孫永波，王亞，薩仁娜，張宏福

GC-MS分析慢性氨氣應(yīng)激對肉雞血清代謝物的影響

孫永波，王亞，薩仁娜，張宏福

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所/動物營養(yǎng)學(xué)國家重點實驗室，北京 100193）

【目的】隨著養(yǎng)殖業(yè)集約化和規(guī)?；陌l(fā)展，舍內(nèi)環(huán)境對畜禽生長的影響日益突出。在密閉舍飼條件下，不斷產(chǎn)生有毒有害氣體，其中氨氣的危害最大，降低畜禽生產(chǎn)性能，威脅動物健康。為此開展慢性氨氣應(yīng)激對肉雞血清代謝物影響的研究，從小分子物質(zhì)和代謝途徑方面探究氨氣導(dǎo)致機體代謝發(fā)生的變化，為舍內(nèi)氨氣的合理調(diào)控提供數(shù)據(jù)支持?！痉椒ā吭囼灢捎脝我蛩赝耆S機設(shè)計，將96只21日齡健康A(chǔ)A肉雞隨機分成對照組和試驗組，每組設(shè)4個重復(fù)，每個重復(fù)12只雞。對照組氨氣濃度為0 mg·kg-1，試驗組氨氣濃度為45 mg·kg-1。試驗在人工模擬呼吸艙內(nèi)進行，呼吸艙采用全自動化控制溫濕度等養(yǎng)殖條件，采用網(wǎng)上平養(yǎng)，自由采食和飲水，24h 光照，試驗期為21d。在肉雞42日齡時，從每個重復(fù)中隨機抽取2只，翅靜脈采血，分離血清。將血清樣品預(yù)處理后，采用氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（gas chromatograph tandem mass spectrometer technology, GC-MS）檢測代謝產(chǎn)物，利用質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫對其進行鑒定。通過主成分分析、偏最小二乘法判別分析、正交偏最小二乘法判別分析、t-檢驗等，尋找差異代謝物，并利用生物信息學(xué)方法對差異代謝物進行通路富集分析。【結(jié)果】（1）利用 GC-MS 方法，結(jié)合質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫對檢測到的代謝物進行快速鑒定，在肉雞血清中共檢測到204種代謝物。將代謝組數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P軟件進行多元統(tǒng)計分析，結(jié)合-檢驗篩選出 23種差異代謝物，其中上調(diào)19個，下調(diào)4個。（2）差異代謝物主要涉及能量代謝（乳酸、α-酮戊二酸）、氨基酸代謝（L-別蘇氨酸、L-高絲氨酸、煙酰甘氨酸）、脂肪酸代謝（硬脂酸、亞麻酸、亞油酸、膽固醇）以及核苷酸代謝（次黃嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶）等。（3）代謝通路富集分析表明，氨氣應(yīng)激主要影響了肉雞血清的脂肪代謝通路，如亞油酸代謝、花生四烯酸代謝以及α-亞麻酸代謝?！窘Y(jié)論】GC-MS較為全面地檢測到血清的代謝物，能夠準(zhǔn)確地篩選出差異代謝物，同時慢性氨氣應(yīng)激顯著影響肉雞的血清代謝物含量，主要影響脂肪代謝通路，為闡明氨氣應(yīng)激影響營養(yǎng)代謝的機制提供參考。

肉雞；代謝組學(xué)；血清；代謝物；氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)

0 引言

【研究意義】血液理化指標(biāo)能夠反映動物的健康狀況，分析肉雞血液指標(biāo)的變化情況能夠了解其生理狀態(tài)[1]。由于糞便和墊料等含氮有機物的發(fā)酵，畜禽舍內(nèi)持續(xù)性的存在低濃度的氨氣。動物經(jīng)呼吸作用吸入氨氣，一部分直接與呼吸系統(tǒng)黏膜接觸并溶于黏膜表面，一部分通過肺泡的氣血屏障進入血液循環(huán)[2]。因此，通過測定長期氨氣應(yīng)激肉雞的血清代謝物的變化，對于了解氨氣的有害作用及對肉雞代謝通路的影響，分析其對畜禽健康影響的作用機制，進而科學(xué)調(diào)控養(yǎng)殖環(huán)境具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】氨氣是一種無色、強刺激性的有毒氣體，是畜禽舍內(nèi)危害較大的氣體，長期氨氣應(yīng)激損害動物的健康、誘發(fā)各種疾病[3-4]。氨氣通過呼吸作用到達肺泡，然后進入血液，與血液中的血紅蛋白結(jié)合，使血紅素變?yōu)檎F血紅素，進而降低血紅蛋白的攜氧能力，降低畜禽的抵抗力[5]。隨著雞舍氨氣濃度的升高，血清GSH-Px活性呈二次曲線降低，CAT活性呈線性降低[6]。氨氣應(yīng)激顯著降低肉雞的抗氧化能力，使血液中抗氧化酶活性降低，丙二醛含量升高[7]。BORELL等[8]研究報道，50mg·kg-1濃度氨氣導(dǎo)致保育豬血液中巨噬細胞數(shù)量、淋巴細胞數(shù)量及皮質(zhì)酮含量顯著增加。WEI等[9]研究表明，70 mg·kg-1濃度氨氣導(dǎo)致肉雞血清球蛋白含量和溶菌酶活性降低。宋弋等[10]發(fā)現(xiàn)，高濃度氨氣顯著降低肉雞血液中溶菌酶活性以及NK細胞殺傷活性。氨氣應(yīng)激還影響血液中細胞因子的含量，損害肉雞的免疫功能[11]。李聰?shù)萚12]研究舍內(nèi)不同濃度氨氣對肉雞免疫反應(yīng)的作用，發(fā)現(xiàn)50 mg·kg-1處理組顯著降低42日齡肉雞血清中IL-6以及IL-1β濃度。【本研究切入點】目前國內(nèi)外研究大多數(shù)集中在氨氣應(yīng)激對肉雞血液中少量的理化指標(biāo)的影響，缺乏系統(tǒng)性的研究。代謝組學(xué)能夠反應(yīng)機體出現(xiàn)的動態(tài)復(fù)雜的代謝應(yīng)答和變化，具備其他技術(shù)所不具備的優(yōu)勢，在近些年越來越得到廣泛的應(yīng)用[13-15]。目前，有關(guān)氨氣應(yīng)激對肉雞血清代謝物影響的研究未見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本試驗使用氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography- mass spectrum，GC-MS）技術(shù)，研究慢性氨氣應(yīng)激條件下肉雞血清中小分子代謝產(chǎn)物濃度的變化，探究氨氣對肉雞代謝的影響及可能的作用機理，從代謝方面揭示氨氣的危害性，為畜禽舍舒適環(huán)境參數(shù)的制定以及合理調(diào)控舍內(nèi)環(huán)境提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

試驗于2018年4—6月在人工呼吸代謝艙內(nèi)進行（動物營養(yǎng)學(xué)國家重點實驗室昌平基地），呼吸艙內(nèi)環(huán)境參數(shù)（如溫濕度等）通過計算機進行有效控制，使得養(yǎng)殖環(huán)境條件保持一致。本試驗利用單因子完全隨機設(shè)計，將21日齡愛拔益加（AA）雄性雛雞共96只，隨機分為2組，每組設(shè)置4個重復(fù)，每個重復(fù)有12只肉仔雞。對照組氨氣濃度為（0±3）mg·kg-1，試驗組氨氣濃度為（45±3）mg·kg-1。艙外連接氨氣瓶，通過減壓閥和流量計控制艙內(nèi)的氨氣。每個艙通過Innoval 1412紅外光聲譜氣體監(jiān)測儀實時監(jiān)測艙內(nèi)氨氣濃度，保證試驗期艙內(nèi)氨氣濃度穩(wěn)定。試驗期3周。

1.2 飼糧與管理

基礎(chǔ)飼糧為玉米-豆粕型，參照中國雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)（2004）營養(yǎng)需要量配制，代謝能和蛋白質(zhì)含量分別為12.76 MJ·kg-1和19.94%。肉雞飼養(yǎng)于單層平養(yǎng)雞籠內(nèi)，自由采食和飲水，按照AA肉雞飼養(yǎng)管理手冊進行日常管理，24 h 連續(xù)光照。

1.3 測定指標(biāo)和方法

1.3.1 樣品采集 試驗結(jié)束時（42日齡），禁食12h后在每個重復(fù)中隨機選擇2只健康肉雞，進行翅靜脈采血，收集血液，自然傾斜靜置一段時間后，進行離心，3 000r/min處理5min，分離血清后保存在-80℃冰箱中，待測。

1.3.2 樣品前處理及GC/MS 分析 肉雞血清樣品從-80℃冰箱中取出后在 4℃冰箱解凍，每管取出 80 μL血清樣品轉(zhuǎn)移至 1.5 mL EP管中；加入 10 μL的內(nèi)標(biāo)（L-2-氯-苯丙氨酸，0.3 mg·mL-1，甲醇配置），混勻。加入240 μL甲醇-乙腈（2﹕1）溶液，混勻。超聲提取后在-20℃下靜置，然后低溫離心10min（12 000 r/min，4℃），取上清液于衍生瓶中，冷凍干燥揮干樣本后加入濃度為15mg·mL-1的甲氧胺鹽酸吡啶溶液 80 μL的，混勻， 37℃肟化反應(yīng)1.5 h；然后加入80 μL的衍生試劑（含1%TMCS的BSTFA）和 20 μL的正己烷，混勻，70℃反應(yīng)1 h。最后取出樣本，室溫靜置，待上機分析。

氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀型號為7890A-5975C（Agilent,USA）。1μL衍生化后的樣品用無分流模式注入GC-MS 系統(tǒng)，經(jīng)毛細管柱分離后進入質(zhì)譜系統(tǒng)進行檢測。本試驗所用載氣是高純度的氦氣，流速設(shè)置為1.0 mL·min-1。程序升溫設(shè)置如下：初始溫度設(shè)定為60℃，以8℃·min-1的速度升溫至 310℃，并維持 6 min。電子轟擊離子源（EI）溫度設(shè)置為 230℃，四極桿溫度設(shè)置為 150℃，電子能量 70EV。掃描方式為全掃描模式（SCAN），質(zhì)量掃描范圍：m/z 在50—600；采用隨機順序進行連續(xù)樣本分析，盡量降低或避免因儀器信號波動而造成的影響。

1.4 數(shù)據(jù)分析

本試驗中GC-MS 的原始下機數(shù)據(jù)經(jīng) Chroma TOF軟件預(yù)處理，然后導(dǎo)出數(shù)據(jù)的矩陣，去除假陽性峰以及內(nèi)標(biāo)峰，去冗余以及峰合并。使用工作站軟件對每個化合物的特征離子片段譜的碎片質(zhì)荷比和豐度與 NIST 數(shù)據(jù)庫、Feihn代謝組學(xué)數(shù)據(jù)庫的標(biāo)準(zhǔn)離子片段譜庫進行比對，以及進行物質(zhì)結(jié)構(gòu)定性[16]。將數(shù)據(jù)歸一化，然后導(dǎo)入 SIMCA-P 14.0 軟件包，進行無監(jiān)督的主成分分析（PCA），偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）以及正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）。變量權(quán)重值（variable important in projection, VIP）大于 1 的變量被認為是差異代謝物。采用200 次響應(yīng)排序檢驗的方法來評價模型擬合程度。OPLS-DA 和-檢驗相結(jié)合，篩選對照組和氨氣應(yīng)激組肉雞血清的差異代謝物（VIP>1，<0.05）。利用MetaboAnalyst進行代謝通路富集分析及拓撲分析。

2 結(jié)果

2.1 代謝物總離子流色譜圖

圖1 為肉雞血清代謝物 GC-MS 的總離子流色譜圖?？梢钥闯?，氨氣應(yīng)激組與對照組肉雞血清中各種小分子物質(zhì)分離情況較好，通過與NIST 數(shù)據(jù)庫比對，共鑒定出204種代謝物。為了進一步深入分析不同處理組代謝物質(zhì)種類和含量的變化，結(jié)合多元變量分析，對差異的代謝物進行定性、定量分析并進行生物學(xué)闡釋。

2.2 主成分分析

對數(shù)據(jù)進行無監(jiān)督的PCA分析后得到得分散點圖（圖2），每個點代表一個樣本。由圖可知，對照組和氨氣應(yīng)激試驗組間不能較好地區(qū)分開。此外，該模型的R2X=0.569，Q2=0.0352，Q2<0.5（Q2>0.5表明模型擬合較好），組內(nèi)各試驗動物間分布也比較離散，需要對數(shù)據(jù)進一步分析。

2.3 偏最小二乘判別分析（PLS-DA）

為了消除其他因素的影響，采用有監(jiān)督PLS-DA分析，主要是消除組內(nèi)差異，凸顯組間差異。對肉雞血清樣本代謝組數(shù)據(jù)進行PLS-DA分析，詳見圖3。結(jié)果顯示，對照組和試驗組之間無明顯的交叉重疊部分，區(qū)分度較好（2X=0.399，2Y=0.989，Q2=0.744），說明試驗處理組長期氨氣應(yīng)激對肉雞血清代謝物的影響顯著。

圖1 肉雞血清總離子流色譜圖（A為對照組，B為試驗組）

C1代表對照組樣本1，T1代表試驗組樣本1，其他類推。下同

2.4 正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）

OPLS-DA對PLS-DA模型進行正交矯正，可以更好地區(qū)分組間差異，提高模型的有效性和解析能力。為了找出發(fā)生顯著變化的生物標(biāo)志物，對數(shù)據(jù)進行OPLS-DA分析（圖4）。由圖4可知，試驗組和對照組能夠很好地分開（2X=0.399，2Y=0.989 ，Q2=0.635），說明兩組之間的代謝物發(fā)生明顯改變。PLS-DA 模型置換檢驗（200 次迭代）的結(jié)果見圖5，2=（0.0，0.784）Q2=（0.0，-0.271），圖中所有 Q2均在2之下，且 Q2的回歸直線與 y 軸的交點在負半軸，說明OPLS-DA模型未過度擬合，是穩(wěn)健可靠的。

圖3 肉雞血清代謝物偏最小二乘判別分析圖

圖4 肉雞血清代謝物正交偏最小二乘判別分析圖

2.5 差異代謝物的篩選

OPLS-DA 分析后，根據(jù)以下條件：VIP>1，檢驗<0.05，共篩選到23個差異代謝物，其中上調(diào)19個，下調(diào)4個（表1）。由表1可知，氨氣應(yīng)激肉雞的血清代謝物α-酮戊二酸、肌醇、3-羥基丁酸、L-高絲氨酸等含量顯著升高，而次黃嘌呤、尿嘧啶、乳酸、胸腺嘧啶等含量顯著降低。主要引起了肉雞核苷酸代謝、碳水化合物代謝以及氨基酸代謝等的變化。

圖5 OPLS-DA 模型驗證圖

火山圖（圖6）中每個點代表一個代謝物，在圖中顯示了兩個重要的指標(biāo)，橫坐標(biāo)表示變化差異倍數(shù)（取以2為底的對數(shù)，試驗組/對照組），縱坐標(biāo)表示檢驗的-value（取以10為底的對數(shù)），能夠直觀且合理地篩選出試驗組和對照組間的顯著性生物標(biāo)志物。由圖6可知，氨氣應(yīng)激導(dǎo)致肉雞血清中顯著升高2倍以上的代謝物有3-羥基丁酸、反式-9-十八碳烯酸、亞麻酸、L-別蘇氨酸，顯著降低2倍以上的代謝物有胸腺嘧啶、次黃嘌呤。這些代謝物可以作為氨氣應(yīng)激對肉雞血清代謝物影響的潛在標(biāo)志物，有待進一步研究。

2.6 代謝物通路分析

對所鑒定出的顯著差異代謝物利用在線工具MetaboAnalyst 3.0進行代謝通路富集分析以及拓撲分析，篩選標(biāo)準(zhǔn)為影響因子>0.2及<0.05，結(jié)果見圖7。圖中橫坐標(biāo)Pathway impact表征由拓撲分析計算所得的代謝通路的重要性值（值越大，表明試驗處理對此代謝通路影響越大），縱坐標(biāo)?lg(P)表示代謝通路富集分析的顯著性水平。與對照組相比，氨氣慢性應(yīng)激主要影響了肉雞的脂肪代謝通路，如花生四烯酸代謝、亞油酸代謝以及α-亞麻酸代謝等。

3 討論

3.1 肉雞血清代謝譜

動物機體的代謝產(chǎn)物在基因調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及蛋白質(zhì)功能等互作網(wǎng)絡(luò)的最下游位置，是基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組等受到機體內(nèi)外雙重因素影響后的最終結(jié)果[17]。通過定性和定量分析代謝產(chǎn)物，能夠從整體上比較全面的評價動物機體功能狀態(tài)及其變化，是生物學(xué)現(xiàn)象的最終表現(xiàn)[18]。目前，代謝組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用在動物營養(yǎng)研究中已經(jīng)越來越普遍，如聶存喜等[19]研究報道了酵母發(fā)酵豆粕對肉雞脂質(zhì)代謝的影響；孫玲偉等[20]分析了臨床酮病、亞臨床酮病和健康的奶牛血漿代謝譜差異；范子玲等[21]觀測了卵巢靜止奶牛和正常發(fā)情奶牛的血漿差異代謝物；肖英平等[22]在分析了仔豬早期斷奶過程中血清氨基酸代謝譜的動態(tài)變化情況下，研究了谷氨酰胺對仔豬代謝的改善作用；AMETAJ等[23]應(yīng)用代謝組學(xué)分析了奶牛飼喂不同比例大麥谷物，瘤胃代謝產(chǎn)物的差異。GC-MS具有一系列的優(yōu)點，如其靈敏度高、分辨率高、無需衍生化處理等，能夠較為敏捷地識別代謝物并進行分析；此外，GC-MS具有較完備的數(shù)據(jù)庫供檢索，能夠同時測定有機酸、氨基酸、糖、脂肪酸等上百種化合物[24]。本試驗基于氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)研究氨氣應(yīng)激對肉雞血清代謝物的影響，獲得了大量有效的代謝物數(shù)據(jù)，結(jié)合SIMCA-P、NIST等分析軟件和數(shù)據(jù)庫能夠準(zhǔn)確的分析鑒定出204種代謝物，其中23種發(fā)生顯著變化，應(yīng)用MetaboAnalyst 3.0分析參與的代謝途徑，氨氣應(yīng)激主要影響了肉雞血清的脂肪代謝通路。本研究分析了養(yǎng)殖環(huán)境因子氨氣影響肉雞血清代謝產(chǎn)物的變化情況，為闡釋氨氣應(yīng)激影響肉雞健康的作用機制提供了依據(jù)。

每個點代表一個代謝物，紅色代表上調(diào)2倍及以上，藍色代表下調(diào)2倍及以上

A：亞油酸代謝；B：α-亞麻酸代謝；C：花生四烯酸代謝。顏色越深表明P值越小

表1 肉雞血清主要差異代謝物

“↑”表明上調(diào)“↓”表明下調(diào)；“↑” means up-regulated expression, and “↓” indicates down-regulated

3.2 長期氨氣應(yīng)激對肉雞代謝的影響

宋弋等[25]研究報道，氨氣通過呼吸道經(jīng)肺泡進入血液循環(huán)，一部分轉(zhuǎn)化為尿酸，但是大部分的氨氣存留在肉雞血液中，升高了血氨濃度。高血氨可能影響肉雞的能量代謝。乳酸是糖酵解的產(chǎn)物，本研究發(fā)現(xiàn)氨氣應(yīng)激導(dǎo)致肉雞血清乳酸含量顯著降低，表明在氨氣刺激條件下肉雞的糖酵解途徑被減弱。有研究表明，PM2.5應(yīng)激導(dǎo)致大鼠血清和肝臟乳酸含量顯著降低[26-27]。結(jié)合本試驗結(jié)果，表明環(huán)境污染可能導(dǎo)致糖酵解代謝通路發(fā)生改變，影響機體能量代謝。三羧酸循環(huán)（tricarboxylic acid，TCA）是三大營養(yǎng)物質(zhì)氧化供能的共同代謝途徑，是機體能量代謝水平的綜合反映，其中α-酮戊二酸（alpha-ketoglutarate，AKG）是TCA重要中間代謝產(chǎn)物，在能量代謝中起到關(guān)鍵作用。有研究發(fā)現(xiàn)，脂肪肝[28]或慢性心衰[29]導(dǎo)致血液中的α-酮戊二酸含量升高。本試驗結(jié)果顯示，試驗組肉雞的血清α-酮戊二酸含量顯著升高，可能由于肉雞長期緩慢吸入有害氣體，對心臟和肝臟等器官造成損傷，出現(xiàn)糖代謝和脂肪代謝紊亂。但也有研究發(fā)現(xiàn)[30]，高血氨使體外培養(yǎng)的人原代肝細胞代謝產(chǎn)物檸檬酸、α-酮戊二酸和蘋果酸等表達水平顯著降低。這種差異與處理因素、作用時間、劑量以及靶器官相關(guān)，具體途徑需有針對性的深入研究。

張西雷等[31]報道，舍內(nèi)高濃度氨氣（770 mg·kg-1）顯著升高肉雞血清總蛋白、球蛋白含量，表明高濃度氨氣影響肉雞的蛋白質(zhì)代謝。氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本組分，是機體內(nèi)許多重要的含氮化合物的前體物質(zhì)，還是構(gòu)成機體免疫系統(tǒng)的基本物質(zhì)。本研究發(fā)現(xiàn)慢性氨氣應(yīng)激導(dǎo)致肉雞血清L-別蘇氨酸、L-高絲氨酸、煙酰甘氨酸含量顯著升高。有研究表明，肝性腦病患者血清中別蘇氨酸含量升高[32]；糖尿病大鼠血清高絲氨酸含量顯著升高[33]；煙酰甘氨酸是煙酸與甘氨酸結(jié)合產(chǎn)物，是代謝綜合征的潛在生物標(biāo)志物，糖尿病患者煙酰甘氨酸含量顯著升高[34]。本試驗結(jié)果顯示，慢性氨氣應(yīng)激影響肉雞氨基酸代謝，以及肉雞糖代謝，說明氨氣影響了肝臟功能，導(dǎo)致肉雞亞健康并誘發(fā)潛在疾病。

研究表明，隨著氨氣濃度的升高，肉雞血清中高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和高、低密度脂蛋白膽固醇之比呈線性增加，當(dāng)氨氣濃度達到75 mg·kg-1時，血清中HDL-C含量顯著升高[35]；此外，氨氣應(yīng)激顯著改變?nèi)怆u腿肌脂肪酸組成，進而影響肉雞的脂肪代謝[36]。陳威妮等[37]研究報道，糖尿病患者體內(nèi)具有較高的游離脂肪。郭延生等[38]研究發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激導(dǎo)致奶牛血液亞麻酸、亞油酸、棕櫚酸等含量顯著升高，表明應(yīng)激奶牛通過增強脂肪酸β-氧化，釋放大量的能量來抵抗應(yīng)激。本試驗結(jié)果顯示，慢性氨氣應(yīng)激導(dǎo)致肉雞血清硬脂酸、亞麻酸、亞油酸、反式-9-十八碳烯酸、棕櫚酸、十八烯酸、花生四烯酸、D-甘油酸、膽固醇等含量顯著升高，脂質(zhì)代謝出現(xiàn)紊亂，這可能由于氨氣應(yīng)激導(dǎo)致能量負平衡，進而引發(fā)機體的脂肪動員。代謝物通路分析表明，氨氣慢性應(yīng)激影響了肉雞的脂肪代謝通路，主要是亞油酸代謝、α-亞麻酸代謝和花生四烯酸代謝等。此外，本試驗還發(fā)現(xiàn)慢性氨氣應(yīng)激導(dǎo)致肉雞血清中2-羥基丁酸和3-羥基丁酸含量顯著升高。2-羥基丁酸是由α-酮丁酸產(chǎn)生的，后者與蘇氨酸、蛋氨酸以及谷胱甘肽代謝有關(guān)[39]，本試驗2-羥基丁酸含量的增加可能是由于慢性氨氣應(yīng)激使肉雞氧化應(yīng)激加強[6]，后者導(dǎo)致肝臟谷胱甘肽合成增加，以及胰島素抵抗引起脂肪氧化增加引起的[40]。3-羥基丁酸是脂肪酸在肝臟氧化分解產(chǎn)生的代謝物，是線粒體氧化還原狀態(tài)的標(biāo)識物，其含量高低反映肝臟中的脂肪酸氧化以及生酮氨基酸分解代謝[41]。本試驗3-羥基丁酸水平升高，表明肝臟脂類代謝異常，可能是由于氨氣應(yīng)激引起TCA障礙而導(dǎo)致肝臟脂肪動員增加，肝外組織能量利用障礙，因此，慢性氨氣應(yīng)激與機體氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)，造成機體脂肪代謝異常。

尿酸是由嘌呤類核苷酸在酶的作用下生成的代謝物。魏鳳仙等研究表明，高氨顯著升高肉仔雞血清尿酸含量[42]。姚中磊等[43]研究報道，隨雞舍中氨氣濃度的升高，肉雞血清尿酸濃度逐漸升高。王瓊?cè)~等[30]利用人原代肝細胞建立了高血氨細胞模型，發(fā)現(xiàn)高氨處理使黃嘌呤和尿嘧啶、胞嘧啶等水平降低。本研究發(fā)現(xiàn)氨氣應(yīng)激導(dǎo)致肉雞血清次黃嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶等含量顯著降低，與上述研究結(jié)果相似，表明慢性氨氣應(yīng)激使嘌呤嘧啶代謝受到影響。

4 結(jié)論

本試驗研究了慢性氨氣應(yīng)激條件下肉雞血清小分子代謝物的改變，總共篩選到23個差異代謝物，主要涉及脂肪代謝、糖代謝、氨基酸代謝和核酸代謝等。代謝物通路分析表明，氨氣應(yīng)激主要影響了肉雞的脂肪代謝通路，為今后深入探討氨氣影響肉雞健康的機制，改善養(yǎng)殖環(huán)境，提高畜禽抗病能力提供了新的方向。

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Effects of Chronic Ammonia Stress on Serum Metabolites of Broilers Based on GC-MS

SUN YongBo, WANG Ya, SARENNA, ZHANG HongFu

(State Key Laboratory of Animal Nutrition, Institute of Animal Science/Chinese Academy of Agricultural Science, Beijing 100193)

【Objective】With the development of intensive and large-scale broiler breeding, the impact of environmental conditions on the growth of livestock and poultry has become increasingly prominent. Under high-density feeding conditions, a large amount of toxic and harmful gases is generated constantly, among which ammonia is the most harmful gas which reduces the performance of livestock and poultry and threatens animal health. The purpose of this experiment was to study the effects of chronic ammonia stress on serum metabolites in broiler chickens, and to explore the changes of metabolism caused by ammonia stress in terms of small molecules and metabolic pathways, so as to provide data support for reasonable regulation of ammonia in the poultry house. 【Method】Ninety-six 21-day-old healthy AA broilers were randomly divided into control group and experimental group by a single factor completely random design, with 4 replicates in each group and 12 chickens per replicate. The control group ammonia concentration was 0 mg·kg-1, the test group ammonia concentration was 45 mg·kg-1. The experiment was carried out in an artificial simulated respiratory chamber, which was fully automated to control the temperature and humidity and the other environmental conditions. Broilers were raised in the nets and the feed and water were provided ad libitum during the entire experimental period. The trial lasted 21 days with 24 h lighting program. They were routinely managed according to the AA broiler feeding manual and immunized according to the routine procedures. Two broiler chickens pre replicate from each treatment were chosen randomly and blood samples were collected from the wing vein at 42 day-old. After pretreatment of serum samples, the metabolites were detected by GC-MS technology, and identified by mass spectral database. Principal component analysis (PCA), partial least-squares discriminant analysis (PLSDA), orthogonal partial least squares discriminant analysis (OPLSDA) and t-test were used to find the different metabolites, and then the bioinformatics methods was used to analyze the differential metabolic pathways. 【Result】Results showed that: (1) A total of 204 metabolites were detected in serum of broiler chickens by GC-MS combining with rapid identification of the detected metabolites performed with a mass spectrometry database. Metabolomics data were imported into SIMCA-P software for multivariate statistical analysis, and then-test. Twenty-three different metabolites were identified, of which 19 were up-regulated and 4 were down-regulated. (2) Differential metabolites mainly involved energy metabolism (lactic acid, α-ketoglutaric acid), amino acid metabolism (L-Allothreonine acid, L-Homoserine, Nicotinylglycine), fatty acid metabolism (stearic acid, linolenic acid, linoleic acid, cholesterol) and nucleotide metabolism (hypoxanthine, uracil, thymine) and so on. (3) Metabolic pathway enrichment analysis showed that ammonia stress mainly affected the fat metabolism pathway in serum of broiler chickens, including linoleic acid metabolism, arachidonic acid metabolism and α-linolenic acid metabolism. 【Conclusion】 It can be seen that GC-MS can detect serum metabolites comprehensively, and screen differential metabolites accurately. Chronic ammonia stress significantly affected serum metabolites content of broilers, mainly affected fat metabolism pathway.

broiler; metabonomics; serum; metabolites；GC-MS

2019-04-29；

2019-07-03

國家重點研發(fā)計劃（2016YFD0500509）、現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金（CARS-41）、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程（ASTIP-IAS07）

孫永波，E-mail：ybsun2014@163.com。通信作者薩仁娜，E-mail：sa6289@126.com

（責(zé)任編輯 林鑒非）