證制劑質(zhì)量穩(wěn)定、可控。