蔡煒龍 余勝 汪偉民 樓能

膽囊癌是膽道系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤，近年來其發(fā)病率呈現(xiàn)升高趨勢[1]。膽囊癌早期癥狀不明顯，易與消化道疾病混淆而被忽略，但其進(jìn)展較快，極易發(fā)生局部浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，因此發(fā)現(xiàn)時(shí)多處于中晚期，患者已失去手術(shù)治療的機(jī)會。且膽囊癌對放化療不敏感，因此預(yù)后極差，患者5年生存率低于5%[2-4]，因此亟待尋找膽囊癌早期診斷的靶標(biāo)。細(xì)胞命運(yùn)決定子NUMB是一種定位于細(xì)胞基底層的內(nèi)吞調(diào)配蛋白，參與細(xì)胞表面蛋白等的內(nèi)吞轉(zhuǎn)運(yùn)過程[5]。研究表明NUMB參與多種腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transitions，EMT）過程，如結(jié)腸癌、卵巢癌等[6-7]，而NUMB對膽囊癌細(xì)胞的作用目前尚鮮見報(bào)道。因此本研究擬通過觀察NUMB對膽囊癌NOZ和GBC-SD細(xì)胞增殖和遷移的作用，從而探討其作為膽囊癌早期診斷靶標(biāo)的可能性。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 細(xì)胞：人膽囊癌細(xì)胞NOZ和GBC-SD細(xì)胞由上海市膽道疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。主要試劑：NUMB抗體和兔二抗購自武漢Abclonal有限公司；鏈霉素-青霉素雙抗、達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)液（DMEM）、選擇性改良伊格爾培養(yǎng)液（Opti-MEM）、FBS、CCK-8試劑盒、多聚甲醛、結(jié)晶紫、BCA蛋白濃度測定試劑盒等購自上海翊圣有限公司。脂質(zhì)體2000（Lipofectamine2000）購自美國Invitroen公司。si-NUMB和si-NC由上海拓然生物科技有限公司合成。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) NOZ細(xì)胞用含10% FBS和1%的鏈霉素、青霉素的Williams培養(yǎng)基培養(yǎng)，GBC-SD細(xì)胞用含10% FBS和1%的鏈霉素、青霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，均放入5% CO2培養(yǎng)箱中37℃恒溫培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 分組與轉(zhuǎn)染 將培養(yǎng)后的人膽囊癌細(xì)胞NOZ和GBC-SD細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組（si-NUMB組）和對照組（CTRL組），其中 si-NUMB組細(xì)胞轉(zhuǎn)染 si-NUMB，CTRL組細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-NC。將NOZ和GBC-SD細(xì)胞鋪于6孔板內(nèi)，待細(xì)胞生長至50%左右時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染過程按照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行，即將50 nmol siRNA和6 μl Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑加入200 μl Opti-MEM培養(yǎng)基中孵育15 min，加入到6孔板內(nèi)，用Opti-MEM補(bǔ)足2 ml。轉(zhuǎn)染6 h后，用無抗生素的完全培養(yǎng)基進(jìn)行換液。待48 h后收集膽囊癌細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 細(xì)胞增殖能力檢測 采用CCK-8法。將轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞常規(guī)消化、離心、重懸后計(jì)數(shù)，將細(xì)胞接種于96孔板中，每孔2×103個(gè)細(xì)胞，每組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，放入5% CO2培養(yǎng)箱中 37 ℃恒溫培養(yǎng)。分別于 0、1、2、3、4、5 d加入20% CCK-8，37℃避光培養(yǎng)2 h后，使用酶標(biāo)儀檢測450 nm處的吸光度（OD）值來表示細(xì)胞增殖能力，并繪制細(xì)胞生長曲線。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.5 細(xì)胞遷移能力檢測 采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)。將轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞進(jìn)行消化、離心后，進(jìn)行計(jì)數(shù)。在Transwell小室上室內(nèi)加入200 μl含2×105個(gè)細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基，下室加入500 μl 10%的完全培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱內(nèi)恒溫培養(yǎng)。48 h后，將Tranwell小室取出，吸走小室內(nèi)培養(yǎng)基，加入500 μl多聚甲醛室溫固定0.5 h，隨后加入500 μl結(jié)晶紫染色0.5 h。用清水洗凈結(jié)晶紫，并用棉簽拭凈水分并晾干，在顯微鏡下對未遷移的膽囊癌細(xì)胞進(jìn)行拍照計(jì)數(shù)。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.6 細(xì)胞內(nèi)NUMB及EMT關(guān)鍵蛋白表達(dá)檢測 采用Western blot法，檢測兩組細(xì)胞內(nèi)NUMB表達(dá)水平及EMT進(jìn)程中的關(guān)鍵蛋白[鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子1（Snail-1）、E-鈣黏蛋白（N-cadherin）及 N-鈣黏蛋白（E-cadherin）]的表達(dá)水平。將轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞總蛋白提取。采用BCA試劑盒檢測蛋白濃度，并用蛋白上樣緩沖液對細(xì)胞總蛋白進(jìn)行煮沸變性。進(jìn)行聚丙烯酰氨凝膠電泳，隨后轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后用5%的脫脂牛奶常溫封閉1 h以去除非特異性結(jié)合。隨后一抗4℃孵育過夜，第2天進(jìn)行二抗常溫孵育0.5 h。然后用化學(xué)發(fā)光儀對蛋白表達(dá)情況進(jìn)行顯影、曝光，并采用Image J軟件量化Western blot條帶灰度值。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用±s表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組細(xì)胞增殖能力比較 NOZ細(xì)胞：與CTRL組比較，si-NUMB組的OD值在第2、3、4、5天時(shí)均明顯為高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；GBC-SD細(xì)胞：與CTRL組比較，si-NUMB組的OD值在第3、4、5天時(shí)均明顯為高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見圖1。

2.2 兩組細(xì)胞遷移能力的比較 與CTRL組比較，si-NUMB組NOZ和GBC-SD細(xì)胞的遷移細(xì)胞數(shù)量均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見圖2（插頁）和表1。

2.3 兩組細(xì)胞NUMB及EMT關(guān)鍵蛋白表達(dá)水平的比較 所有蛋白表達(dá)水平比較以GAPDH作為參考。與CTRL組相比，si-NUMB組NOZ和 GBC-SD細(xì)胞中NUMB、E-cadherin蛋白表達(dá)水平均明顯為低，而Snail-1、N-cadherin蛋白表達(dá)水平均明顯為高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。見表 2、圖 3。

3 討論

圖1 兩組細(xì)胞吸光度（OD）值的比較

表1 兩組細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)（個(gè)）

圖2 兩組細(xì)胞結(jié)晶紫染色所見

膽囊癌是膽道系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，極易發(fā)生轉(zhuǎn)移，惡性程度很高。然而目前對膽囊癌的基礎(chǔ)研究較為薄弱，因此尋找膽囊癌早期診斷和治療的靶標(biāo)顯得尤為重要。NUMB廣泛參與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[8]，且其是發(fā)現(xiàn)的首個(gè)在生物體內(nèi)多種組織器官中廣泛存在的且能夠調(diào)控不對稱細(xì)胞分裂的基因，可以參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)吞、遷移、黏附、增殖和腫瘤形成等過程[9-10]?，F(xiàn)在越來越多的研究關(guān)注到NUMB的異常表達(dá)對腫瘤發(fā)生、發(fā)展的作用，且有研究表明NUMB基因在不同腫瘤中的作用并不相同[11-14]。Hu等[11]通過對241對乳腺癌樣本進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)在乳腺癌組織中NUMB表達(dá)明顯減少，且NUMB的表達(dá)降低與乳腺癌的不良預(yù)后有關(guān)，提示在乳腺癌中NUMB具有抑制腫瘤生長的作用。Flores等[12]發(fā)現(xiàn)在膀胱癌中NUMB表達(dá)明顯降低，其可能通過細(xì)胞凋亡因子p53、細(xì)胞周期素D1和Ras相關(guān)C3肉毒素底1、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-2、MMP-9的表達(dá)抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移能力。Liang等[13]發(fā)現(xiàn)NUMB可以通過p-21活化酶1（PAK1）/β-連環(huán)蛋白信號通路抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖、侵襲和EMT過程。然而，Siddique等[14]發(fā)現(xiàn)在肝癌組織中NUMB基因明顯高表達(dá)，且與肝癌的預(yù)后明顯相關(guān)，提示NUMB能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞的生長。這些研究均表明NUMB可能作為惡性腫瘤的生物標(biāo)志物。

本研究主要關(guān)注于NUMB基因?qū)δ懩野┘?xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移能力的影響。本研究團(tuán)隊(duì)?wèi)?yīng)用RNA干擾技術(shù)在膽囊癌NOZ和GBC-SD細(xì)胞中敲低NUMB的表達(dá)。并通過CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測NUMB對NOZ和GBC-SD細(xì)胞增殖能力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比，敲低NUMB后膽囊癌NOZ和GBC-SD細(xì)胞的增殖能力明顯升高。通過Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測NUMB對NOZ和GBC-SD細(xì)胞遷移能力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比，敲低NUMB后膽囊癌NOZ和GBC-SD細(xì)胞的遷移能力明顯升高。綜上，表明NUMB可能通過影響膽囊癌細(xì)胞的增殖和遷移能力從而抑制膽囊癌的發(fā)生、發(fā)展。

EMT與腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲有關(guān)，是腫瘤進(jìn)展的關(guān)鍵因素，通常表現(xiàn)為上皮細(xì)胞標(biāo)志物（如E-cadherin和細(xì)胞角蛋白）的丟失和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物（如波形蛋白、N-cadherin和纖維連接蛋白）的增加[15-16]。本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)NUMB能夠抑制膽囊癌細(xì)胞的遷移能力，同時(shí)筆者通過Western blot實(shí)驗(yàn)檢測其EMT相關(guān)蛋白分子的變化，發(fā)現(xiàn)敲低NUMB后膽囊癌NOZ和GBC-SD細(xì)胞中Snail-1和N-cadherin表達(dá)明顯升高，E-cadherin表達(dá)明顯減少，說明沉默NUMB蛋白的表達(dá)可以誘導(dǎo)EMT的發(fā)生，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。這些結(jié)果均表明NUMB參與了膽囊癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過程。

表2 兩組細(xì)胞NUMB及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白表達(dá)水平的比較

圖3 兩組細(xì)胞NUMB及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白表達(dá)電泳圖（Snail-1為鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子1；E-cadherin為E-鈣黏蛋白；N-cadherin為N-鈣黏蛋白）

綜上所述，敲低NUMB的表達(dá)可以明顯的增加膽囊癌NOZ和GBC-SD細(xì)胞的增殖和遷移能力，并可以改變EMT相關(guān)蛋白分子的表達(dá)。因此，筆者推測NUMB可能作為膽囊癌治療的分子靶點(diǎn)，但是其調(diào)控膽囊癌細(xì)胞增殖、遷移能力的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。