童九輝,王 斌,袁 鶴,張 華,宋永周,馬 維

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院骨科,石家莊 050000)

骨折不愈合是骨科醫(yī)生共同面對的問題。Mills[1]通過研究發(fā)現(xiàn)蘇格蘭地區(qū)大約有超過千人的患者存在不同程度的骨折延遲愈合或不愈合,在整個(gè)英國這個(gè)數(shù)據(jù)可以達(dá)到11700 人。 促進(jìn)骨折愈合的因素有很多,Morley 等[2]及劉繼超等[3]發(fā)現(xiàn)腦外傷合并骨折時(shí)堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)以及血小板衍生生長因子(platelet derived growth factor ,PDGF)的表達(dá)水平增高等。 郭志豪等[4]和唐彥峰等[5]也分別通過骨折周圍局部應(yīng)用bFGF、PDGF 證實(shí)其可以加速骨折愈合。 大量實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明單獨(dú)應(yīng)用bFGF 或PDGF 可以加速骨折愈合,但對其可能的作用機(jī)制并未闡述清楚。 本實(shí)驗(yàn)旨在通過聯(lián)合應(yīng)用bFGF、PDGF,來了解其對大鼠骨折愈合過程的影響,研究其作用機(jī)制,也為藥物未來能促進(jìn)骨折愈合的臨床應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

48 只成熟雄性清潔級SD 大鼠,約8 周齡,體重在210 ～230 g,購自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK(冀)2018-004],無菌實(shí)驗(yàn)操作于河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行[SYXK(冀)2016-003],已通過河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院科研倫理委員會的批準(zhǔn)(2019-P019),并遵照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R 原則對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物提供人道關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

堿性成纖維細(xì)胞生長因子(廠家:武漢華美,貨號:CSB-YP008625RB)；血小板衍生生長因子(廠家:武漢華美,貨號:CSB-YP017708RA)；抗體點(diǎn)樣保護(hù)液(北京博奧生物,貨號:440015)；牛血清白蛋白(BIOFROXX 公司)；bFGF 抗體(廠家:北京博奧森,貨號:bs-0217R)；PDGF 抗體(廠家:北京博奧森,貨號:bs-10073R)；補(bǔ)體C3 抗體(廠家:北京博奧森,貨號:bs-2934R)；PBST 洗片緩沖液(河北博海生物自配)；Streptavidin-CY3(廠家:艾美捷科技公司貨號:7100-12)；抗體標(biāo)記脫鹽柱(廠家:pierce 公司,貨號:43230)；Bio MixerⅡ三維旋轉(zhuǎn)雜交儀(北京博奧生物)；Smart Arrayer 微陣列芯片點(diǎn)樣系統(tǒng)(北京博奧生物)；Slide Washer 8 洗片儀(北京博奧生物)。

PBST 洗片緩沖液(1 L)配方:氯化鈉8.0 g,磷酸氫二鈉2.9 g,氯化鈉8.0 g,氯化鉀0.2 g,磷酸二氫鉀0.2 g,1L 的ddH2O 溶解,加入0.5%的吐溫20。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組

所有動(dòng)物利用隨機(jī)數(shù)字表法將其分成4 組(A(bFGF 組),B(PDGF 組),C(bFGF+PDGF 聯(lián) 合組),D 組(空白對照組))。 12 只/組,組間不存在明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

1.3.2 大鼠脛骨骨折模型的建立

預(yù)實(shí)驗(yàn)后應(yīng)用3%的戊巴比妥鈉以40 mg/kg行大鼠腹腔內(nèi)注射麻醉,左小腿術(shù)區(qū)備皮顯露皮膚,常規(guī)消毒鋪單。 于大鼠左小腿前外側(cè)切開皮膚及皮下組織,頓性分離肌肉組織并充分暴露脛骨,并使用骨科線鋸在脛骨中部橫斷制造簡單骨折。 再使用細(xì)克氏針沿髓腔置入并固定遠(yuǎn)近骨折端。 骨折局部固定穩(wěn)定,并間斷縫合皮膚。 慶大霉素以50 000 U/d 肌注,每天一次,連續(xù)5 d。切口敷料局部包扎。

1.3.3 給藥方式

各組均于術(shù)后第3 天在骨折斷端周圍局部經(jīng)皮注射藥物(于骨折線上方5 mm 左右,針頭刺及骨面,向下滑至斷端),1 次/天,連續(xù)7 d。 給藥方式:A組100 ng bFGF+0.3 mL 生理鹽水[6],B 組100 ng PDGF+0.3 mL 生理鹽水[7],C 組100 ng bFGF+100 ng PDGF+0.3 mL 生理鹽水,D 組0.3 mL 生理鹽水。

1.3.4 標(biāo)本采集及觀察

在術(shù)后第2 周及第4 周從各組隨機(jī)選取6 只大鼠,行患肢X 線攝片。 由我科室2 名副主任醫(yī)師應(yīng)用Lane-Sandhu X 線評分方法[8]對各組X 線片行骨折愈合評價(jià)。 采用評分者盲法,取兩者平均值。

股動(dòng)脈取血后將大鼠處死。 血液離心后將上清液放于-70℃冰箱待檢。

將大鼠患肢切開并顯露骨痂,在骨痂遠(yuǎn)近各1 cm處截取脛骨,留取骨痂標(biāo)本。 行脫鈣、中和、脫水、透明、浸蠟、切片、HE 染色、組織學(xué)觀察。 利用多功能真彩色細(xì)胞圖像分析管理系統(tǒng)計(jì)量分析骨小梁成骨指數(shù)(index of osteoblast,IOB)及平均骨小梁寬度(trabecular width,TW)。

1.3.5 ALP、VEGF、BMP-2 及IGF-1 含量的測定(蛋白質(zhì)芯片法)

(1)預(yù)制蛋白質(zhì)芯片

化學(xué)修飾化處理載體玻片,把點(diǎn)樣緩沖液及抗體采用等比例混勻,再利用微陣列芯片點(diǎn)樣儀進(jìn)行點(diǎn)樣以及蛋白固定等處理。 4 種待測目標(biāo)抗體進(jìn)行3 點(diǎn)重復(fù)點(diǎn)樣,同時(shí)留取3 個(gè)空白對照點(diǎn)。 在37℃環(huán)境中把抗體蛋白固定并抽真空完成后再進(jìn)行干燥及抽真空塑封處理。 芯片置于4℃保存。

(2)蛋白質(zhì)芯片的檢測

利用Smart ArrayerTM微陣列芯片點(diǎn)樣儀進(jìn)行蛋白芯片的制作。 把蛋白芯片連同標(biāo)本一起置于室溫下復(fù)溫并保持20 min。 打開芯片的塑封膜并粘圍欄后放入芯片槽中,并在槽的兩側(cè)倒入100 μL 左右的蒸餾水進(jìn)行保濕。 加5%BSA 封閉液室溫平衡30 min,點(diǎn)入血清30 μL、蓋蓋并固定穩(wěn)定。 置于三維旋轉(zhuǎn)雜交儀中37℃恒溫反應(yīng)1 h。 采用洗片儀進(jìn)行洗片。 使用PBST 進(jìn)行洗滌處理1 h。 將有CY3 熒光素的抗補(bǔ)體C3 二抗加入并進(jìn)行反應(yīng)。 再次37℃環(huán)境下孵育1 h。 再次洗片、干燥處理。 利用芯片閱讀系統(tǒng)對蛋白芯片進(jìn)行分析并進(jìn)一步計(jì)算出四種檢測目標(biāo)的濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本實(shí)驗(yàn)中的數(shù)據(jù)使用SPSS 22.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析處理。 數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示。 將各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用方差分析,采用LSD 法對組間進(jìn)行兩兩比較。 Lane-Sandhu X 線評分采用重復(fù)測量方差分析。 檢驗(yàn)水準(zhǔn)α = 0.05,P ＜0.05 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大體觀察

術(shù)后2 周觀察可見:各組大鼠患肢內(nèi)固定穩(wěn)點(diǎn),肢體力線可,但行動(dòng)時(shí)均可見明顯跛行。 術(shù)后4 周觀察可見:A、B 組大鼠患肢骨折處有骨性骨痂形成；C 組有明顯骨性骨痂形成,部分標(biāo)本中甚至有骨橋形成；D 組大鼠可見少量骨性骨痂出現(xiàn)。

2.2 X 線片表現(xiàn)

術(shù)后2 周攝片:D 組骨折處局部骨折線清晰；A、B、C 組骨折線模糊,骨折間隙小,C 組優(yōu)于其他組(圖1)。

術(shù)后4 周攝片:D 組骨折線仍清楚可見；A 組和B 組大鼠患肢骨折線基本消失,可見外骨痂；C 組骨折線明顯消失(圖2)。

術(shù)后各觀察點(diǎn)的Lane-Sandhu X 線評分可見:C組得分均高于其他各組,且實(shí)驗(yàn)組A、B 兩組也均高于對照組D 組且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,A、B 組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。 (見表1)

2.3 組織學(xué)觀察

術(shù)后2 周:A、B 及C 組骨折處均可見纖維性骨痂和軟骨性骨痂形成,可見新生骨小梁、新生血管形成,A、B 兩組間無明顯差異,C 組最優(yōu)； D 組可見纖維骨痂和部分軟骨骨痂形成(圖3)。

術(shù)后4 周:A 組和B 組骨小梁增多并交織成網(wǎng)格狀,局部有部分成熟板層骨形成,髓腔中存在部分骨髓細(xì)胞；C 組可見成熟板層骨,髓腔內(nèi)出現(xiàn)大量骨髓細(xì)胞；D 組骨小梁欠成熟(圖4)。

2.4 骨痂骨組織計(jì)量與分析

各觀察點(diǎn)中,C 組標(biāo)本中骨痂內(nèi)IOB 值及TW值均優(yōu)于其他各組,A、B 組大于D 組,且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 A、B 組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。 (見表2、表3)

2.5 血清中ALP 含量的檢測

ALP 的含量于術(shù)后2 周及4 周時(shí)C 組最高,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 術(shù)后2 周可見:A、B 組均大于D 組但低于C 組(P＜0.05),A、B 組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 術(shù)后4 周結(jié)果示:A、B 及D 組三組間無明顯差異(P＞0.05)。 (見表4)

圖1 術(shù)后2 周各組代表性X 線表現(xiàn)Note.A, bFGF group.B, PDGF group.C, bFGF + PDGF group.D, control group.Figure 1 Representative X-ray performance of each group 2 weeks after surgery

表1 術(shù)后各組Lane-Sandhu X 線評分()Table 1 Lane-Sandhu X-ray score of each group after operation

表1 術(shù)后各組Lane-Sandhu X 線評分()Table 1 Lane-Sandhu X-ray score of each group after operation

注:A、B、D 組與C 組比較*P＜0.05；A、B 組與D 組比較#P＜0.05；2周PAB=0.341, 4 周PAB=0.742。Note.Group A, B, and D compared with Group C,*P＜0.05.Groups A and B compared with Group D,#P＜0.05.2 weeks PAB=0.341,4 weeks PAB=0.742.

組別Groups 2 周2 weeks 4 周4 weeks A 3.83±0.75*# 6.33±0.52*#3.50±0.55*# 6.17±0.75*#C 4.67±0.52 9.00±1.09 D 1.33±0.52* 3.83±0.98*B

2.6 血清中VEGF 的含量

術(shù)后2 周時(shí),A、B、C 組VEGF 的含量均高于D組,C＞B＞A＞D 組,有統(tǒng)計(jì)差異(P＜0.05)。 術(shù)后4 周時(shí), C 組高于其他各組(P＜0.05)。 A、B、D 各組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。 (見表5)

2.7 血清中BMP-2 的含量

術(shù)后2 周時(shí)C＞B＞A、D(P＜0.05)。 A 組與D 組組間比較無明顯差異(P＞0.05)。 術(shù)后4 周結(jié)果顯示:四組組間均無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。 (見表6)

2.8 血清中IGF-1 的含量

術(shù)后2 周時(shí),C＞B＞A＞D,且差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。 術(shù)后4 周時(shí), C 組大于其他各組(P ＜0.05),其余三組組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。 見表7。

3 討論

如何促進(jìn)骨折愈合一直以來都是困擾骨科醫(yī)生的一個(gè)難題。 在以往的研究中,Martijn Hofman等[9-10]提出:在重度的顱腦外傷之后,患者的血清與腦脊液中均可見檢測出一些細(xì)胞因子較正常人水平明顯增高,并認(rèn)為這些因子在加快骨折愈合的過程中發(fā)揮了作用。 這其中就包括具有驅(qū)化成骨作用的bFGF 及PDGF。 已有研究證明局部單獨(dú)注射這兩種因子可以促進(jìn)骨折愈合。 這也給了我們啟發(fā),局部注射生長因子可以是一種簡單有效的治療手段,是否可以通過局部注射多種因子而起到促進(jìn)或抑制骨折愈合的作用呢,又或者其促進(jìn)骨折愈合的機(jī)制是什么。 目前對于這些還沒有答案,因此本實(shí)驗(yàn)選用兩種因子,通過觀察其聯(lián)合應(yīng)用后的作用來研究其對大鼠脛骨骨折愈合過程的影響作用,探尋其作用的機(jī)制。堿性成纖維細(xì)胞生長因子是已經(jīng)被證實(shí)的可以促進(jìn)成骨作用的一種多肽,具有促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖與分化并加速鈣鹽的沉積的作用[11]；此外其還有很強(qiáng)的刺激血管再生的作用,并在骨折愈合過程的早期表達(dá)[12-13]。 Wildburger 等[14]人發(fā)現(xiàn):嚴(yán)重腦外傷合并長骨骨折的患者血清中bFGF 的含量比單純骨折組高。 顧熊華等[15]則將bFGF 局部注射在兔橈骨骨折處并證實(shí)了bFGF 的加速骨折愈合的作用。

圖2 術(shù)后4 周各組代表性X 線表現(xiàn)Note.A, bFGF group.B, PDGF group.C, bFGF + PDGF group.D, control group.Figure 2 Representative X-ray performance of each group 4 weeks after surgery

圖3 術(shù)后2 周各組代表性組織學(xué)表現(xiàn)(HE)Note.A, bFGF group.B, PDGF group.C, bFGF + PDGF group.D, control group.Figure 3 Representative histological findings of each group 2 weeks after operation

圖4 術(shù)后4 周各組代表性組織學(xué)表現(xiàn)(HE)Note.A, bFGF group.B, PDGF group.C, bFGF + PDGF group.D, control group.Figure 4 Representative histological performance of each group 4 weeks after operation

表2 術(shù)后2 周各組痂中骨組織形態(tài)測定分析()Table 2 Analysis of bone tissue morphology in scabs of each group 2 weeks after operation

表2 術(shù)后2 周各組痂中骨組織形態(tài)測定分析()Table 2 Analysis of bone tissue morphology in scabs of each group 2 weeks after operation

注:A、B、D 組與C 組IOB 及TW 比較,*P＜0.05；A、B 組與D 組比較#P＜0.05；I0B(PAD=0.013,PBD=0.003,PCD=0.000)。Note.Group A, B, and D compared with IOB and TW in Group C,*P ＜0.05.Group A and B compared with group D,#P ＜0.05.I0B (PAD =0.013, PBD=0.003, PCD=0.000).

?

表3 術(shù)后4 周各組骨痂中骨組織形態(tài)測定分析()Table 3 Analysis of bone tissue morphology in callus at 4 weeks after operation

表3 術(shù)后4 周各組骨痂中骨組織形態(tài)測定分析()Table 3 Analysis of bone tissue morphology in callus at 4 weeks after operation

注:A、B、D 組與C 組比較, *P ＜0.05；A、B 組與D 組比較, #P ＜0.05；I0B(PAD,PBD,PCD均＜0.05)。Note.Group A,B,and D compared with Group C,*P＜0.05.Groups A and B compared with Group D,#P＜0.05.I0B(PAD＜0.05,PBD＜0.05,PCD＜0.05).

組別Groups骨小梁成骨指數(shù)(mm2)IOB Trabecular bone formation index平均骨小梁寬度(μm)TW Trabecular width A 298.36±14.11*# 64.25±4.09*#B 304.90±15.23*# 65.33±5.23*#C 338.65±17.39 73.57±5.02 D 231.33±13.98* 50.56±3.27*

表4 各組血清中ALP 的含量()Table 4 The content of ALP in serum of each group

表4 各組血清中ALP 的含量()Table 4 The content of ALP in serum of each group

注:A、B、D 組與C 組比較, *P ＜0.05；A、B 組與D 組比較, #P ＜0.05。 2 周(PAD = 0.022,PBD = 0.003,PCD = 0.000)；4 周(PAC =0.005,PBC=0.027,PCD=0.007)。Note.Group A, B, and D compared with Group C,*P＜0.05.Groups A and B compared with Group D, #P ＜0.05.2 weeks(PAD =0.022,PBD =0.003,PCD=0.000).4 weeks(PAC=0.005,PBC=0.027,PCD=0.007)

組別Groups血清中ALP 的含量(ng/mL)Serum ALP content 2 周2 weeks 4 周4 weeks A 140.68±15.14*# 103.68±13.86*B 152.16±13.57*# 112.99±12.69*C 318.13±19.21 134.48±15.44 D 114.12±18.02* 106.29±16.69*

表5 各組血清中VEGF 的含量()Table 5 Serum VEGF content in each group

表5 各組血清中VEGF 的含量()Table 5 Serum VEGF content in each group

注:A、D 組與B 組比較,◆P＜0.05；A、B、D 組與C 組比較,*P＜0.05；A、B 組與D 組比較,#P＜0.05。 2 周(PAC=0.000,PBC=0.000,PCD=0.000,PAB=0.019)；4 周(PAC=0.000,PBC=0.000,PCD=0.000)。Note.Group A and D compared with Group B,◆P＜0.05.Group A, B and D compared with Group C,*P＜0.05.Group A and B compared with Group D,#P＜0.05.2 weeks(PAC =0.000,PBC =0.000,PCD =0.000,PAB=0.019).4 weeks(PAC=0.000,PBC=0.000,PCD=0.000).

組別Groups血清中VEGF 的含量(pg/mL)Serum VEGF content 2 周2 weeks 4 周4 weeks A 238.25±15.33*#◆ 222.96±14.16*B 266.40±18.52*# 230.85±13.59*C 344.61±18.19 285.97±16.92 D 211.15±18.48*◆ 208.06±15.91*

表6 各組血清中的BMP-2 含量()Table 6 BMP-2 content in serum of each group

表6 各組血清中的BMP-2 含量()Table 6 BMP-2 content in serum of each group

注:A、D 組與B 組比較,◆P＜0.05；A、B、D 組與C 組比較,*P＜0.05。2 周(PAD=0.021,PBD=0.035,PCD=0.001,PAB=0.039)。Note.Group A and D compared with Group B,◆P＜0.05.Group A, B and D compared with Group C, *P＜0.05.2 weeks(PAD=0.021,PBD=0.035,PCD=0.001,PAB=0.039).

組別Groups血清中BMP-2 的含量(pg/mL)Serum BMP-2 content 2 周2 weeks 4 周4 weeks A 106.62±14.73*◆ 103.31±15.78 B 122.67±13.61* 98.86±18.31 C 143.96±18.19 108.32±16.96 D 106.15±14.59*◆ 96.82±14.24

表7 各組血清中的IGF-1 含量()Table 7 IGF-1 content in serum of each group

表7 各組血清中的IGF-1 含量()Table 7 IGF-1 content in serum of each group

注:A 組B 組相比,◆P＜0.05；A、B、D 三組與C 組相,*P＜0.05；A、B組與D 組比較,#P ＜0.05。 2 周(PAD = 0.032,PBD = 0.001,PCD =0.000,PAB=0.011,PAC = 0.000,PBC = 0.004)；4 周(PAC = 0.000,PBC=0.001,PCD=0.000)。Note.Group A compared with Group B,◆P ＜0.05.Group A, B and D compared with Group C,*P＜0.05.Group A and B compared with Group D,#P＜0.05.2 weeks(PAD=0.032,PBD=0.001,PCD=0.000,PAB=0.011,PAC=0.000,PBC=0.004).4 weeks(PAC=0.000,PBC=0.001,PCD=0.000)。

組別Groups血清中IGF-1 的含量(pg/mL)Serum IGF-1 content 2 周2 weeks 4 周4 weeks A 310.42±18.65*#◆ 298.23±17.09*B 337.67±16.39*# 302.53±18.56*C 381.06±27.89 343.29±16.03 D 290.36±14.41* 287.39±13.92*

血小板衍生生長因子是一種于血小板中提取出的成骨因子。 其主要有兩種功能:促進(jìn)血小板、成纖維細(xì)胞等有絲分裂；對成骨細(xì)胞等有很強(qiáng)的驅(qū)化作用[16]。 其可以調(diào)節(jié)VEGF 的表達(dá),促進(jìn)損傷組織的修復(fù)與重建[17]。 徐亞青[18]等人通過實(shí)驗(yàn)認(rèn)為:在大鼠骨折愈合過程的早期及中晚期均檢測到PDGF 以及PDGF mRNA 的表達(dá)增強(qiáng),因此可以認(rèn)為PDGF 的表達(dá)在骨折修復(fù)的全程中均起作用。 此前已有學(xué)者[19]證明局部使用該藥物使糖尿病大鼠的骨折修復(fù)過程加快。

本實(shí)驗(yàn)中我們分別對大鼠脛骨骨折的大體標(biāo)本、影像學(xué)及組織學(xué)進(jìn)行了分析,結(jié)果可見:首先,在術(shù)后2 周及4 周,實(shí)驗(yàn)組骨痂大小均優(yōu)于對照組,且骨折線消失快,Lane-Sandhu X 線評分均高于對照組,骨痂組織的成熟度高,骨痂內(nèi)IOB 值及TW 值均較高。 其次,C 組在各觀察點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)在上述觀察指標(biāo)中均高于其他三組。 因此我們不難看出,在本實(shí)驗(yàn)中單獨(dú)將bFGF 或PDGF 應(yīng)用于骨折局部具有加速骨折愈合的作用,且與Al-Zube 的觀點(diǎn)一致；此外,在骨折局部聯(lián)合使用bFGF 及PDGF 可產(chǎn)生優(yōu)于單獨(dú)使用時(shí)的促進(jìn)骨折愈合的作用。

在本實(shí)驗(yàn)中我們不僅研究了兩種藥物局部及聯(lián)合應(yīng)用對骨折愈合過程的作用,我們還設(shè)立了四個(gè)觀察指標(biāo):ALP、VEGF、BMP-2 及IGF-1。 堿性磷酸酶(ALP)是一種含鋅糖蛋白,其表達(dá)于人體多種組織器官中,且研究表明ALP 參與了成骨作用并可反映骨折的修復(fù)與重建。 李建明等[20]認(rèn)為:ALP 在機(jī)體中的水平可以作為骨折愈合過程的初期反映骨折愈合能力的一種簡單而準(zhǔn)確觀察指標(biāo)。 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):聯(lián)合應(yīng)用bFGF 和PDGF 對ALP 的表達(dá)具有同向促進(jìn)作用。 ALP 一直被認(rèn)為是能夠早期了解骨折愈合過程中的成骨及骨鈣化活動(dòng)的一種因子。 這也說明了聯(lián)合用藥較優(yōu)的促成骨作用。

血管內(nèi)皮生長因子是人們研究發(fā)現(xiàn)的一種可以促進(jìn)血管再生與修復(fù)的關(guān)鍵因子。 Pi 等[21]人則通過實(shí)驗(yàn)證明:VEGF 的表達(dá)可以增強(qiáng)骨形態(tài)發(fā)生蛋白9 誘導(dǎo)的成骨分化和骨形成,繼而產(chǎn)促進(jìn)骨折愈合。 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):單獨(dú)應(yīng)用bFGF 或PDGF 可使血清中VEGF 表達(dá)增強(qiáng),但PDGF 的作用比bFGF強(qiáng)；聯(lián)合應(yīng)用使VEGF 表達(dá)更強(qiáng)。 bFGF 與PDGF 同向增強(qiáng)VEGF 的表達(dá),或許是其聯(lián)合作用過程中促進(jìn)骨折愈合的作用機(jī)制之一。 BMP-2 是被證實(shí)的在骨折愈合過程的早期便可以單獨(dú)介導(dǎo)間充質(zhì)細(xì)胞成骨分化的因子,骨組織形成的關(guān)鍵調(diào)控因子,缺少BMP 的表達(dá)就不能產(chǎn)生成骨作用[22]。 Hara等[23]人通過研究發(fā)現(xiàn)BMP 可以促進(jìn)骨折愈合,也是骨折愈合過程中重要的檢測指標(biāo)。

在本實(shí)驗(yàn)中局部應(yīng)用bFGF 并未對血清中BMP-2 表達(dá)產(chǎn)生明顯影響；而應(yīng)用PDGF 則可增強(qiáng)BMP-2 的表達(dá)效果；但當(dāng)聯(lián)合使用二者是,則表現(xiàn)出了更強(qiáng)的BMP-2 表達(dá)。 因此我們對實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析認(rèn)為:bFGF 可以增強(qiáng)PDGF 對大鼠BMP-2 的表達(dá)的促進(jìn)作用。 bFGF 增強(qiáng)PDGF 對BMP-2 的表達(dá)或許是聯(lián)合過程中加速骨折的一種機(jī)制,但其是通過何種途徑調(diào)節(jié)PDGF 功能仍需進(jìn)一步研究。

IGF-1 被認(rèn)為是一種介導(dǎo)生長激素發(fā)揮作用的活性蛋白多肽。 Locatelli 等[24]認(rèn)為IGF-1 參與了調(diào)控細(xì)胞分化成骨,促進(jìn)了ALP 的表達(dá)及骨礦化。 吳文俠等[25]報(bào)道:在腦外傷合并骨折的大鼠模型中,其骨痂中IGF-1 的表達(dá)明顯高于單純骨折組,并認(rèn)為其加速了骨折的修復(fù)。 通過本實(shí)驗(yàn)可以看出:分別使用這兩種藥物可以提高大鼠血清中IGF-1 的表達(dá),聯(lián)合使用可使該作用更明顯,也加速了骨折的愈合。 因此,bFGF 與PDGF 對增強(qiáng)大鼠IGF-1 的表達(dá)有同向促進(jìn)作用。 因此,這或許也是其加速骨折愈合的另一種作用機(jī)制。

綜上所述,骨折部位局部聯(lián)合應(yīng)用bFGF、PDGF可以較單獨(dú)應(yīng)用明顯的促進(jìn)骨折的愈合過程。 聯(lián)合使用bFGF 及PDGF 兩種藥物還可以提高大鼠血清中ALP、VEGF、BMP-2 及IGF-1 四種因子的表達(dá)水平,且具有同向促進(jìn)作用。 這或許是聯(lián)合應(yīng)用bFGF 與PDGF 促骨折愈合較優(yōu)的機(jī)制之一,促進(jìn)骨折局部新生血管形成,改善局部血運(yùn),促進(jìn)骨基質(zhì)的形成,并增強(qiáng)ALP 的活性,形成骨鈣素,促進(jìn)成骨[26]。

在實(shí)驗(yàn)中我們使用蛋白質(zhì)芯片技術(shù)來高效、準(zhǔn)確的檢測血清中的多種指標(biāo)。 蛋白質(zhì)芯片是一種高通量定量分析、快速、并行的檢測方法。 目前該方法仍僅多用于腫瘤指標(biāo)的篩查等工作,對骨科領(lǐng)域的多因子檢測使用仍較少。 我們創(chuàng)新性的將其用于骨科實(shí)驗(yàn)中,也為其他實(shí)驗(yàn)工作的多因子檢測提供參考方法。

本實(shí)驗(yàn)證為臨床早期干預(yù)治療骨折不愈合或延遲愈合患者提供了實(shí)驗(yàn)參考。 但本實(shí)驗(yàn)對骨折愈合的評價(jià)仍存在不足。 Micro-CT 是目前一種能細(xì)微觀察并定量分析骨折局部骨小梁變化的方法,其具有良好的空間分辨率。 除了應(yīng)了解骨折局部微觀變化外,機(jī)械力學(xué)的改變也可以反映其機(jī)械功能的修復(fù)情況。 以上兩種方法因?qū)嶒?yàn)器械限制未能應(yīng)用在本實(shí)驗(yàn)中,后期需不斷完善相關(guān)實(shí)驗(yàn)工作。 此外,兩種是否存在更優(yōu)的聯(lián)合藥物選擇也仍需進(jìn)一步探究。