張瑞娥，馬 倩，張娜娜，劉小麗

（阜陽師范大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院，安徽 阜陽 236037）

銅是植物生長所必須的微量元素，在植物生命活動(dòng)中起著必不可缺少的作用[1]。但當(dāng)土壤中微量元素超過一定的數(shù)值時(shí)，則會對植物的生長造成傷害。現(xiàn)今，隨著工農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化的發(fā)展，大量的廢棄物排出，導(dǎo)致土壤中銅含量越來越高[2]，造成土壤穩(wěn)定性下降，改變土壤環(huán)境[3]，而間接影響植物的正常生長；而大量的銅被植物吸收后，在植物體內(nèi)富集，通過影響植物的基礎(chǔ)代謝過程[4]，而導(dǎo)致植物生長受阻[5]，進(jìn)而影響其品質(zhì)[6]，同時(shí)富集這些金屬的植物被人或其它動(dòng)物食用后其健康亦會受到很大的影響[7]。

隨著土壤環(huán)境污染的日益嚴(yán)重，為找到增強(qiáng)植物抗逆性的方法，研究者們進(jìn)行了各種各樣的研究。大量研究表明，施加外源鈣可提高植物的抗重金屬能力[8-9]。玉米（Zea maysL.）為禾本科植物，是常見糧食作物之一，不僅是人和動(dòng)物的口糧和“飼料之王”，也是重要工業(yè)原料，其主要生長于北方，在我國糧食作物中種植面積居于首位[10]。隨著土壤重金屬污染程度的加劇，玉米的生長亦受到很大程度的影響[11]，然而關(guān)于重金屬對植物的毒害及其緩解的研究主要見于小麥[12]、水稻[13]及一些蔬菜類經(jīng)濟(jì)作物[14]，而關(guān)于緩解玉米銅毒害的報(bào)道卻極少見。本文研究的目的就在于探索銅脅迫下玉米苗期生長的生理生化變化，以及脅迫條件下施加外源鈣對玉米苗期生理特性的影響，以尋找鈣緩解銅脅迫的機(jī)制，為消弱銅毒害造成玉米產(chǎn)量降低的實(shí)踐生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料培養(yǎng)及處理

1.1.1 材料培養(yǎng)

選取籽粒飽滿、大小一致的金黃糯玉米種子流水沖洗10 min后，用5%的次氯酸鈉溶液消毒10 min，再用蒸餾水沖洗3次，然后置于恒溫培養(yǎng)箱中于30℃下浸種。24 h后播種于裝有等量洗凈細(xì)沙的育苗盆（直徑15 cm，深15 cm）中，每盆12粒種子，間距一致，將其放入光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（光期：16 h，28℃，6級光照；暗期：8 h，25℃，0級光照）。每天以等量的蒸餾水澆灌，保證培養(yǎng)基質(zhì)濕潤。一周后間苗，每盆保留長勢相同的幼苗6株左右，平均分成4組，每組5盆。每天每盆分別澆灌30 mL處理液。處理兩周后取第二片或第三片葉片近基部進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)測定。

1.1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)設(shè)置4個(gè)處理：CK（對照）、T1（Cu2+處理對照）、T2、T3，每處理設(shè)5個(gè)重復(fù)?；九囵B(yǎng)液為Hoagland營養(yǎng)液，各處理營養(yǎng)組成如表1。營養(yǎng)液中的各試劑均為分析純，其中Cu2+由CuSO4·5H2O提供，Ca2+由無水CaCl2提供。

表1 不同處理組營養(yǎng)液組成

1.2 指標(biāo)測定方法

采用王學(xué)奎[15]和張志良[16]的方法：葉綠素含量的測定以80%的丙酮為提取液，比色測定并計(jì)算各色素含量[15]；可溶性蛋白含量的測定以蒸餾水為提取液，采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法（也稱為Bradford法）測定[15]；可溶性糖含量的測定以蒸餾水為提取液，沸水提取，采用蒽酮比色法測定[15]；脯氨酸含量的測定采用酸性茚三酮顯色法[16]；過氧化物酶（peroxidase，POD）活性和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性的測定分別采用愈創(chuàng)木酚比色法[16]和氮藍(lán)四唑比色法[15]；丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量的測定采用硫代巴比妥酸法[16]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用Excel2003進(jìn)行結(jié)果計(jì)算及均值作圖，均值計(jì)算及最小顯著差數(shù)（least significant difference，LSD）法應(yīng)用SPSS20.0處理。論文最終數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源鈣對高銅環(huán)境下玉米幼苗葉片中光合色素含量的影響

由表2可以看出，在高Cu2+環(huán)境下，葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素的含量下降，下降值分別為對照的17.88%、25.77%和19.62%，葉綠素a/b和類胡蘿卜素的含量上升；高Cu2+環(huán)境下施加外源鈣葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素的含量均高于銅處理，葉綠素a/b低于銅處理，類胡蘿卜素含量隨鈣濃度變化先升后降。

2.2 外源鈣對高銅環(huán)境下玉米幼苗葉片中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

2.2.1 對玉米幼苗葉片中脯氨酸含量的影響

從表3第二列可以看出：1）在高Cu2+環(huán)境下，玉米幼苗葉片中脯氨酸的含量比對照組上升46.93%（P＜0.05），說明植物體在此種環(huán)境下，能感知脅迫的存在，并通過對脯氨酸的積累做出了相應(yīng)的響應(yīng)；2）高 Cu2+環(huán)境下，施加 10 mmol·L-1、20 mmol·L-1的Ca2+后，分別比對照上升了 57.88%（P＜0.05）和 109.29%（P＜0.05），比高 Cu2+處理上升了 7.45%（P＞0.05）和 42.44%（P＜0.05）,且施加不同濃度的Ca2+，脯氨酸含量差異顯著（P＜0.05），說明一定濃度的外源鈣有利于脯氨酸含量的增加，而脯氨酸作為一種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在一定程度上能夠提高植物的抗逆性。

表2 外源鈣對高銅環(huán)境下玉米幼苗葉片光合色素含量的影響(±σ)

表2 外源鈣對高銅環(huán)境下玉米幼苗葉片光合色素含量的影響(±σ)

注：字母表示縱向數(shù)字在0.05水平上的差異顯著性，字母相同，差異不顯著，字母不同差異顯著（P＜0.05）。下同

類胡蘿卜素含量/(mg·g-1)0.408±0.020 a 0.433±0.002 a 0.486±0.060 a 0.420±0.031 a處理CK T1 T2 T3葉綠素a含量/(mg·g-1)2.656±0.052 a 2.181±0.228 a 2.546±0.065 a 2.545±0.216 a葉綠素b含量/(mg·g-1)0.811±0.022 a 0.602±0.062 a 0.862±0.119 a 0.776±0.080 a總?cè)~綠素含量/(mg·g-1)3.257±0.037 a 2.618±0.273 b 3.197±0.126 b 3.120±0.258 b葉綠素a/b 3.29±0.15 a 3.62±0.04 a 3.11±0.39 a 3.33±0.28 a

2.2.2 對玉米幼苗葉片中可溶性糖含量的影響

從表3第三列可以看出：1）與對照組相比，在高Cu2+環(huán)境下，玉米幼苗葉片中可溶性糖含量上升，上升量為對照的 30.86%（P＜0.05）；2）高 Cu2+環(huán)境下，施加 10 mmol·L-1和 20 mmol·L-1的 Ca2+后葉片中可溶性糖的含量繼續(xù)增加，但與高銅處理相比未達(dá)到顯著水平（P＞0.05）。這表明Ca2+對在高Cu2+環(huán)境下的玉米幼苗葉片中可溶性糖的合成有一定的促進(jìn)作用。

表3 外源鈣對高銅環(huán)境下玉米幼苗葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響(±σ)

表3 外源鈣對高銅環(huán)境下玉米幼苗葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響(±σ)

可溶性蛋白含量/(mg·g-1)21.265±0.215a 18.633±0.142a 20.567±0.047a 17.330±0.704a處理CK T1 T2 T3脯氨酸含量/(μg·g-1)4.404±0.263a 6.471±0.499b 6.953±0.329b 9.217±0.860c可溶性糖含量/(μg·g-1)3 266.03±175.04a 4 274.01±52.42b 4 592.97±81.46b 4 792.00±93.04b

2.2.3 對玉米幼苗葉片中可溶性蛋白質(zhì)含量影響

從表3第四列可以看出：1）與對照組相比，玉米幼苗在高Cu2+下葉片中可溶性蛋白的含量下降了 12.38%（P＞0.05）；2）高銅環(huán)境下施加 10 mmol·L-1的Ca2+可溶性蛋白含量為銅處理的110.38%（P＞0.05）,對照的 96.72%（P＞0.05）,施加20 mmol·L-1的Ca2+后可溶性蛋白的含量下降為銅處理的 93%（P＞0.05），對照的 81.5%（P＞0.05）。這表明Ca2+對高Cu2+環(huán)境下玉米幼苗葉片中可溶性蛋白含量的下降有一定的抑制作用，但濃度過高會促使可溶性蛋白含量的降低。

2.3 外源鈣對高銅環(huán)境下玉米幼苗葉片中保護(hù)酶活性的影響

2.3.1 對玉米葉片中POD活性的影響

從表4可以看出，玉米幼苗在高Cu2+環(huán)境下POD活性下降為對照的49.30%，且達(dá)到顯著水平（P＜0.05）；在高 Cu2+環(huán)境下施加 10 mmol·L-1和20 mmol·L-1的 Ca2+后，POD 活性上升為對照的83.6%和102.41%，與銅處理相比達(dá)顯著水平（P＜0.05），與對照未達(dá)顯著水平。

2.3.2 對玉米幼苗葉片中SOD活性的影響

由表4可知，在高Cu2+環(huán)境下玉米幼苗葉片中SOD活性與對照相比上升了24.69%，與對照達(dá)顯著水平（P＜0.05）；高Cu2+環(huán)境下添加外源鈣，POD活性在鈣濃度為10 mmol·L-1時(shí)上升，而在鈣濃度為20 mmol·L-1時(shí)下降，但均高于對照。

表4 外源鈣對高銅環(huán)境下玉米幼苗葉片保護(hù)酶活性和MDA含量的影響(±σ)

表4 外源鈣對高銅環(huán)境下玉米幼苗葉片保護(hù)酶活性和MDA含量的影響(±σ)

處理CK T1 T2 T3保護(hù)酶POD活性/(U·g-1·min-1)3 591.87±252.20 a 1 770.90±47.99 b 3 002.68±229.47 a 3 678.41±186.40 a SOD活性/(U·g-1)402.96±11.14 a 502.46±8.23 bc 543.55±51.65 b 458.00±3.90 ac MDA含量/(μmol·g-1)11.806±0.339 a 18.101±1.132 b 14.629±1.615 c 15.937±1.262 bc

2.4 外源鈣對高銅環(huán)境下玉米幼苗葉片中MDA含量的影響

表4可知，高Cu2+環(huán)境下，玉米幼苗葉片中丙二醛含量上升，上升量為對照的53.32%（P＜0.05）；高 Cu2+環(huán)境下施加 10 mmol·L-1和 20 mmol·L-1的鈣，丙二醛含量先下降再上升，均低于高銅處理，且與高銅環(huán)境下丙二醛含量達(dá)顯著水平（P＜0.05）。

3 結(jié)論和討論

3.1 高銅環(huán)境下外源鈣對玉米幼苗幼苗光合色素含量的影響

植物通過光合作用合成生長必需的有機(jī)物質(zhì)，而在光合作用中，光合色素能夠吸收、傳遞以及轉(zhuǎn)換光能，通過電子傳遞和光合磷酸化轉(zhuǎn)換成同化力來固定CO2[17]。高等植物中光合色素主要有葉綠素和類胡蘿卜素兩種[17]，研究顯示高銅環(huán)境下，葉綠素a、b以及總?cè)~綠素含量降低，說明高銅環(huán)境下可能會導(dǎo)致葉綠素合成受阻，分解加快進(jìn)而影響光合作用能力。施加外源鈣后，葉綠素含量基本呈現(xiàn)先升后降的趨勢。亦有研究顯示，鎘脅迫下蘆葦幼苗葉綠素含量降低，但施加10 mmol·L-1的鈣后，可使葉綠素含量顯著回升[18]。高銅環(huán)境下葉綠素a/b以及類胡蘿卜素含量升高，施鈣后a/b先降后升，類胡蘿卜素先升后降，葉綠素a/b可能是由于銅環(huán)境下抑制了葉綠素a到b的轉(zhuǎn)化，適量外源鈣可協(xié)調(diào)a向b的轉(zhuǎn)化。類胡蘿卜素在植物生命活動(dòng)中不僅僅起到吸收以及傳遞光能的作用，在逆境生理研究中，它還是一種非酶類的自由基清除劑[17]，高銅環(huán)境下含量上升可能是一種保護(hù)性的應(yīng)激反應(yīng)。

3.2 高銅環(huán)境下外源鈣對玉米幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

逆境條件下會導(dǎo)致植物體內(nèi)水分代謝失調(diào)，滲透調(diào)節(jié)則可以使植物細(xì)胞保持持續(xù)吸水的能力[19]，脯氨酸[20-21]和可溶性糖是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。本研究表明高銅環(huán)境下脯氨酸和可溶性糖含量增加。說明植物體本身具有一定的積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的能力。施加鈣后，高銅環(huán)境下含量持續(xù)上升。施20 mmol·L-1鈣后脯氨酸含量仍然增加，或許與蛋白質(zhì)代謝相關(guān)，本文研究顯示，高銅環(huán)境下，可溶性蛋白含量下降，施加鈣后，蛋白含量先升高，后降低，可能是因?yàn)槊{迫條件下蛋白質(zhì)分解大于合成，而適量鈣可抑制蛋白分解，鈣過量后亦會對植物體造成雙重脅迫，而加速蛋白分解。說明適量外源鈣可使植物滲透調(diào)節(jié)能力加強(qiáng)。

3.3 高銅環(huán)境下外源鈣對玉米幼苗保護(hù)酶活性及MDA含量的影響

重金屬污染能使植物體的活性氧產(chǎn)生量增高，引起大分子物質(zhì)變性及膜脂過氧化，使植物受害，而保護(hù)酶系統(tǒng)可清除活性氧，使植物體免除受害[22]。高銅環(huán)境下SOD活性升高應(yīng)為植物本身的一種抵抗逆境的反應(yīng)，有利于清除活性氧，降低膜脂的過氧化和脫脂化，高銅環(huán)境下POD酶遭到破壞，活性降低，使POD酶的一些底物不能被降解，使植物受害。施入外源鈣后，POD活性升高，SOD活性先升高后降低，由此可知外源鈣可通過調(diào)節(jié)保護(hù)酶的活性提高植物的抗性。MDA是膜脂過氧化的產(chǎn)物，是衡量膜脂過氧化損傷的指標(biāo)[22]。高銅環(huán)境下膜結(jié)構(gòu)破壞，MDA含量升高，施鈣情況下，MDA含量下降，說明外源鈣可在一定程度上降低膜脂過氧化，保護(hù)膜的完整性，這應(yīng)該與提高保護(hù)酶的活性有一定的相關(guān)性。

4 小結(jié)

綜上所述，高銅環(huán)境下，玉米苗期生理代謝受到影響，使玉米苗期生長受抑，施加外源鈣可在一定程度上降低毒害的發(fā)生，綜合各指標(biāo)的變化情況，10 mmol·L-1鈣的緩解效果要強(qiáng)于 20 mmol·L-1鈣。