李曉娟,李興杰,馮 帆,孫慧偉,柴燕濤,高 蓉,李 潤,李瑞生*

(1.中國人民解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心,臨床研究管理中心,北京 100039； 2.中國人民解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心,臨床檢驗(yàn)診療中心,北京 100039； 3.解放軍醫(yī)學(xué)院,北京 100853)

原發(fā)性肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是臨床上常見的惡性腫瘤之一[1],肝癌在全球的死亡率僅次于肺癌和胃癌,位居第三[2-3]。 由于肝癌的危害性逐步上升,全球?qū)Ω伟┑念A(yù)防與治療投入了大量的基礎(chǔ)性研究,旨在能夠?yàn)楦伟┑呐R床治療提供基礎(chǔ)依據(jù),其中建立肝癌動物模型是肝癌臨床與基礎(chǔ)研究工作中必不可少的工具[4]。 由于實(shí)驗(yàn)動物的選擇有多種,而小鼠作為又經(jīng)濟(jì)又易操作的實(shí)驗(yàn)動物,常常作為肝癌模型的首選實(shí)驗(yàn)動物。 BALB/c 卷毛小鼠是本實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)的自發(fā)突變小鼠,本實(shí)驗(yàn)室對其種子資源進(jìn)行了純化并展開一系列研究。 前期研究結(jié)果提示突變基因?qū)π∈蟮拿庖咂鞴?、血液免疫成分和部分免疫分子均產(chǎn)生了一定的影響[5-6],因此本實(shí)驗(yàn)對BALB/c 突變卷毛小鼠與正常BALB/c 小鼠進(jìn)行肝癌細(xì)胞系皮下移植模型和原位腫塊移植模型構(gòu)建的比較分析,以期了解突變小鼠與正常小鼠構(gòu)建模型是否存在差異,同時探討是否由于免疫方面的缺陷而使突變小鼠在腫瘤模型構(gòu)建中更具有優(yōu)勢,為今后將該卷毛突變小鼠可能成為更有優(yōu)勢的肝癌動物模型提供堅實(shí)的理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

6 周齡SPF 級KM 小鼠2 只,雌性,18～20 g；5～6 周齡SPF 級BALB/c 小鼠20 只,雌性,16 ～18 g,均購自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2016-0002]。 20 只SPF 級5 ～6 周齡卷毛小鼠:20 只,16～18 g,雌性,來源于本實(shí)驗(yàn)室近交培育(全同胞兄妹交配)。 動物飼養(yǎng)在解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心[SYXK(軍)2017-0016]。 飼養(yǎng)環(huán)境:溫度22℃～25℃,濕度40%,自由進(jìn)食和飲水。 本實(shí)驗(yàn)通過了解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心動物倫理委員會審查(IACUC-2017-006)。 在實(shí)驗(yàn)過程中,嚴(yán)格按實(shí)驗(yàn)動物使用的3R 原則給予人道的關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

H22肝癌細(xì)胞株為本實(shí)驗(yàn)室保存。 DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清均購買自美國Hyclone 公司；吸入麻醉劑異氟烷(Isoflurane)購買自深圳瑞沃德公司產(chǎn)品。相差倒置顯微鏡(Olympus,日本)；離心機(jī)(Kubota 4200,日本)；游標(biāo)卡尺(上海臺海工量具有限公司)；手術(shù)器械和材料由本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 皮下腫瘤移植模型建立

將H22肝癌細(xì)胞株復(fù)蘇后腹腔接種于KM 小鼠體內(nèi),7 d 后小鼠腹腔形成含有H22的腹水,無菌抽取腹水于試管中,用生理鹽水洗滌2 次,離心(1000 r/min)5 min,棄上清液,臺盼藍(lán)染色計數(shù),用生理鹽水調(diào)整癌細(xì)胞數(shù)至1×107/mL,制備成細(xì)胞懸液備用。 小鼠分為兩組:BALB/c 小鼠組(10 只) 和BALB/c 突變卷毛小鼠組(10 只)。 將上述備用肝癌細(xì)胞懸液分別注射于兩組小鼠的右側(cè)下肢根部皮下,每只0.2 mL,連續(xù)觀察7 d,注射部位出現(xiàn)腫瘤組織提示造模成功。

1.3.2 原位腫瘤移植模型建立

將上述備用肝癌細(xì)胞注射接種于KM 小鼠的右側(cè)大腿根部皮下,生長一周后,解剖將腫瘤剝離,選取腫瘤組織性狀和色澤較好的部分切割成腫瘤組織微塊(直徑0.5 ～1 mm),置于DMEM 培養(yǎng)基中。隨后參考文獻(xiàn)[7]進(jìn)行手術(shù),建立原位腫瘤移植模型。 術(shù)后需觀察各組小鼠的活動狀態(tài),于15 d 后剖腹摘取肝腫瘤。

1.3.3 形態(tài)學(xué)觀察

使用游標(biāo)卡尺測量將上述兩種造模方式所得腫瘤均,分別記錄腫瘤的長徑與短徑。 按公式計算腫瘤體積(V):V=a×b2/2 (a 為長徑,b 為短徑)。隨后分別將兩組腫瘤組織置入4%甲醛固定,進(jìn)行HE 染色,光鏡下對病理形態(tài)學(xué)進(jìn)行觀察。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

腫瘤體積的數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,應(yīng)用配對t 檢驗(yàn)進(jìn)行組間分析比較。 P ＜0.05與P＜0.01 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組小鼠皮下腫瘤與肝原位腫瘤外觀對比結(jié)果

結(jié)果顯示:在相同的時間內(nèi),卷毛小鼠和正常小鼠的下肢根部均成功生長腫瘤,正常小鼠的腫瘤體積偏小,且比較扁平；而卷毛小鼠的腫瘤外觀明顯大于正常小鼠,且腫瘤大小較均勻,腫瘤更加立體,多呈三維狀態(tài)(見圖1A)。 而在相同的時間內(nèi),卷毛小鼠和正常小鼠的肝原位腫瘤也均移植成功。 卷毛小鼠的肝原位腫瘤均顯著大于正常小鼠,且可觀察到腫瘤與周邊的正常肝組織浸潤關(guān)系更密切(見圖1B)。

2.2 兩組小鼠皮下腫瘤與肝原位腫瘤體積對比結(jié)果

圖1 兩組小鼠皮下腫瘤與肝原位腫瘤外觀對比結(jié)果Note.A, Subcutaneous tumor.B, Liver tumor in situ.Figure 1 Comparison of appearance of subcutaneous tumors and liver tumors in situ in two groups of mice

結(jié)果顯示:正常小鼠和卷毛小鼠的皮下腫瘤體積分別平均為(55.38±30.98) mm3和(375.78±64.89) mm3,卷毛小鼠的皮下腫瘤體積與正常小鼠相比,具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01)；正常小鼠與卷毛小鼠的肝原位腫瘤的體積分別為(3.93±1.99)mm3和(11.91±7.34) mm3,卷毛小鼠的肝原位腫瘤體積也顯著大于正常小鼠(P＜0.05)(見表1)。

2.3 兩種方式移植腫瘤病理形態(tài)學(xué)比較分析

病理形態(tài)學(xué)結(jié)果可見:正常小鼠肝細(xì)胞索結(jié)構(gòu)完整,肝小葉結(jié)構(gòu)清晰,肝細(xì)胞胞漿均勻,無壞死和炎性浸潤(見圖2A)。 移植皮下腫瘤后可見:正常小鼠皮下腫瘤組織的巢狀結(jié)構(gòu)有明顯的界線,包裹肌肉的面積較少,浸潤性較輕(見圖2B)。 卷毛小鼠皮下腫瘤與肌肉組織之間沒有清晰的界線,完全融合在一起,侵蝕性較強(qiáng)(見圖2C)。 移植原位腫瘤后可見:正常小鼠的原位腫瘤體積較小,與正常肝組織的交界部位清晰可見,侵入性較弱；而卷毛小鼠原位腫瘤的視野內(nèi)腫瘤組織幾乎侵蝕了整個肝組織,完全破壞了正常的肝小葉組織,且腫瘤灶內(nèi)可見瘤細(xì)胞深染,排列擁擠雜亂(見圖2D、圖2E)。

表1 兩組小鼠兩種移植腫瘤體積比較( ,n=10)Table 1 Comparison of the volume of two kinds of transplanted tumors between two groups of mice

表1 兩組小鼠兩種移植腫瘤體積比較( ,n=10)Table 1 Comparison of the volume of two kinds of transplanted tumors between two groups of mice

注:動物數(shù)為10 只/組,與正常小鼠比較:*P＜0.01,ΔP＜0.05。Note.10 mice each group.Compared with normal mice.* P ＜0.01,ΔP＜0.05.

腫瘤體積(mm3)Tumor volume組別Groups 皮下腫瘤Subcutaneous tumor原位腫瘤Orthotopic tumor卷毛小鼠Curly mice 375.78±64.89* 11.91±7.34Δ正常小鼠Normal mice 55.38±30.98 3.93±1.99

圖2 兩種移植方式腫瘤病理學(xué)檢查(HE 染色)Note.A,normal liver.B-C,subcutaneous tumor of normal mice and curly mice,respectively.D-E,liver situ tumor of normal mice and curly mice,respectively.The red arrow shows junction between subcutaneous tumors and muscle tissue.The blue arrow shows junction between in situ tumors and normal liver tissue.Figure 2 Tumor pathological examination in two transplantation modes(HE staining)

3 討論

原發(fā)性肝癌是世界范圍內(nèi)常見和多發(fā)的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率和死亡率均居高不下[8]。 迄今為止,臨床上仍然缺乏行之有效的治療手段,肝癌的治療形勢依然很嚴(yán)峻。 因此研究者借助于建立良好的肝癌動物模型用于肝癌發(fā)病機(jī)制以及藥物治療的研究[9]。 文獻(xiàn)報道常見的建模方式為采用小鼠肝癌細(xì)胞系直接移植于小鼠皮下或直接將細(xì)胞懸液原位注射于肝[10-12],還有各種原位移植的改良報道[13-14]。 上述兩種建模方式應(yīng)用廣泛,但各有優(yōu)缺點(diǎn),適合應(yīng)用于不同的研究領(lǐng)域。 而對于應(yīng)用突變小鼠建立肝癌動物模型,國內(nèi)尚未見報道。

因此,本實(shí)驗(yàn)在前期研究發(fā)現(xiàn)卷毛小鼠具有部分免疫缺陷的基礎(chǔ)上,應(yīng)用突變卷毛小鼠與正常小鼠同時構(gòu)建皮下移植腫瘤模型和原位肝移植模型并進(jìn)行了比較,結(jié)果顯示:卷毛小鼠與正常小鼠均造模成功,說明該突變卷毛小鼠具有作為腫瘤移植模型的潛力,而且本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用了腫瘤微組織塊移植肝原位腫瘤,能夠更好的模擬腫瘤生長的微環(huán)境,為以后的研究提供高質(zhì)量的肝癌動物模型。 研究表明卷毛小鼠的皮下移植和原位移植腫瘤不僅體積均顯著大于正常小鼠(P＜0.05),而且腫瘤大小較均勻,腫瘤更加立體,多呈三維狀態(tài),較正常小鼠腫瘤扁平狀要更加適用于研究。 同時卷毛小鼠肝原位腫瘤與周邊的正常肝組織浸潤關(guān)系更密切。 病理結(jié)果能夠印證這一點(diǎn):卷毛小鼠皮下腫瘤與肌肉組織之間沒有清晰的界線,完全融合在一起,侵蝕性較強(qiáng)；卷毛小鼠肝原位腫瘤的視野內(nèi)腫瘤組織幾乎侵蝕了整個肝組織,肝小葉組織已經(jīng)完全破壞。眾所周知,皮下移植腫瘤屬于異位移植,多用于抗腫瘤藥物藥效學(xué)的初步研究,而肝癌的原位移植相較于異位移植能夠更好地模擬肝癌細(xì)胞在組織中與細(xì)胞以及組織間隙相互作用的狀況,同時肝癌細(xì)胞在組織中的血供與生長環(huán)境也更加接近于人體內(nèi)發(fā)生發(fā)展的過程,因此能夠更好地反映出肝癌發(fā)病機(jī)制分子生物學(xué)研究的特性[15]。 而本實(shí)驗(yàn)眾多結(jié)果均顯示卷毛小鼠的肝癌成模均優(yōu)于正常小鼠。下一步我們將對肝癌腫瘤形成機(jī)制及抗腫瘤藥效學(xué)對模型進(jìn)行評價研究。

綜上所述,BALB/c 突變卷毛小鼠在形成肝癌皮下移植腫瘤和肝臟原位移植腫瘤的能力顯著優(yōu)于正常BALB/c 小鼠,我們有理由推斷由于突變基因引起的部分免疫缺陷使該突變小鼠更易于成模,未來預(yù)期可將該突變卷毛小鼠應(yīng)用于肝癌動物模型的各項(xiàng)研究中,本實(shí)驗(yàn)為我們進(jìn)一步利用肝癌動物模型開展各項(xiàng)研究提供了很好的實(shí)驗(yàn)平臺,也將該突變卷毛小鼠應(yīng)用于新的研究領(lǐng)域提供堅實(shí)的理論支持。