韓 麗，彭 翔，嚴(yán) 峰，李 陽(yáng)，王海燕，蔡輝益，2，張廣民

（1.北京挑戰(zhàn)生物技術(shù)有限公司，北京 海淀 100081；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，北京 海淀 100081）

近年來(lái)，關(guān)于膳食纖維的研究與應(yīng)用已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。有研究表明，膳食纖維組成對(duì)動(dòng)物不同生長(zhǎng)階段的營(yíng)養(yǎng)作用表現(xiàn)不同，可解決仔豬腹瀉、母豬便秘等問(wèn)題。但目前我國(guó)對(duì)富含膳食纖維的非常規(guī)飼料資源利用并不充分，其中就包括大豆皮。大豆皮主要由半纖維素和纖維素等組成，具有膳食纖維含量高，水分、霉菌毒素、木質(zhì)素含量低，可消化程度高，產(chǎn)量大等優(yōu)勢(shì)，其不溶性碳水化合物具有調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、改善腸道健康等作用[1-2]?？梢?jiàn)，大豆皮作為一種膳食纖維原料在動(dòng)物生產(chǎn)中有很好的飼用價(jià)值。有報(bào)道稱(chēng)，大豆皮對(duì)生長(zhǎng)豬生長(zhǎng)性能和養(yǎng)分表觀消化率無(wú)不良影響，并可減少其糞便中氨氣的排放量[3]，還可降低飼料成本，開(kāi)拓飼料資源；大豆皮可提高仔豬窩均初生重、窩均斷奶重、斷奶存活率，改善母豬繁殖性能[4]。但由于大豆皮含有較多的抗?fàn)I養(yǎng)因子，導(dǎo)致其在畜禽生產(chǎn)上的應(yīng)用受到一定限制[5]。因此，基于大豆皮的產(chǎn)量?jī)?yōu)勢(shì)和使用優(yōu)勢(shì)，研究與開(kāi)發(fā)利用豆皮資源新途徑，消除其抗?fàn)I養(yǎng)因子及致敏性，提高其飼用價(jià)值具有重要意義。

目前，常用的消除大豆中抗原蛋白的處理方法主要有微生物發(fā)酵和蛋白酶酶解技術(shù)，前者是通過(guò)發(fā)酵使菌產(chǎn)生蛋白酶發(fā)揮作用；后者是利用蛋白酶制劑將抗原蛋白降解，消除其致敏性；但兩者均存在一定的弊端，如適口性差、質(zhì)量不穩(wěn)定或不易保存等問(wèn)題[6-7]。而菌酶協(xié)同發(fā)酵技術(shù)可彌補(bǔ)上述處理方法的不足，已成為現(xiàn)在發(fā)酵飼料的主流模式。筆者前期通過(guò)對(duì)酸性、中性和堿性蛋白酶進(jìn)行體外酶解試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，堿性蛋白酶酶解豆皮可顯著提高抗原蛋白降解率，消除抗原蛋白的致敏性。而植物乳桿菌在微生物體外發(fā)酵過(guò)程中可產(chǎn)生乳酸等多種活性物質(zhì)，且可降低腸道pH，抑制腸道內(nèi)有害菌生長(zhǎng)，使發(fā)酵料儲(chǔ)存時(shí)間延長(zhǎng)；而釀酒酵母菌可產(chǎn)生酒精等，使發(fā)酵料氣味香醇，改善發(fā)酵料氣味。但目前關(guān)于菌酶協(xié)同發(fā)酵技術(shù)在大豆皮上的研究報(bào)道卻相對(duì)較少。因此，本研究采用菌酶協(xié)同發(fā)酵技術(shù)，通過(guò)體外酶解發(fā)酵試驗(yàn)，評(píng)估不同堿性蛋白酶、不同發(fā)酵劑組合、不同發(fā)酵參數(shù)（加酶量、酶解時(shí)間、含水量等）對(duì)大豆皮抗原蛋白降解效果的影響，以提高大豆皮的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和飼用價(jià)值，旨在為開(kāi)發(fā)功能性膳食纖維發(fā)酵飼料提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間與地點(diǎn)

試驗(yàn)于2019年8—12月在挑戰(zhàn)集團(tuán)研究院進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用豆皮由秦皇島金海糧油工業(yè)有限公司提供；試驗(yàn)用酶制劑和試驗(yàn)用菌均由北京挑戰(zhàn)生物技術(shù)有限公司提供。試驗(yàn)用酶制劑主要有堿性蛋白酶1號(hào)、堿性蛋白酶2號(hào)、堿性蛋白酶3號(hào)和堿性蛋白酶4號(hào)，其酶活力分別為20萬(wàn) U/g、5萬(wàn) U/g、5萬(wàn)U/g、20萬(wàn)U/g；試驗(yàn)用菌主要有枯草芽孢桿菌、植物乳酸菌、釀酒酵母菌，其接菌量分別為1×108CFU/g、1×107CFU/g 和 1×105CFU/g；試驗(yàn)用培養(yǎng)基包括MRS培養(yǎng)基、胰蛋白胨、酵母浸出粉、葡萄糖、氯化鈉、糖蜜和尿素等。

1.3 試驗(yàn)儀器

Bio-rad全自動(dòng)酶標(biāo)儀；超速離心機(jī)；FOSS2300型全自動(dòng)凱氏定氮儀；pH計(jì)；恒溫振蕩器；恒溫培養(yǎng)箱；粉碎機(jī)；過(guò)濾篩；精密電子天平（精確到0.000 1 g）；封口機(jī)；烘箱等。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 發(fā)酵大豆皮相關(guān)指標(biāo)測(cè)定 按照酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白含量的快速定量檢測(cè)及計(jì)算，該試劑盒由北京龍科方舟生物工程技術(shù)有限公司提供；按照GB/T 6435—2014的方法進(jìn)行干物質(zhì)測(cè)定；用pH計(jì)測(cè)定發(fā)酵豆皮pH；采用生物傳感分析儀進(jìn)行乳酸測(cè)定。

1.4.2 菌株活化 將實(shí)驗(yàn)室保存的3種菌種按1%體積分別接種于MRS培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基或LB培養(yǎng)基中，30℃或37℃活化21 h后，按同樣的方式進(jìn)行二次擴(kuò)培，獲得枯草芽孢桿菌、植物乳桿菌和釀酒酵母菌的菌液，備用。

1.4.3 菌酶協(xié)同發(fā)酵豆皮的制備 在菌酶協(xié)同發(fā)酵豆皮試驗(yàn)中，將堿性蛋白酶、枯草芽孢桿菌、植物乳桿菌或釀酒酵母菌菌液以及糖蜜和尿素按一定比例加入到一定量的蒸餾水中混勻，并全部轉(zhuǎn)移至裝有大豆皮的發(fā)酵呼吸袋內(nèi)，混勻后封口機(jī)封口進(jìn)行發(fā)酵。其中，以加酶量200 U/g、酶解時(shí)間72 h、含水量45%、發(fā)酵溫度30℃為試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)的基礎(chǔ)參數(shù)，每個(gè)組均設(shè)3個(gè)重復(fù)，發(fā)酵結(jié)束后按照GB/T 14699.1—2005進(jìn)行采樣，55℃烘干并粉碎，過(guò)60目篩，通過(guò)上述測(cè)定方法測(cè)定發(fā)酵前后豆皮中抗?fàn)I養(yǎng)因子、乳酸或pH等指標(biāo)，并對(duì)各指標(biāo)進(jìn)行計(jì)算，進(jìn)而篩選較優(yōu)堿性蛋白酶種類(lèi)、發(fā)酵劑組合和菌酶協(xié)同發(fā)酵參數(shù)。后期試驗(yàn)根據(jù)前期試驗(yàn)所得結(jié)果進(jìn)行相關(guān)單因素調(diào)整。

1.4.4 發(fā)酵用蛋白酶的篩選 大豆皮、糖蜜、尿素、植物乳桿菌和釀酒酵母菌菌液按 100∶2∶0.5∶1∶0.01 比例添加并補(bǔ)充200 U/g的不同種蛋白酶（堿性蛋白酶1號(hào)、堿性蛋白酶2號(hào)、堿性蛋白酶3號(hào)和堿性蛋白酶4號(hào)）進(jìn)行發(fā)酵，其他發(fā)酵條件同1.4.3。

1.4.5 不同發(fā)酵劑組合的篩選 將大豆皮、糖蜜、尿素、枯草芽孢桿菌、植物乳桿菌或釀酒酵母菌菌液其中的兩種或多種按 100∶2∶0.5∶1∶1∶0.01 比例添加，制成4種不同發(fā)酵劑組合，其中發(fā)酵劑組合1包括大豆皮、糖蜜、尿素、枯草芽孢桿菌、植物乳桿菌或釀酒酵母菌；發(fā)酵劑組合2包括大豆皮、糖蜜、尿素、植物乳桿菌和釀酒酵母菌；發(fā)酵劑組合3包括大豆皮、枯草芽孢桿菌、植物乳桿菌和釀酒酵母菌；發(fā)酵劑組合4包括大豆皮、植物乳桿菌和釀酒酵母菌。每個(gè)發(fā)酵劑組合分別添加50 U/g和100 U/g兩個(gè)添加量的蛋白酶（根據(jù)1.4.4試驗(yàn)結(jié)果確定蛋白酶種類(lèi)）進(jìn)行發(fā)酵。其他發(fā)酵條件同1.4.3。

1.4.6 菌酶協(xié)同發(fā)酵工藝優(yōu)化 單因素試驗(yàn)涉及菌酶協(xié)同發(fā)酵豆皮所用堿性蛋白酶加酶量（50 U/g、100 U/g和 200 U/g），酶解時(shí)間（24 h、48 h 和 72 h），含水量（40%、45%或50%）的篩選。根據(jù)上述篩選結(jié)果進(jìn)行發(fā)酵參數(shù)優(yōu)化試驗(yàn)，其他發(fā)酵條件同1.4.3。

1.5 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 18.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA）和LSD法多重比較，數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同蛋白酶發(fā)酵大豆皮對(duì)其抗原蛋白降解效果的影響

由表1可知，4種蛋白酶酶解大豆皮72 h時(shí)，與其他3種酶相比，蛋白酶3號(hào)對(duì)大豆皮中球蛋白降解效果顯著提高（P<0.05）；而與蛋白酶2號(hào)相比，蛋白酶3號(hào)對(duì)大豆皮中β-伴大豆球蛋白降解效果顯著提高（P<0.05），但與其他2種酶無(wú)顯著差異。這說(shuō)明大豆皮中添加蛋白酶3號(hào)酶解大豆皮抗原蛋白效果較佳，后期試驗(yàn)選擇蛋白酶3號(hào)進(jìn)行菌酶協(xié)同發(fā)酵工藝優(yōu)化。

表1 不同蛋白酶酶解大豆皮對(duì)其抗原蛋白降解效果的影響

2.2 不同發(fā)酵劑組合發(fā)酵大豆皮對(duì)其抗原蛋白降解效果的影響

由表2可知，當(dāng)在不同發(fā)酵劑組合中添加50 U/g或100 U/g蛋白酶3號(hào)，發(fā)酵劑組合2對(duì)大豆皮中球蛋白和β-伴球蛋白降解效果相對(duì)較佳，乳酸含量較高，pH相對(duì)較低。當(dāng)在不同發(fā)酵劑組合中添加50 U/g蛋白酶3號(hào)，其中發(fā)酵劑組合2中球蛋白和乳酸含量顯著高于發(fā)酵劑組合1、3或4（P<0.05）；當(dāng)在不同發(fā)酵劑組合中添加100 U/g蛋白酶3號(hào)，其中發(fā)酵劑組合2中β-伴球蛋白降解率和乳酸含量顯著高于發(fā)酵劑組合1、3或4（P<0.05）。這說(shuō)明大豆皮中補(bǔ)充組合為糖蜜、尿素、植物乳桿菌和釀酒酵母的發(fā)酵劑并添加蛋白酶3號(hào)進(jìn)行菌酶協(xié)同發(fā)酵可達(dá)到很好的發(fā)酵效果。因此，后期試驗(yàn)選用發(fā)酵劑組合2進(jìn)行菌酶協(xié)同發(fā)酵工藝優(yōu)化。

表2 不同發(fā)酵劑組合發(fā)酵大豆皮對(duì)其抗原蛋白降解效果的影響

2.3 菌酶協(xié)同發(fā)酵工藝優(yōu)化

2.3.1 加酶量對(duì)大豆皮抗原蛋白降解效果的影響由表3可知，在補(bǔ)充發(fā)酵劑組合2的大豆皮體系中添加100 U/g和200 U/g蛋白酶3號(hào)，并發(fā)酵48 h時(shí)，其對(duì)球蛋白和β-伴大豆球蛋白降解效果顯著優(yōu)于其50 U/g加酶量（P<0.05）；其中，當(dāng)?shù)鞍酌?號(hào)加酶量為100 U/g和200 U/g時(shí)，其球蛋白和β-伴大豆球蛋白降解率分別為81.98%和78.72%、85.18%和80.79%，且兩者降解效果差異不顯著（P＞0.05）。因此，考慮成本問(wèn)題，后期試驗(yàn)將選用加酶量為100 U/g堿性蛋白酶進(jìn)行菌酶協(xié)同發(fā)酵工藝優(yōu)化。

表3 蛋白酶不同加酶量發(fā)酵大豆皮對(duì)其抗原蛋白降解效果的影響

2.3.2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)大豆皮抗原蛋白降解效果的影響由表4可知，通過(guò)測(cè)定不同發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)大豆皮抗原蛋白含量發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵48 h和72 h時(shí)大豆皮抗原蛋白降解率顯著高于發(fā)酵24 h（P<0.05）；其發(fā)酵48 h和72 h時(shí)大豆皮球蛋白降解率分別為85.18%和87.06%，β-伴大豆球蛋白降解率分別為80.63%和82.56%，且發(fā)酵48 h與發(fā)酵72 h時(shí)大豆皮抗原蛋白降解率變化不大，因此選發(fā)酵大豆皮48 h進(jìn)行后期試驗(yàn)。

表4 酶解時(shí)間對(duì)大豆皮抗原蛋白降解效果的影響

2.3.3 含水量對(duì)大豆皮抗原蛋白降解效果的影響由表5可知，通過(guò)測(cè)定發(fā)酵大豆皮48 h其抗原蛋白含量發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵體系含水量為45%時(shí)大豆皮抗原蛋白降解率顯著高于發(fā)酵體系含水量為40%和50%?？梢?jiàn)，蛋白酶3號(hào)發(fā)酵大豆皮含水量為45%時(shí)，其發(fā)酵效果較優(yōu)。

表5 含水量對(duì)大豆皮抗原蛋白降解效果的影響

3 討論

大豆皮中含有相當(dāng)高水平的抗?fàn)I養(yǎng)因子，尤其是球蛋白和β-伴球蛋白，其含量分別約為28 mg/g和52 mg/g。有報(bào)道稱(chēng)，大豆中抗原蛋白具有很強(qiáng)的免疫原性，其可通過(guò)畜禽小腸上皮細(xì)胞的空隙進(jìn)入血液和淋巴，使機(jī)體出現(xiàn)遲發(fā)型過(guò)敏反應(yīng)[5]，促使肥大細(xì)胞釋放組胺等有害物質(zhì)，引起腸道通透性增加以及腸道絨毛萎縮等，最終造成腸道損傷，影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，不利于畜禽生長(zhǎng)[5]。而菌酶協(xié)同的發(fā)酵技術(shù)可消除大豆皮中的多種抗?fàn)I養(yǎng)因子，但其發(fā)酵效果受酶制劑種類(lèi)和發(fā)酵體系pH等因素的影響。本試驗(yàn)通過(guò)采用菌酶協(xié)同技術(shù)，對(duì)幾種堿性蛋白酶在大豆皮抗原蛋白降解效果進(jìn)行評(píng)估，發(fā)現(xiàn)不同種堿性蛋白酶對(duì)抗原蛋白作用效果不同，堿性蛋白酶3號(hào)相比其他酶對(duì)大豆皮抗原蛋白的降解效果較佳。其原因可能是因?yàn)榈鞍酌覆豢偸墙档推渖飳W(xué)致敏性，其對(duì)抗原蛋白的降解具有蛋白酶特異性，使其作用于大豆球蛋白和β-伴球蛋白各亞基或結(jié)構(gòu)[8]，從而使其得以降解；也可能是因?yàn)榈鞍酌冈诖蠖蛊ぐl(fā)酵體系中的此pH條件下具有高酶活。有報(bào)道稱(chēng)，堿性蛋白酶在堿性條件下對(duì)抗原蛋白具有較好的降解能力[7]。又由于大豆皮營(yíng)養(yǎng)成分比較單一，不利于微生物發(fā)酵。因此，本試驗(yàn)接著通過(guò)在已添加一定量蛋白酶3號(hào)的大豆皮中補(bǔ)充不同發(fā)酵劑組合以調(diào)節(jié)發(fā)酵料pH并補(bǔ)充養(yǎng)分，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵劑組合為糖蜜、尿素、植物乳桿菌和釀酒酵母時(shí)，其發(fā)酵效果較好，有效降低了大豆皮抗原蛋白含量，促進(jìn)了乳酸產(chǎn)生，并降低了發(fā)酵大豆皮pH，提高了大豆皮發(fā)酵深度，改善發(fā)酵料氣味及其品質(zhì)和穩(wěn)定性?？梢?jiàn)，菌酶協(xié)同發(fā)酵能夠有效地提高飼料品質(zhì)。這可能是因?yàn)樵诖蠖蛊ぶ薪尤肴樗峋徒湍妇扔幸婢M(jìn)行發(fā)酵[9]，可產(chǎn)生多種有益活性成分和香味物質(zhì)，達(dá)到改善發(fā)酵料產(chǎn)品品質(zhì)的目的[10]。這與張煜等[11]研究結(jié)果基本一致。蔡國(guó)林等[12]也表明，利用蛋白酶和植物乳桿菌發(fā)酵花生粕，可顯著降解大分子蛋白，提高必需氨基酸含量，改善了其品質(zhì)。

菌酶協(xié)同的發(fā)酵效果受酶制劑加酶量、酶解發(fā)酵時(shí)間和含水量等多種因素的影響。因此，本試驗(yàn)對(duì)菌酶協(xié)同發(fā)酵大豆皮的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同劑量的蛋白酶3號(hào)對(duì)大豆皮中球蛋白和β-伴大豆球蛋白有不同程度的酶解效果，表現(xiàn)為隨著加酶量的增加其抗原蛋白降解率隨之增加。這可能是因?yàn)榈孜锪恳欢?，隨著酶添加量的不斷增加，酶與底物的結(jié)合效率也不斷增加，從而引起抗原蛋白降解率的增加[13]。本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)添加100 U/g和200 U/g的蛋白酶3號(hào)對(duì)球蛋白和β-伴球蛋白降解效果差異不大，前者球蛋白和β-伴球蛋白降解率分別為81.98%和78.72%，后者球蛋白和β-伴球蛋白降解率分別為85.18%和80.79%。這可能是因?yàn)楫?dāng)酶添加量過(guò)量時(shí)，酶分子趨于飽和，可能出現(xiàn)酶分子自身水解現(xiàn)象，造成酶對(duì)底物的作用減弱，對(duì)抗原蛋白的去除貢獻(xiàn)不大，這與前人的研究基本一致[13]。另外發(fā)現(xiàn)，蛋白酶3號(hào)對(duì)大豆皮球蛋白的酶解效果相對(duì)較好。這可能是因?yàn)榈鞍酌?號(hào)能破壞其中的二硫鍵，作用于球蛋白各亞基更好地發(fā)揮降解作用?？梢?jiàn)，菌酶協(xié)同的發(fā)酵技術(shù)確實(shí)是去除抗原蛋白的有效方法，考慮成本問(wèn)題，選擇蛋白酶3號(hào)加酶量100 U/g為宜。

蛋白酶酶解效果受酶解時(shí)間的影響，為了使蛋白酶3號(hào)能在適宜的時(shí)間范圍內(nèi)發(fā)揮最大的酶解效率，我們對(duì)酶解時(shí)間進(jìn)行了研究。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同酶解時(shí)間對(duì)抗原蛋白的降解程度不同，且隨著蛋白酶3號(hào)酶解時(shí)間的延長(zhǎng)其抗原蛋白降解率隨之增加，但酶解超過(guò)48 h以后，延長(zhǎng)酶解時(shí)間對(duì)蛋白酶的酶解效率影響較小。這可能是因?yàn)槭请S著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，酶解底物濃度降低，酶反應(yīng)速度逐漸下降，再加上酶解體系pH降到低于酶最適pH，酶解反應(yīng)將會(huì)受到抑制[14]。大豆皮抗原蛋白的降解效果同時(shí)受含水量的影響。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)發(fā)酵體系含水量進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，大豆皮中抗原蛋白的降解受含水量的影響顯著，且發(fā)酵體系含水量45%時(shí)其對(duì)抗原蛋白的降解效率較優(yōu)；并發(fā)現(xiàn)酶解效率隨含水量的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。這可能是因?yàn)榘l(fā)酵體系含水量從50%降到45%過(guò)程中，有利于酶與底物結(jié)合，但當(dāng)含水量從45%降到40%時(shí)，酶解體系滲透液相應(yīng)減少，導(dǎo)致酶解反應(yīng)速率減緩[14]。有報(bào)道稱(chēng)，微生物發(fā)酵大豆皮可提高粗蛋白質(zhì)含量、降低粗纖維含量和脲酶活性，進(jìn)而提高大豆皮的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[15]?？梢?jiàn)，本研究利用菌酶協(xié)同的發(fā)酵技術(shù)，通過(guò)對(duì)發(fā)酵參數(shù)和發(fā)酵體系pH等進(jìn)行優(yōu)化，可將大豆皮中的球蛋白和β-伴球蛋白等抗?fàn)I養(yǎng)因子有效去除，并可增加其適口性，提高大豆皮產(chǎn)品品質(zhì)及儲(chǔ)存穩(wěn)定性，以改善動(dòng)物腸道健康，提高其飼用價(jià)值。

4 結(jié)論

在本試驗(yàn)條件下，采用菌酶協(xié)同厭氧發(fā)酵模式，綜合考慮了抗原蛋白降解情況、發(fā)酵深度、產(chǎn)酸情況、發(fā)酵料氣味，以及發(fā)酵工藝成本等，最終確定的發(fā)酵劑組合為糖蜜、尿素、植物乳桿菌和釀酒酵母菌；工藝條件為：植物乳桿菌1%，釀酒酵母菌0.01%，加酶量為100 U/g，發(fā)酵時(shí)間為48 h，含水量45%，發(fā)酵溫度為30℃時(shí)，其對(duì)大豆皮發(fā)酵效果較優(yōu)，可有效消除其抗?fàn)I養(yǎng)因子，改善發(fā)酵料品質(zhì)、適口性、減少染霉風(fēng)險(xiǎn)，且產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，可拓寬大豆皮在動(dòng)物飼糧中的應(yīng)用，以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)。