王國強(qiáng)，李淑麗，魏 沛，尹清強(qiáng)

（1.南陽農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，河南 南陽 473000；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002）

1 試驗(yàn)材料

1.1 試驗(yàn)時(shí)間與地點(diǎn)

試驗(yàn)于2017—2018年在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)與飼料生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)儀器

BCM-1000生物超凈工作臺，恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠），雙層氣浴振蕩器（金壇市杰瑞爾電器有限公司），離心機(jī)（上海安亭儀器廠），高速冷凍離心機(jī)（湘南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司），渦旋混合儀，PCR儀器，穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀（北京六一儀器廠），凝膠成像裝置設(shè)備（北京君意電泳設(shè)備有限公司），紫外-可見分光光度測定計(jì)（上海菁華科技儀器有限公司），PHS-2C酸度測定計(jì)（天津市得利斯實(shí)驗(yàn)分析儀器廠），磁力攪拌器（金壇市華峰儀器有限公司），臺式封閉電爐（天津市泰斯特儀器有限公司），電子分析天平，具塞試管，Dionex ICS-3000離子色譜儀等。

1.3 試驗(yàn)菌種

挑選的重組畢赤酵母轉(zhuǎn)化子。

1.4 主要試劑及培養(yǎng)基

1.4.1 試劑 木聚糖及D-木糖購自Sigma公司，小麥麩由河南德林生物股份有限公司提供，胰蛋白胨、酵母浸粉、葡萄糖等均為分析純。

1.4.2 培養(yǎng)基與溶液

1.4.2.1 培養(yǎng)基的配制

（1）YPD培養(yǎng)基：分別稱取胰蛋白胨2 g、酵母浸出物1 g，溶解到80 mL去離子水中，攪拌使其完全溶解；稱取無水葡萄糖2 g，溶解于20 mL蒸餾水中，充分?jǐn)嚢枋蛊淙芙?。?21℃、1.034 MPa條件下高壓滅菌20 min，待冷卻后將兩者混合均勻。

在胰蛋白胨和酵母浸提物的混合液中加入1.5 g瓊脂粉，與葡萄糖溶液高壓蒸汽滅菌20 min，兩者混勻后，待其溫度冷卻至50℃以下，可加入抗生素Zecoin搖勻后，將培養(yǎng)基傾倒于玻璃培養(yǎng)皿中，待其完全凝固后，封口膜密封完全后，將平板倒放在4℃冰箱，保存以備使用。

（2）含0.2%的吐溫80的YPD液體培養(yǎng)基：取2 g胰蛋白胨、1 g酵母浸粉，溶解于約80 mL去離子水中，攪拌使其完全溶解后，稱取2 g小麥麩，再加入0.2%的吐溫80，最后定容至100 mL。121℃、1.034 MPa條件下高壓蒸汽滅菌20 min備用。

1.4.2.2 溶液的配制

（1）氯化鈉溶液：濃度是1 mol/L。稱量29.22 g氯化鈉，加入含400 mL去離子水的燒杯中，充分?jǐn)嚢璐渫耆芙夂?，定容?00 mL，混合均勻后常溫保存。

（2）氫氧化鈉溶液：濃度是200 g/L。稱量20 g氫氧化鉀（NaOH），放入燒杯內(nèi)，加水溶解，待其冷卻后，定容至100 mL。

（3）木聚糖溶液：濃度為100 mg/mL。稱取1.00 g木聚糖（Sigma）、0.32 g氫氧化鈉，加 90 mL 水，磁力加熱攪拌約30 min直至木聚糖完全溶解，之后停止加熱繼續(xù)攪拌30 min，加入0.5 mL冰乙酸，測定其pH，若其偏離5.50，用乙酸或乙酸鈉溶液進(jìn)行調(diào)節(jié)，之后用乙酸-乙酸鈉溶液定容至100 mL，搖勻后，4℃冰箱避光保存，其有效期為12 h。

2 試驗(yàn)方法

2.1 不同重組酵母菌產(chǎn)酶活力的測定方法

2.1.1 粗酶液的制備

（1）量取100 μL培養(yǎng)好的畢赤酵母培養(yǎng)物，接種于含100 mL YPD液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，30℃搖床培養(yǎng)36 h。

（2）取上述培養(yǎng)物，按2%的接種比例接種到含2%麩皮的發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)，30℃振蕩培養(yǎng)，每隔12 h收集1次發(fā)酵培養(yǎng)液，3 000 r/min離心3～5 min，收集上清液作為粗酶液。

2.1.2 木聚糖酶活力的測定 將酶液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，取2.00 mL經(jīng)過37℃平衡的酶液，加入到具塞試管中，再添加DNS試劑5 mL，混合均勻后，加入2.00 mL木聚糖溶液，37℃保溫30 min后，沸水浴5 min。用水冷卻到常溫，添加水定容到25 mL，渦旋混勻后，測定吸光度標(biāo)記為空白樣吸光度。

將酶液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，取2.00 mL經(jīng)過37℃平衡的酶液，加入到具塞試管中，再添加2.00 mL木聚糖溶液，混合均勻后，37℃保溫30 min后，再加入5 mL DNS試劑，沸水浴5 min。用水冷卻到常溫，添加水定容到25 mL，渦旋混勻后，測定吸光度，標(biāo)記為酶反應(yīng)液吸光度。

木聚糖酶活力的計(jì)算：稀釋酶液的木聚糖酶活力=[（酶反應(yīng)液吸光度-空白樣吸光度）×標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率+標(biāo)準(zhǔn)曲線截距]/[木糖的摩爾質(zhì)量/酶解反應(yīng)時(shí)間]×1 000。

試樣木聚糖酶活力=稀釋酶液中的木聚糖酶活力×試樣的稀釋倍數(shù)。

2.2 培養(yǎng)時(shí)間對重組酵母產(chǎn)酶活力影響

選取木聚糖酶活力高的菌株，每隔12 h進(jìn)行取樣，測定不同時(shí)間木聚糖酶活力的變化。

2.3 木聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)的分析

2.3.1 不同溫度處理對木聚糖酶活力的影響 分別在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃處理酶液15 min，立即用冰水冷卻至室溫，測定不同溫度對木聚糖酶活力的影響。

2.3.2 不同pH處理對木聚糖酶活力的影響 配制不同pH的緩沖液和底物溶液，將酶液pH分別調(diào)至3.50、4.50、5.50、6.50、7.50、8.50、9.50，測定不同 pH對木聚糖酶活力的影響。

2.4 添加0.2%的吐溫80對木聚糖酶活力的影響

在含2%麩皮的YPD培養(yǎng)基內(nèi)，加入0.2%的吐溫80，以未加0.2%的吐溫80的發(fā)酵液作對照，測定木聚糖酶活力。

2.5 木聚糖酶對小麥中非淀粉多糖的降解

2.5.1 色譜條件 采用Dionex ICS-3000離子色譜儀，CarboPac PA10分離柱（4×250 mm）與 CarboPac PA10保護(hù)柱（4×50 mm）進(jìn)行測定。其淋洗液為50 mmol/L NaOH，設(shè)定流速為0.8 mL/min，設(shè)定柱箱的溫度為30℃，進(jìn)樣體積是25 μL。采用電化學(xué)檢測器檢測方式、脈沖安培檢測模式進(jìn)行檢測。

2.5.2 小麥的處理 將小麥進(jìn)行粉碎，留取40～60目之間的樣品備用。

2.5.3 粗酶液的制備

2.5.3.1 液體粗酶液的制備

（1）取100 μL培養(yǎng)好的含空 pGAPZαA質(zhì)粒的畢赤酵母、重組畢赤酵母、突變體畢赤酵母培養(yǎng)物，接種于含100 mL YPD液體培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶內(nèi)30℃，振蕩培養(yǎng)36 h。

（2）取上述培養(yǎng)物，按2%的接種比例接種到含2%麩皮的發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)，30℃振蕩培養(yǎng)12 h，取發(fā)酵培養(yǎng)液，1 000 r/m離心3～5 min，留取上清液作為粗酶液。

（3）將其進(jìn)行適當(dāng)稀釋，并將粗酶液的pH調(diào)整至4.50。

2.5.3.2 固體粗酶液的制備

（1）用無菌接種環(huán)挑取黑曲霉孢子，劃線接種于PDA固體培養(yǎng)基上，30℃恒溫靜置培養(yǎng)約72 h。

（2）用無菌接種環(huán)將培養(yǎng)好的孢子轉(zhuǎn)移至0.9%的生理鹽水中，配制孢子懸液，并測定其孢子濃度約為 1×109個(gè)/mL。

（3）按10%的比例，將孢子懸液接種于固體發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)，混合均勻后，30℃恒溫靜置培養(yǎng)72 h。

（4）將固體發(fā)酵產(chǎn)物和0.9%的生理鹽水按1∶10的比例進(jìn)行混合，攪拌30 min后，室溫靜置，過濾，取濾液作為粗酶液。

（5）將其進(jìn)行適當(dāng)稀釋，并將粗酶液的pH調(diào)整至4.50。

2.5.3.3 試驗(yàn)方法 將處理過的小麥和經(jīng)稀釋調(diào)整的粗酶液，按固體（g）∶液體（mL）=1∶10 的比例進(jìn)行混合，40℃，恒溫發(fā)酵培養(yǎng)2 h。3 000 r/min離心3～5 min，留取上清液作為檢測液。將檢測液經(jīng)適當(dāng)處理后上樣檢測。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同突變株產(chǎn)酶活力的測定結(jié)果

由圖1可知，突變株5、突變株7、突變株8等重組畢赤酵母的木聚糖酶活力并不是很高，只有突變株1-2、突變株4-5及突變株6-3分泌的木聚糖酶活力較高，并且突變株1-2的木聚糖酶活力顯著高于其他各組（P<0.05）。這可能是由于氨基酸的變化引起了蛋白質(zhì)變化，從而影響了酶活性的變化。同時(shí)，在同一個(gè)重組酵母中也可能由于拷貝數(shù)的不同而造成酶活力的改變。因此，選擇突變株1-2、突變株4-5及突變株6-3進(jìn)行下面的試驗(yàn)。

3.2 培養(yǎng)時(shí)間對重組酵母產(chǎn)酶活力的影響

由表1可知，突變株和原始基因分泌的木聚糖酶活力均在12 h時(shí)達(dá)到了最大值，顯著高于其他時(shí)間點(diǎn)的木聚糖酶活力（P＜0.05）。培養(yǎng)時(shí)間延長后，木聚糖酶活力不斷下降。其中突變株1-2在12 h的木聚糖酶活力達(dá)到0.148 0 U/mL，顯著高于對照組及原始基因組（P＜0.05）；同時(shí)突變株1-2在24 h、36 h的木聚糖酶活力均顯著高于其他各組（P＜0.05）。由此選擇突變株1-2進(jìn)行下面的酶學(xué)性質(zhì)分析試驗(yàn)。

表1 培養(yǎng)時(shí)間對重組酵母菌木聚糖酶活力的影響 U/mL

3.3 不同溫度處理對木聚糖酶活力的影響

突變株在40℃木聚糖酶的活力顯著高于其他溫度（P＜0.05），并顯著高于原始基因重組畢赤酵母在40℃的木聚糖酶活力（P＜0.05）。由此可見，突變株和原始基因重組酵母的最適溫度是40℃。在60℃時(shí)，原始基因重組酵母和突變株受溫度的影響水平是一致的，兩者差異不顯著，但經(jīng)過30℃、50℃、70℃、80℃和90℃的處理，原始基因重組酵母的木聚糖酶活力顯著高于突變株（P＜0.05）。圖2給出不同溫度對突變株分泌的木聚糖酶活性，以及不同溫度對含原始基因重組酵母分泌的木聚糖酶活性的影響。

以最高木聚糖酶酶活力為100%，研究不同溫度對不同菌株分泌的木聚糖酶的相對酶活的影響。由圖3可知，突變株受溫度影響較大，70℃以后，其相對酶活均小于60%。隨著溫度的上升，酶活力逐漸下降；而原始基因重組酵母的木聚糖酶活力雖然在50℃以后隨著溫度的上升而逐漸下降，但其相對酶活仍能保持較高水平。

3.4 不同pH處理對木聚糖酶活力的影響

突變株和含有原始基因重組酵母的木聚糖酶的最適pH均為5.5，顯著高于其他各pH點(diǎn)（P＜0.05）。pH在3.5、4.5時(shí)，含原始基因的重組酵母的木聚糖酶活力均顯著高于突變株的木聚糖酶活力（P＜0.05），隨著pH的上升，突變株和含有原始基因重組畢赤酵母的木聚糖酶的酶活力升到最高，之后都急劇下降，由此可見，這兩個(gè)酶在中性及堿性條件下，酶和底物的催化作用較低。圖4給出不同pH對突變株分泌的木聚糖酶活性，以及不同pH對含原始基因重組酶母分泌的木聚糖酶活性的影響。圖5為不同pH對重組酵母木聚糖酶相對酶活的影響。

3.5 添加0.2%的吐溫80對木聚糖酶活力的影響

以未添加吐溫80的培養(yǎng)基為對照組，結(jié)合圖6可知，添加0.2%的吐溫80均能顯著提高突變株和含有原始基因重組酵母的木聚糖酶活力（P<0.05）。同時(shí)突變株的木聚糖酶活力提高了約30%，而含有原始基因重組酵母的木聚糖酶活力提高了35%。

3.6 木聚糖酶對小麥中非淀粉多糖的降解結(jié)果

由表2可知，黑曲霉分泌的木聚糖酶可顯著提高葡萄糖和阿拉伯糖的產(chǎn)量，但其木糖的產(chǎn)量低于突變株（P<0.05）。原始基因重組畢赤酵母及突變株分泌的木聚糖酶與對照組相比，可顯著提高木糖的產(chǎn)量（P<0.05），抑制葡萄糖的產(chǎn)量，但阿拉伯糖的產(chǎn)量低于對照組。阿拉伯糖的含量并不是很高，這可能是因?yàn)樵蓟虻漠叧嘟湍讣巴蛔冎攴置诘哪揪厶敲竼我?，真菌分泌的木聚糖酶多樣，從而使真菌中阿拉伯糖和木糖的含量均較高；也可能是因?yàn)榘被岬母淖儗?dǎo)致酶作用位點(diǎn)發(fā)生變化，從而使原始基因重組酵母和突變株對木聚糖中阿拉伯糖殘基的降解不顯著。

表2 不同來源的木聚糖酶對小麥非淀粉多糖的降解效果 μg/mL

4 討論

在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入0.2%的吐溫80后，突變株1-2和含有原始基因重組酵母的木聚糖酶活力均顯著提高30%左右。吐溫80又稱聚山梨酯-80，是油酸酯，也是一類非離子型表面活性劑，因能增加細(xì)胞膜的通透性，促使多種酶分泌到胞外，從而促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的攝入及代謝產(chǎn)物的排出[1]。

氨基酸的不同可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)的性質(zhì)發(fā)生變化，這可能是由于蛋白質(zhì)之間的連接作用和空間結(jié)構(gòu)等的變化所致。本試驗(yàn)表明，突變株4-5的木聚糖酶活力顯著高于突變株6-3（P<0.05），同時(shí)突變株1-2的木聚糖酶活力顯著高于其余突變體（P<0.05）。這表明第116位、第43位、第34位、第179位等氨基酸的變化可能影響了蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)，從而改變了木聚糖酶的活性。突變體1-2分泌的木聚糖酶活力在12 h顯著高于含有原始基因重組酵母（P<0.05），并在其他的時(shí)間點(diǎn)也維持較高的木聚糖酶活力，這表明第117位天冬氨酸變?yōu)樘於０房赡軐δ揪厶敲傅拇呋鶊F(tuán)有積極的影響。

本試驗(yàn)表明，突變株1-2分泌的木聚糖酶最適溫度和最適pH與含有原始基因重組酵母一致，這表明氨基酸的細(xì)微變化并不能使木聚糖酶的性質(zhì)發(fā)生劇烈的改變。由試驗(yàn)可知，兩種基因的重組酵母分泌的木聚糖酶都是常溫較耐酸的蛋白質(zhì)。然而，由于此酶在50℃以后酶活力在持續(xù)下降，故而不具有耐高溫的特性，因此，該酶不適合制粒[2]和擠壓[3]。同時(shí)該酶的這種耐酸性決定著它在飼料中的應(yīng)用效果，因?yàn)轱暳现械拿钢挥型ㄟ^消化道經(jīng)過胃這種酸性環(huán)境到達(dá)小腸后才能發(fā)揮其作用[4]。這與周晨妍等[5]的研究結(jié)果一致，他認(rèn)為基因突變并未改變原始基因的最適作用溫度和熱穩(wěn)定性。Chen等[6]發(fā)現(xiàn)，通過易錯(cuò)PCR能使木聚糖酶在pH為8.0時(shí)表現(xiàn)活力，而野生酶是在這種條件下是沒有木聚糖酶活力的。鄧萍等[7]認(rèn)為重組蛋白糖基化程度的差異會影響其最適溫度，但不影響其最適pH的變化。

通過研究發(fā)現(xiàn)含有原始基因重組酵母和突變株1-2及黑曲霉所分泌的木聚糖酶可顯著提高木糖的產(chǎn)量（P<0.05），黑曲霉分泌的木聚糖酶以提高葡萄糖和阿拉伯糖產(chǎn)量為主，突變株分泌的木聚糖酶有助于木糖產(chǎn)量的提高。這與雷麗[8]的研究有所差異，他認(rèn)為添加木聚糖酶能提高阿拉伯糖、木糖殘基和葡萄糖殘基在嗉囊和肌胃中的消化率（P<0.05），使水溶性非淀粉多糖在嗉囊中的消化率顯著提升（P<0.05）。兩者有差異可能是由于氨基酸的些微變化致使酶作用位點(diǎn)發(fā)生了變化，但其具體原因還需進(jìn)一步研究才能解決。

5 小結(jié)

本研究從6個(gè)突變體中分別挑選5個(gè)重組酵母，通過對30個(gè)突變株的木聚糖酶活力進(jìn)行檢測，最終發(fā)現(xiàn)突變株1-2在12 h的木聚糖酶活力顯著高于其他各突變株，并顯著高于含有原始基因重組酵母的木聚糖酶活力。通過對突變株1-2木聚糖酶和原始酶的酶學(xué)性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，突變株1-2的最適溫度和最適pH與原始木聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)基本一致。同時(shí)也證實(shí)了加入0.2%的吐溫80可使突變株1-2和原始木聚糖酶活力均提高30%左右。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)黑曲霉分泌的木聚糖酶可顯著提高葡萄糖和阿拉伯糖的產(chǎn)量，但其木糖的產(chǎn)量低于突變株（P<0.05）。原始基因重組畢赤酵母及突變株分泌的木聚糖酶與對照組相比，可顯著提高木糖的產(chǎn)量（P<0.05），抑制葡萄糖的產(chǎn)量，但阿拉伯糖的產(chǎn)量低于對照組（P<0.05）。