韋婧 劉海洲 寧淑芳 張力圖

【關鍵詞】ITLN1;免疫;結腸癌;CIBERSORT

【中圖分類號】 R735.35 ?【文獻標識碼】B 【文章編號】1002-8714（2020）05-0026-01

結直腸癌是世界第三大流行癌癥，但死亡率排名第二[1]。結腸癌的發(fā)病機制涉及多種因素，包括環(huán)境和遺傳變量，而詳細的分子機制仍不清楚。非常需要特定的結腸癌生物標志物和治療途徑來改善患者的預后。

研究發(fā)現(xiàn)半乳糖凝集素在許多人類實體和血液惡性腫瘤中過表達，并在腫瘤生物學中發(fā)揮重要作用，包括轉化，生長，粘附，侵襲和侵襲[2]。Intelectin 1（ITLN1）是最近發(fā)現(xiàn)的一種分泌型和半乳糖呋喃糖結合型凝集素，許多研究表明ITLN1與腸道免疫密切相關[3， 4]，腫瘤來源的半乳糖凝集素可能對腫瘤和免疫細胞產生雙功能作用[5]。因此本研究重點探討ITLN1對結腸癌的免疫功能的影響。

本研究對TCGA的表達譜數(shù)據(jù)進行分析，評估ITLN1基因在結腸癌的表達和預后，通過GSEA基因集富集分析尋找與ITLN1表達相關的調通通路和生物學功能，并使用CIBERSORT算法探索了ITLN1基因的表達與結腸癌組織中浸潤的免疫細胞的相關性。

1 資料與方法

1.1數(shù)據(jù)獲取

從TCGA數(shù)據(jù)庫（https：//cancergenome.nih.gov/）下載結腸癌患者的表達譜測序數(shù)據(jù)及臨床數(shù)據(jù)。去除臨床信息中生存時間缺失和生存時間小于30天的樣本，比對臨床和表達譜的樣本去除不重合的樣本，最后423個癌癥樣本和41個癌旁樣本被納入我們的分析。

1.2 差異表達分析及生存分析

我們從表達譜文件提取了ITLN1的表達值，R軟件中的非參數(shù)檢驗wilcox.test來進行COAD組和正常組的差異性檢驗。根據(jù)ITLN1的表達值的中位數(shù)為界，將患者分為高或低表達兩組，Kaplan-Meier（KM）生存分析被用于評估ITLN1基因表達對預后的影響。

1.3基因富集分析

為了鑒定ITLN1發(fā)揮的生物學功能，把表達譜數(shù)據(jù)按照ITLN1的表達量按上1/4與下1/4作為高低表達組，使用基于JAVA軟件的GSEA v3.0來鑒定ITLN1的下游調控通路，設定顯著性閾值P<0.05以及錯誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）<0.25，基因集設為KEGG.SYMBOL.gmt。

1.4 CIBERSORT算法分析ITLN1基因與結腸癌的免疫相關性

采用CIBERSORT評估了ITLN1不同表達組中22種免疫細胞類型的組成，包括7種T細胞類型、幼稚和記憶B細胞、漿細胞、NK細胞和骨髓亞群。P <0.05時納入分析。

1.5統(tǒng)計分析

生物信息學分析均使用R（v 3.5.1）軟件進行，KM生存分析由“survival” R軟件包完成。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 ITLN1基因在結腸癌中表達顯著降低

在TCGA數(shù)據(jù)庫中，與相鄰正常組織相比，ITLN1基因在結腸癌組織的表達水平降低（P <0.05;圖1A）。進行 Kaplan-Meier分析，結果發(fā)現(xiàn)ITLN1表達較低的患者相比，ITLN1表達較高的患者生存時間顯著延長（P<0.05;圖1B）。

圖1 ITLN1基因的表達和預后

2.2基因集富集分析

GSEA富集分析結果提示ITLN1基因高表達樣本富集到造血細胞系、用于IGA生產的腸道免疫網絡等免疫相關基因集（圖2）。

圖2 ITLN1的富集基因集和相關蛋白網絡圖

2.3 ITLN1表達水平與免疫細胞亞型的相關性

CIBERSORT分析結果發(fā)現(xiàn)ITLN1基因高表達組的漿細胞、靜止的CD4記憶T細胞、M2巨噬細胞、嗜酸性粒細胞浸潤程度明顯增高，而M0巨噬細胞浸潤程度明顯降低（圖3）。

圖3 用于比較ITLN1基因高表達組和低表達組之間的免疫細胞比例的小提琴圖

3 討論? ??

一系列研究表明ITLN1在腫瘤發(fā)生的潛在作用。ITLN1通過調節(jié)肝癌細胞中Sirt1依賴性p53脫乙酰基作用促進細胞凋亡[6]。體內外實驗發(fā)現(xiàn)，ITLN1通過失活磷酸肌醇3-激酶/ AKT / Ikappa B激酶信號傳導來減弱胃癌細胞中抑制HNF4α表達的轉錄因子核因子-κB的活性，抑制胃癌的進展，ITLN1與胃癌患者的生存期延長有關[7]。此外，人ITLN-1和小鼠intelectin-1（mITLN-1）可能在針對所選微生物或外源抗原的防御中發(fā)揮免疫學作用[3]。本研究發(fā)現(xiàn)ITLN在結腸癌表達明顯降低，是結腸癌的保護因子。

腸道某些細菌通過促進促炎性細胞因子（如干擾素-γ和白介素-17A）的產生而引發(fā)類似效應子的免疫反應，而其他細菌則促進調節(jié)性CD4 T細胞的產生，并有助于腸道穩(wěn)態(tài)。微生物群對B細胞也有深遠的影響。腸道微生物暴露導致B細胞庫的持續(xù)多樣化，并產生T依賴性和非依賴性抗體，尤其是IgA[8]。GSEA富集分析結果表明ITLN1參與多條免疫相關通路。我們推測ITLN1可能參與免疫調節(jié)，我們使用CIBERSORT，一種反卷積算法[9]評估ITLN1表達值組別與免疫細胞亞型之間的關聯(lián)。結果發(fā)現(xiàn)ITLN1高表達時漿細胞、M2巨噬細胞浸潤程度明顯增高，而M0巨噬細胞浸潤程度明顯降低。本研究發(fā)現(xiàn)ITLN1可能是在將幼稚B細胞成熟成分泌IgA的成熟漿細胞中發(fā)揮作用，是維持腸道免疫穩(wěn)態(tài)的關鍵因素之一。腫瘤相關的巨噬細胞（TAM）是另一個非常重要的免疫種群，可促進或阻斷腫瘤的發(fā)展。巨噬細胞不同亞型（M0，M1和M2）都具有不同的免疫功能。M2巨噬細胞參與Th2型免疫應答，抑制T細胞增殖和分化，并促進腫瘤細胞增殖和腫瘤基質的血管生成[10]。大量文獻亦報道intelectins成員在炎癥及免疫應答方面發(fā)揮重要調節(jié)作用[5， 11]。