梁紅云　王英　董明盛

摘要：采用高效液相色譜法測定黑莓汁和黑莓果酒中有機(jī)酸含量。采用美國Agilent SB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）為分析柱；流動(dòng)相：0.5%（NH4）2HPO4-H3PO4緩沖液（磷酸調(diào)pH值為2.0）；溫度：30 ℃；流速：1.0 mL/min；檢測波長：214 nm；進(jìn)樣量：20 μL。建立了檢測黑莓果酒中主要的6種有機(jī)酸（酒石酸、L-蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、D-蘋果酸）的高效液相色譜方法。該方法的回收率為98.56%；RSD（相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差）為0.21%。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜法；黑莓汁；黑莓果酒；有機(jī)酸

中圖分類號(hào)： O657.7+2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2016）07-0327-03

黑莓（blackberry）屬于薔薇科（Rosaceae）懸鉤子屬小灌木Rubus laciniata的果實(shí)，是一種具有較強(qiáng)抗氧化能力的小漿果，美國農(nóng)業(yè)部評(píng)價(jià)結(jié)果顯示黑莓的抗氧化能力居第二位[1]。黑莓除含有糖、多種有機(jī)酸、膳食纖維、維生素和礦物質(zhì)外，還含有大量的多酚、花青素、鞣花酸等具有抗氧化功能的成分[2-4]。我國黑莓的主栽品種有Hull、Chester、Boysen等，江蘇、東北、貴州等地是我國主要的黑莓種植地區(qū)，總種植面積約1萬hm2，全國黑莓年總產(chǎn)量約20萬t。黑莓果實(shí)柔嫩多汁，營養(yǎng)豐富，富含鋅、硒等多種礦物質(zhì)，氨基酸種類齊全，且花色苷和總酚含量較高，被譽(yù)為第三代“黃金水果”，所含有的多酚類化合物在體內(nèi)發(fā)揮抗氧化作用，可以降低心臟病、癌癥和其他慢性病的發(fā)生率[3-4]。

糖和有機(jī)酸是食品中重要的風(fēng)味成分。Türemi

瘙 塂 等研究了9種黑莓的糖酸比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)黑莓最高的糖酸比（可溶性固形物含量/總酸）為9.6[5]。Wrolstad等采用氣相色譜檢測美國和英國多種黑莓中的有機(jī)酸，包括蘋果酸、檸檬酸、莽草酸、異檸檬酸、奎寧酸和磷酸等，其中異檸檬酸是所有黑莓中含量最高的有機(jī)酸[6]。Kafkas等檢測了土耳其黑莓中的有機(jī)酸含量，在所研究的5種黑莓中，蘋果酸是含量最高的酸，而檸檬酸的含量均為零[7]。糖和酸的比例（糖酸比）常被用來判斷果實(shí)是否成熟和消費(fèi)者的接受程度。如果是鮮食的品種，一定要保持適當(dāng)?shù)奶撬岜?。隨著成熟度的增加，黑莓中可溶性固形物的含量增加，有機(jī)酸的含量減少。

植物體內(nèi)有機(jī)酸含量分析是近幾年來研究的熱點(diǎn)，尤其是在逆境生理方面。果實(shí)中有機(jī)酸種類與含量也是衡量果實(shí)品質(zhì)的重要指標(biāo)。目前測定有機(jī)酸的方法通常包括氣相色譜法、高效液相色譜法和離子色譜法，其中氣相色譜法（GC）測定有機(jī)酸時(shí)，常常因?yàn)樗岬姆悬c(diǎn)較高、不易氣化而需要先對(duì)其衍生再進(jìn)行測定，方法比較繁瑣；離子色譜法（HPIC）是近來應(yīng)用較多的測定植物體內(nèi)有機(jī)酸的方法[8-9]，可以同時(shí)測定溶液中的有機(jī)酸根離子和無機(jī)陰離子，如NO-3、Cl-、PO43-等，并且樣品前處理簡單[10-12]，但大量無機(jī)陰離子的存在通常增加了低含量有機(jī)酸的檢測難度；與之相比較，高效液相色譜法（HPLC）測定有機(jī)酸的方法比GC法簡單[13-14]，但也存在pH值、流動(dòng)相的選擇等方面的問題，尤其是在測定幾種以上的有機(jī)酸時(shí)更為明顯。

對(duì)于黑莓果酒而言，同時(shí)檢測多種有機(jī)酸是必須的，因?yàn)橛袡C(jī)酸的組成和比例更直接地影響著黑莓果酒風(fēng)味的優(yōu)雅和諧，但由于黑莓果酒組分復(fù)雜，乙醇、色素、多酚以及糖等組分都可能對(duì)有機(jī)酸的檢測造成干擾，因此，有必要建立一種穩(wěn)定的、適于黑莓果酒多種有機(jī)酸分析的快速方法。

1 材料與方法

1.1 材料

黑莓果酒：江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所釀造的黑莓果酒，黑莓品種為寶森，采自南京溧水地區(qū)。

1.2 儀器與試劑

儀器：PHS-3C型pH值計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；Waters 2695-2998高效液相色譜儀（美國Waters公司），配有DAD檢測器、色譜柱恒溫箱和自動(dòng)進(jìn)樣器；有機(jī)相針式過濾器。

試劑：酒石酸、L-蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、D-蘋果酸（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；超純水（電阻率為18.2 MΩ/cm2）；活性干酵母（湖北安琪酵母股份有限公司）。

1.3 有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)液的配制

分別稱取酒石酸、L-蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、D-蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)品50.0 mg，用去離子水定容至10 mL，配制成5 g/L標(biāo)準(zhǔn)液，為有機(jī)酸的混合標(biāo)準(zhǔn)樣母液；臨用時(shí)稀釋為7個(gè)濃度梯度溶液。根據(jù)樣品中有機(jī)酸含量分別稀釋，經(jīng)0.22 μm濾頭過濾進(jìn)樣。以進(jìn)樣量（g/L）為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 樣品的制備方法

1.4.1 黑莓汁的制備 黑莓→打漿→果膠酶酶解（45 ℃，4.5 h）→離心。

1.4.2 黑莓果酒的發(fā)酵 黑莓→打漿→果膠酶酶解（45 ℃，4.5 h）→調(diào)糖→接酵母菌（4%的蔗糖活化）→25 ℃發(fā)酵→黑莓果酒。

1.4.3 樣液的制備 吸取5 mL黑莓汁和黑莓果酒，分別經(jīng)11 000 r/min離心10 min，0.22 μm濾頭過濾，待HPLC定量分析。

1.5 色譜條件

色譜柱：美國Agilent SB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相：0.5%（NH4）2HPO4-H3PO4緩沖液（磷酸調(diào)pH值為2.0），使用前用0.45 μm濾膜過濾；流速：1.0 mL/min；檢測波長：214 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的建立

分別吸取一定質(zhì)量濃度的有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后進(jìn)樣。以進(jìn)樣量（g/L）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線見表1。從圖1可以看出色譜工作穩(wěn)定，重現(xiàn)性良好。

2.2 流動(dòng)相的選擇

采用高效液相色譜法測定有機(jī)酸的研究很多，但是試驗(yàn)中所用的流動(dòng)相種類及pH值有很大差別。常用的流動(dòng)相有0.5%（NH4）2HPO4-H3PO4緩沖液（pH值2.5）[13-18]、甲醇 ∶ 15 mmol/L KH2PO4緩沖液（pH值2.1）=15 ∶ 85（體積比）[14]、0.6% KH2PO4（pH值2.65）[19]、4 mmol/L硫酸水溶液[20]等。通過對(duì)上述各流動(dòng)相檢測有機(jī)酸效果的比較，最終采用0.5%（NH4）2HPO4-H3PO4緩沖液（pH值 2.0）為流動(dòng)相。

2.3 HPLC定量分析

試驗(yàn)選取不同濃度酒石酸、L-蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、D-蘋果酸6種有機(jī)酸制作混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，檢測黑莓汁及黑莓果酒樣品中的有機(jī)酸，結(jié)果（圖1）表明，圖中有8個(gè)主要的峰，其中峰1是溶劑峰，峰8是單寧，峰2、3、4、5、6、7分別是酒石酸、L-蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、D-蘋果酸。

2.4 精密度試驗(yàn)

取6種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品的混合溶液10 mL，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后連續(xù)進(jìn)樣6次，分別計(jì)算有機(jī)酸峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），其平均RSD為0.18%（n=6）。表明該儀器靈敏度高，可用于黑莓汁和黑莓果酒中有機(jī)酸的檢測。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

精確吸取一定量的黑莓汁和黑莓果酒樣品各6份，經(jīng)離心、0.22 μm濾膜過濾后進(jìn)樣分析，分別計(jì)算有機(jī)酸峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，得到平均RSD為0.12%（n=6），表明該檢測方法重現(xiàn)性良好。

2.6 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

采用加樣回收法，精確吸取一定量的黑莓汁和黑莓果酒樣品各5份，分別加入一定濃度的有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)離心、0.22 μm 濾膜過濾后進(jìn)樣檢測，記錄色譜圖，根據(jù)峰面積計(jì)算回收率，結(jié)果見表2，其中有機(jī)酸平均回收率為98.56%，平均RSD為0.21%（n=5）。可見此方法的準(zhǔn)確度和精密度均良好，可應(yīng)用于黑莓汁和黑莓果酒中有機(jī)酸含量的檢測。

3 討論

HPLC法測定黑莓汁和黑莓果酒中的有機(jī)酸含量時(shí)，由于各種有機(jī)酸的洗脫速度相似，導(dǎo)致出峰時(shí)間相近，間隔較小，試驗(yàn)過程中通過調(diào)整流動(dòng)相組成及配比達(dá)到了相對(duì)較好的分離效果。通過調(diào)整，（NH4）2HPO4-H3PO4緩沖液的濃度為0.5%、pH值為2.0的流動(dòng)相，可達(dá)到較為理想的分離效果。

4 結(jié)論

采用色譜柱：美國Agilent SB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相：0.5%（NH4）2HPO4-H3PO4緩沖液（磷酸調(diào)pH值為2.0），使用前用0.45 μm濾膜過濾；流速：1.0 mL/min；紫外檢測波長：214 nm；進(jìn)樣量：20 μL。通過該方法，黑莓汁和黑莓果酒中含有的6種主要有機(jī)酸得到分離并定量，其平均回收率為 98.56%，平均RSD為0.21%。結(jié)果顯示，該方法操作簡單，準(zhǔn)確度高，無雜質(zhì)干擾，黑莓汁和黑莓果酒樣品無需經(jīng)過復(fù)雜的前處理，即可達(dá)到較好的分離效果。

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