張柏林，李 巖，朱雪琴，蔣英英，，陳萬濤

口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)是全球范圍內重要的致死性頭頸惡性腫瘤之一[1-2]。傳統(tǒng)治療方法往往存在預后效果差、臨床易復發(fā)等多種問題。免疫治療作為一種新型的腫瘤治療手段，療效持久，不良反應低，對多種腫瘤治療效果顯著，受到國內外廣泛關注。目前，程序性死亡蛋白1及其配體(programmed cell death1/programmed cell death 1 ligand，PD-1/PD-L1)和細胞毒性T淋巴細胞抗原(cytotoxic T lymphocyte antigen 4，CTLA-4)是免疫檢查點領域中的研究熱點[3-5]。PD-1單抗藥物在治療黑色素瘤、肺癌、前列腺癌等惡性腫瘤中也取得了顯著效果[6]。近期臨床試驗表明，PD-1對頭頸部鱗癌術后復發(fā)與轉移的治療也表現(xiàn)出令人滿意的療效，且安全性和耐受性良好，但關于PD-1與口腔黏膜鱗癌發(fā)展進程的研究少有報道[7]。本研究旨在探討免疫檢查點PD-1與小鼠口腔黏膜鱗癌發(fā)展的相關性，為口腔黏膜鱗癌的免疫治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和主要儀器

C57BL/6(H-2b)成年野生型小鼠購自上海斯萊克實驗動物有限公司，4-硝基喹啉-1-氧化物(4-nitroquinoline-1-oxide，4NQO)購自美國Sigma公司，F(xiàn)ITC Anti-Mouse CD4、APC Anti-Mouse CD279(PD-1)均購自美國BD公司，PrimescriptTMRT reagent Kit、SYBR?Premix Ex TaqTM均購自日本Takara公司，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。流式細胞儀購自美國FACSCaliburBD公司，實時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠口腔鱗癌模型建立 本研究綜合相關文獻報道與實驗室前期研究結果，取8～10周齡成年野生型小鼠10只，隨機分為實驗組和對照組兩組，每組各5只。實驗組小鼠在飲水中加入100 mg/L的4NQO，飼喂20周(每周更換1次)后換成正常飲水；對照組小鼠給予正常飲水。28周后模型誘導結束[8-9]。處死、解剖小鼠，取舌、脾組織，10%甲醛溶液固定，組織病理切片、HE染色，顯微鏡下觀察并比較其病理變化。實驗組小鼠口腔鱗癌誘導成功率100%；對照組小鼠均無口腔鱗癌發(fā)生。

1.2.2 實時逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR) 取實驗組小鼠5只舌部病變黏膜組織，對照組小鼠5只舌部相同位置黏膜組織，研磨，加入1 mL TRIzol，提取總RNA。經紫外分光光度儀檢測A260/A280比值，驗證RNA純度和濃度。根據(jù)試劑盒說明書合成cDNA，進行Real-time PCR。反應體系如下：SYRB Green Master mix 10 μL，ROX Reference Dye Ⅱ(50×)0.4 μL，上下游引物各0.4 μL，cDNA 2 μL，補水至 20 μL。反應條件為：預熱；95 ℃，35 s變性，60 ℃ 34 s退火延伸，42次循環(huán)。每個樣本重復3次。用2-ΔΔCt法計算相對值用于數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析。所用引物序列見表1。

表1 Real-time PCR引物

1.2.3 流式細胞術 取實驗組、對照組小鼠各3只，將小鼠安樂死后，取出舌部病變組織、脾臟、引流淋巴結2對，制成組織單細胞懸液。每個樣本取2×106個細胞行流式細胞術，加入50 μL CD4-FITC和PD-1-APC流式抗體混合液，冰箱避光染色15 min，加入400 μL PBS溶液，高速離心后棄上清，加入250 μL PBS溶液重懸，將樣本轉移到流式管中上機檢測，在流式細胞儀控制軟件中圈門選出CD4+T細胞群，檢測其PD-1的平均熒光強度。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 流式數(shù)據(jù)采用Novoexpress軟件進行分析，采用GraphPad Prism 8.0軟件對Real-time PCR數(shù)據(jù)進行作圖與分析，組間樣本均數(shù)的統(tǒng)計學分析采用t檢驗法，P<0.05差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 成功建立小鼠口腔鱗癌模型及組織病理學評價

在成年小鼠的飲水中加入100 mg/L濃度的4NQO，飲水暴露20周后，觀察到28周，成功誘導小鼠發(fā)生口腔鱗癌(圖1A)。處死小鼠后，取舌組織和脾臟組織用于后續(xù)研究。形態(tài)學結果顯示：對照組小鼠舌背黏膜呈粉紅色，富有彈性，舌乳頭分布均勻，舌體柔軟，無白斑樣改變；4NQO組小鼠舌背黏膜粗糙不平，廣泛白色斑塊樣改變，可見數(shù)個白色外生性腫物，表面光滑，未見潰瘍和壞死舌。4NQO組小鼠脾臟色暗紅，充血，體積明顯小于對照組小鼠(圖1B)。組織病理學結果顯示：對照組小鼠舌背黏膜上皮為角化的復層鱗狀上皮，層次清楚，細胞排列正常，未發(fā)現(xiàn)上皮異常增生等變化，上皮和肌層之間為薄層結締組織，無明顯炎細胞浸潤；4NQO組小鼠舌背病變組織呈外生性生長，棘層可見癌細胞團，細胞及核異形性明顯，核分裂像明顯，基底層完整，腫瘤細胞未發(fā)生基底下浸潤，上皮與基層之間可見炎細胞浸潤。對照組小鼠脾臟白髓、紅髓清晰可見，界限明顯，紅髓分布于白髓及邊緣區(qū)的外側，邊緣區(qū)結構清晰，把白髓和紅髓間隔開；淋巴細胞染色呈深藍色；4NQO組小鼠脾臟白髓減少或消失，紅髓、白髓界限模糊，淋巴細胞染色呈深藍色，廣泛浸潤，數(shù)量增多(圖1C)。

A：小鼠口腔鱗癌模型的建立; B：小鼠舌部、脾臟形態(tài)學改變(箭頭示); C：小鼠舌黏膜病變組織內可見癌細胞團，脾臟白髓結構改變(箭頭示，HE染色)

2.2 PD-1在小鼠口腔黏膜鱗癌發(fā)生后表達明顯升高

成功誘導小鼠產生口腔鱗癌后，取小鼠舌部病變組織，利用Real-time PCR檢測病變組織中PD-1、PD-L1基因的mRNA表達，結果顯示，4NQO誘導組小鼠PD-1的mRNA表達量明顯高于對照組小鼠(圖2A)。取小鼠的舌病變組織、脾臟、引流淋巴結等組織，制成單細胞懸液，利用流式細胞術檢測CD4+T細胞中PD-1的表達。結果顯示，4NQO誘導組小鼠舌黏膜病變組織、脾臟和引流淋巴結組織中CD4+T細胞PD-1平均熒光強度均明顯高于對照組小鼠(圖2B)。

A：對照組和4NQO組小鼠PD-1、PD-L1 mRNA的表達(*：P<0.05)；B：對照組和4NQO組小鼠舌黏膜組織、脾臟、引流淋巴結PD-1的變化

3 討 論

口腔鱗狀細胞癌是常見的頭頸部惡性腫瘤之一。據(jù)統(tǒng)計，口腔鱗癌患者經過手術、放療和化療為主的綜合治療后，其5年生存率為60%左右，而晚期患者5年生存率僅為20%～40%[10-12]。根據(jù)腫瘤細胞免疫應答反應的原理，腫瘤微環(huán)境中的樹突狀細胞在識別并捕捉具有腫瘤特異性抗原的癌細胞后，遷移至引流淋巴結，使T細胞活化，經外周血從淋巴結遷移至腫瘤部位，在識別具有腫瘤抗原的癌細胞后繼續(xù)發(fā)揮殺傷作用，使腫瘤細胞釋放出更多的抗原形成一個“免疫循環(huán)”，直至徹底清除腫瘤[13]。T細胞的活化可被負向調控分子抑制，這些負向調控分子被證實是免疫治療的“檢查點”，具有調控T細胞初級應答與二次應答的作用，而抑制此類“檢查點”蛋白(PD-1、CTLA-4)的活性，臨床治療多種腫瘤效果顯著，但具體調控的分子機制仍需深入探討[14-16]。因此，研究免疫檢查點在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的表達，對臨床診斷與治療腫瘤具有重要參考價值。

本研究應用經典化學致癌劑4NQO誘導小鼠口腔黏膜腫瘤的發(fā)生[17-18]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，4NQO飲水暴露16周后換成正常飲水再飼養(yǎng)8周，80%以上的小鼠舌部發(fā)生外生性腫瘤[9]。因此，本實驗選擇100 mg/L濃度的4NQO飲水暴露20周后更換正常飲水再飼養(yǎng)8周，與對照組小鼠相比，4NQO組小鼠的舌背黏膜出現(xiàn)多個外生性腫物，組織病理學結果顯示，模型建立成功。已有研究發(fā)現(xiàn)，舌癌患者的腫瘤組織出現(xiàn)大量T淋巴細胞和腫瘤相關巨噬細胞浸潤，并且PD-1表達顯著升高，但研究結果僅在組織中利用免疫熒光法粗略展現(xiàn)，存在一定的局限性[19]。本研究基于健康小鼠和4NQO誘導小鼠，檢測PD-1在舌部病變腫瘤組織、引流淋巴結、脾臟的變化，闡明PD-1在口腔鱗癌發(fā)生后的變化，具有重要的參考價值。對頭頸腫瘤基因表達譜的研究發(fā)現(xiàn)，該種疾病患者的基因組存在高突變性，其中PI3K信號通路分子具有最高的突變率，其中PIK3CA分子是該信號通路突變率最高的基因[20]。Pik3ca基因的突變將引起AKT2、RICTOR、RAPTOR、TSC1/TSC2的表達改變，進而導致PI3K及其下游信號AKT/mTOR信號通路活化[21]。目前PI3K/AKT/mTOR相關信號抑制劑作為治療頭頸腫瘤的新藥已獲得FDA批準上市，但治療機制仍不十分明確，可結合PD-1抗體探究2種藥物的協(xié)同作用和治療效果，具有應用前景。

綜上所述，本研究檢測了PD-1在小鼠發(fā)生口腔鱗癌時的變化，發(fā)現(xiàn)與正常小鼠相比，在舌黏膜腫瘤組織、引流淋巴結、脾臟中PD-1的表達顯著升高，為口腔鱗癌免疫治療的研究提供實驗依據(jù)，對臨床具有一定的參考價值。