于紅紅，唐 飛，喻旭梅，俞 琦，李 芳，許 滔，田維毅

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽(yáng) 550002)

動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是以血管壁產(chǎn)生粥樣斑塊、動(dòng)脈管壁內(nèi)膜增厚等為其主要特征，是諸多心腦血管疾病的基本病理基礎(chǔ)[1]。四妙勇安湯載于《驗(yàn)方新編》，由金銀花、玄參、當(dāng)歸、甘草組成，具有清熱解毒、活血通脈的功效。藥理研究發(fā)現(xiàn)，四妙勇安湯具有抗炎、抗氧化、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、降脂等作用[2-5]。研究資料顯示，細(xì)胞自噬與AS密切相關(guān)，參與并調(diào)控著AS發(fā)生發(fā)展的進(jìn)程[6]。適度的自噬能起到抑制AS形成和進(jìn)展的作用[7]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建新西蘭兔AS模型，觀察四妙勇安湯對(duì)其血脂指標(biāo)和自噬相關(guān)因子中Atg5、Beclin1、mTOR mRNA表達(dá)的影響，探討其抗AS的部分調(diào)控機(jī)制，為四妙勇安湯防治AS積累相關(guān)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康新西蘭兔36只，雄性，8周齡，體重(2.5±0.3)kg，購(gòu)自長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(湘) 2014-0011，購(gòu)自飼養(yǎng)于相對(duì)溫度(23±2)℃，相對(duì)濕度(50±10)%的環(huán)境中，飼養(yǎng)管理均嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的要求及規(guī)則。

1.2 藥物與試劑

四妙勇安湯按《驗(yàn)方新編》原方配伍比例(金銀花90 g、玄參90 g、當(dāng)歸60 g、甘草30 g)組方，購(gòu)自北京同仁堂貴陽(yáng)店，并經(jīng)生藥實(shí)驗(yàn)室專家鑒定為正品。按照常規(guī)方法煎煮制備水煎液[8]，4℃保存，每次制備后一周內(nèi)使用?？偰懝檀?TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)測(cè)定試劑盒(四川邁新生物技術(shù)有限公司)；Trizol(美國(guó) Invitrogen公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Taq酶(Takara公司)；蘇木素染色液(北京索萊寶科技有限公司)；辛伐他汀片(浙江海正藥業(yè)股份有限公司)；PCR反應(yīng)引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 制備家兔AS模型

適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開(kāi)始造模。新西蘭兔30只給予含脂肪2l%、膽固醇0.15%的“西方類型膳食”照射滅菌高脂飼料；6只新西蘭兔給予照射滅菌的普通飼料喂養(yǎng)。分別喂養(yǎng)12周。

1.4 動(dòng)物分組及干預(yù)方法

普通飼料喂養(yǎng)的新西蘭兔為正常對(duì)照組，將AS模型家兔隨機(jī)分成模型組、四妙勇安湯小、中、大劑量組(9 g/kg/d、18 g/kg/d、36 g/kg/d)和辛伐他汀組(3 mg/ kg/d)，每組6只，造模12周后灌胃給藥6周，每日1次。空白組和模型組給予等體積生理鹽水灌胃。

1.5 血脂檢測(cè)

于末次給藥后禁食不禁水12 h，次晨將其麻醉后取血約5 mL，室溫靜置30 min后，3 000 r/min離心15 min，分離并收集血清。按TG、TC、LDL-C、HDL-C的生化試劑盒說(shuō)明書(shū)，使用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)各組的TG、TC、LDL-C、HDL-C含量。

1.6 HE染色觀察斑塊情況

小心取出已麻醉取血過(guò)的新西蘭兔主動(dòng)脈，將主動(dòng)脈周圍的脂肪組織和結(jié)締組織剝離干凈，并剪取部分主動(dòng)脈根部，進(jìn)行常規(guī)石蠟和OCT包埋，HE染色觀察斑塊情況。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Atg5、Beclin1、mTOR mRNA的表達(dá)

取兔主動(dòng)脈勻漿組織，應(yīng)用Trizol提取總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)各目的基因，采用2-△△Ct方法對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析計(jì)算其表達(dá)量。PCR反應(yīng)擴(kuò)增條件為：95℃變性4 min；95 ℃ 30 s，循環(huán)1次；95 ℃ 5 s，55 ℃ 10 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。以GAPDH為內(nèi)參。引物序列：Atg5上游：5′-ATGACAG ATGACAAAGATGTG-3′，下游：5′-TGTGCCTTCATATTCAAACC-3′；Beclin1 上游：5′-CCGCAAGATAGTGGCAGAA-3′，下游：5′-CGACCCAGCCTGAAGTTAT -3′；mTOR 上游：5′-CTGGGACTCAAATGTGTGCAGTTC- 3′，下游：5′-GAACAA TAGGGTGAATGATCCGGG-3′；GAPDH上游：5′-AGGTCGGTGTGAACGGAT TTG-3′，下游：5′-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3′。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 HE染色觀察斑塊情況

光學(xué)顯微鏡下HE染色可見(jiàn)：正常對(duì)照組主動(dòng)脈內(nèi)膜光滑，管壁厚度均勻，泡沫細(xì)胞和斑塊的形成均不明顯；與正常對(duì)照組相比，模型組主動(dòng)脈斑塊面積增大，主動(dòng)脈血管壁增厚且厚薄不一，可見(jiàn)泡沫細(xì)胞形成的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊；與模型組相比，四妙勇安湯各劑量組及辛伐他汀組家兔主動(dòng)脈血管泡沫化程度減輕，斑塊面積明顯減少。

2.2 對(duì)AS兔血脂的影響

與正常對(duì)照組相比，模型組家兔血清中TG、TC、LDL-C水平顯著升高，HDL-C水平顯著降低(P<0.01)。與模型組相比，四妙勇安湯各劑量組和辛伐他汀組均能下調(diào)TG、TC、LDL-C水平，上調(diào)HDL-C水平(P<0.05或P<0.01)。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 四妙勇安湯對(duì) AS兔血脂水平的影響

2.3 對(duì)AS兔自噬因子Atg5、Beclin1和mTOR mRNA表達(dá)的影響

與正常對(duì)照組相比，模型組主動(dòng)脈中 Atg5、Beclin1 mRNA表達(dá)均顯著上升，mTOR mRNA的表達(dá)顯著下降(P<0.01)。與模型組相比，四妙勇安湯各劑量組及辛伐他汀組干預(yù)后主動(dòng)脈Atg5及Beclin1 mRNA表達(dá)水平上調(diào)，而mTOR mRNA的表達(dá)受到明顯抑制(P<0.05或P<0.01)。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 四妙勇安湯對(duì)Atg5、Beclin1和mTOR mRNA表達(dá)的影響

3 討論

細(xì)胞自噬是受多種基因調(diào)控的細(xì)胞主動(dòng)性“自食”過(guò)程，不僅維持細(xì)胞分化、能量穩(wěn)態(tài)，還在器官發(fā)育、炎癥及免疫調(diào)節(jié)方面發(fā)揮著重要的作用[9]。資料顯示，在AS發(fā)生發(fā)展的不同階段均存在自噬活性改變，基礎(chǔ)水平的自噬對(duì)AS具有保護(hù)作用，能抑制AS的發(fā)展進(jìn)程。Atg5是參與調(diào)控自噬的重要基因，在自噬調(diào)控中扮演重要角色，其表達(dá)強(qiáng)度與自噬活性成正相關(guān)[10]。Beclin1是酵母自噬基因Atg6在哺乳細(xì)胞中的同源蛋白，參與自噬體的形成，其表達(dá)強(qiáng)度與自噬活性緊密相關(guān)[11]。mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在轉(zhuǎn)錄和自噬體形成水平誘導(dǎo)自噬，在自噬的調(diào)控過(guò)程中扮演著負(fù)性調(diào)控的角色[12]。

在本實(shí)驗(yàn)中，血脂檢測(cè)結(jié)果顯示四妙勇安湯各劑量及辛伐他汀組均能下調(diào)TG、TC、LDL-C水平，升高HDL-C水平；PCR結(jié)果顯示四妙勇安湯各劑量及辛伐他汀組均能誘導(dǎo)Atg5 mRNA和Beclin1 mRNA的表達(dá)，抑制mTOR mRNA的表達(dá)，且部分干預(yù)作用呈現(xiàn)出劑量依賴性。四妙勇安湯可誘導(dǎo)AS家兔自噬相關(guān)基因Atg5、Beclin1的表達(dá)，抑制mTOR的表達(dá)，這可能是該方抗AS作用的重要機(jī)制之一。