向順雨，王靖，謝中玉，施煥，曹哲，江龍，馬小舟，汪代斌，張帥，黃進(jìn)，孫現(xiàn)超

一種新型銀納米顆粒的制備及其抑制煙草赤星病菌的機(jī)制

向順雨1,3，王靖1，謝中玉1，施煥1，曹哲1，江龍1，馬小舟1,3，汪代斌4，張帥5，黃進(jìn)2,3，孫現(xiàn)超1,3

（1西南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，重慶 400715；2西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，重慶 400715；3西南大學(xué)軟物質(zhì)材料化學(xué)與功能制造重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715；4重慶煙草科學(xué)研究所，重慶 400715；5重慶市煙草公司酉陽分公司，重慶 409800）

【】利用生物多糖合成銀納米顆粒，并解析其對煙草赤星病菌（）的抑制活性及機(jī)理，探索生物多糖合成銀納米顆粒的農(nóng)業(yè)應(yīng)用前景，為開發(fā)安全、高效的抗菌劑提供理論依據(jù)。采用海藻酸鈉作為還原劑與表面活性劑在水浴鍋中（65℃）一步合成銀納米顆粒（S-AgNPs）。利用透射電鏡（TEM）、掃描電鏡（SEM）、原子力顯微鏡（AFM）、紫外分光光度計(jì)（UV-vis）、Zeta電位-粒徑儀和X射線光電子能譜分析（XPS）分別對S-AgNPs粒徑、分散性、穩(wěn)定性及化學(xué)組成進(jìn)行表征分析。應(yīng)用Nano measure軟件統(tǒng)計(jì)TEM與AFM圖像中S-AgNPs的平均粒徑。采用平板生長速率法探究S-AgNPs在PDA培養(yǎng)基中濃度為0.0625、0.125、0.25、0.5、1.0 μg·mL-1時對赤星病菌菌絲生長的影響。赤星病菌在S-AgNPs濃度為1.0 μg·mL-1的液態(tài)PDA培養(yǎng)基（PDB）中培養(yǎng)后，分別通過測定菌絲的鮮重與干重、SEM觀察、電導(dǎo)率測定和考馬斯亮藍(lán)G250染色，分析S-AgNPs對菌絲生長量、形態(tài)、細(xì)胞膜通透性和菌絲可溶性蛋白含量的影響。用孢子懸浮液注射接種法測試S-AgNPs在離體煙草葉片上對赤星病的防治效果。最后通過測定S-AgNPs對鯽魚生長的影響分析海藻酸鈉合成的銀納米顆粒的安全性。S-AgNPs的TEM、SEM、AFM圖像分析表明該方法所合成的S-AgNPs具有分散性好，粒徑統(tǒng)一，穩(wěn)定性強(qiáng)等特點(diǎn)，平均粒徑為9.83 nm。生測結(jié)果顯示S-AgNPs在1.0 μg·mL-1時對煙草赤星病菌菌絲生長抑制率為83.9%。S-AgNPs處理組的菌絲鮮重與菌絲干重明顯低于清水對照組，S-AgNPs可以明顯破壞菌絲表面結(jié)構(gòu)。進(jìn)一步抑菌機(jī)制研究表明S-AgNPs主要通過抑制赤星病菌可溶性總蛋白合成而破壞其生物膜結(jié)構(gòu)，降低生物膜保水能力，快速破壞菌絲細(xì)胞膜通透性，造成大量細(xì)胞質(zhì)滲漏而抑制菌絲生長發(fā)育。最終，離體試驗(yàn)證實(shí)S-AgNPs能夠有效地抑制煙草赤星病菌侵染煙草葉片，且S-AgNPs在有效濃度（1.0 μg·mL-1）內(nèi)對鯽魚無明顯毒害作用，不影響其正常生命活動。建立的方法能夠穩(wěn)定合成分散性好，粒徑統(tǒng)一，穩(wěn)定性強(qiáng)的銀納米顆粒。該銀納米顆粒對煙草赤星病菌具有較強(qiáng)的抑制作用，可有效防治煙草赤星病，具有潛在的田間應(yīng)用前景。

銀納米顆粒；海藻酸鈉；綠色合成；煙草赤星病菌；煙草赤星??；抗菌機(jī)制

0 引言

【研究意義】我國是農(nóng)業(yè)大國，經(jīng)濟(jì)作物的種植是我國大部分農(nóng)民的主要經(jīng)濟(jì)來源。赤星病是植物生產(chǎn)中重要的葉部病害，除煙草以外，其還可對番茄、曼陀羅等作物的生產(chǎn)造成一定影響[1-3]。交鏈孢菌（）為其病原，屬半知菌亞門真菌[4]，具有潛育期短、單斑產(chǎn)孢量大，暴發(fā)迅速等特點(diǎn)[5]。赤星病菌主要危害植物葉片，使葉部產(chǎn)生大小不一的病斑，后期病斑破碎脫落，極大程度地影響植物葉片生長而降低作物品質(zhì)[6-7]。因此，提高煙草赤星病田間防治效率對增加農(nóng)業(yè)生產(chǎn)產(chǎn)值具有重大意義。【前人研究進(jìn)展】目前，生產(chǎn)上主要通過使用無毒種苗、選育抗病品種、加強(qiáng)田間管理、噴施化學(xué)藥劑等方式對赤星病進(jìn)行綜合防治[8-10]。其中，化學(xué)防治是我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中防治赤星病的主要措施之一[5]，菌核凈是我國各農(nóng)業(yè)產(chǎn)區(qū)主要使用的煙草赤星病防治藥劑。但是大量使用菌核凈以及不合理的管理方式會導(dǎo)致產(chǎn)生耐藥菌株，這為煙草赤星病的防治增加了難度[11]。銀納米顆粒由于其優(yōu)越的抗菌活性，不易產(chǎn)生耐藥性而被作為一種理想的抗菌材料被各行業(yè)廣泛研究。到目前為止，其應(yīng)用范圍已經(jīng)覆蓋到醫(yī)學(xué)器械消毒、醫(yī)用抗菌劑、食品包裝、水體消毒等多領(lǐng)域[12-15]。但研究發(fā)現(xiàn)，銀納米顆粒的合成方式一直是影響其抗菌效果以及生物相容性的直接因素。在諸多合成方法中，銀納米顆粒的綠色合成由于具有合成條件溫和，不產(chǎn)生有毒副產(chǎn)物等優(yōu)勢而備受關(guān)注。ELBESHEHY等曾用短小芽孢桿菌（）、波斯芽孢桿菌（）、地衣芽孢桿菌（）3種土壤細(xì)菌還原銀離子而成功制備出對于人體致病真菌、細(xì)菌以及大豆花葉病毒（）具有良好抑制作用的銀納米顆粒[16]。但現(xiàn)有的綠色合成銀納米顆粒的方法難以實(shí)現(xiàn)控制銀納米顆粒穩(wěn)定性與粒徑統(tǒng)一進(jìn)而影響其抗菌活性[17-18]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】羧基與銀納米顆粒具有強(qiáng)烈的配對作用，且海藻酸鈉表面活性羥基具有一定的還原性。本研究基于此，利用海藻酸鈉表面羥基還原銀離子生成銀顆粒，而后其表面羧基迅速與銀納米顆粒產(chǎn)生配對作用使海藻酸鈉包裹銀納米顆粒以控制銀納米顆粒粒徑，增加銀納米顆粒穩(wěn)定性，防止銀納米顆粒聚沉，從而長時間保持較高的抗菌活性。【擬解決的關(guān)鍵問題】明確海藻酸鈉-銀納米顆粒（S-AgNPs）抗菌活性與抑制煙草赤星病菌的機(jī)理，為銀納米顆粒的制備及銀納米顆粒在植物葉部病害防控中的作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2019年在西南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院完成。

1.1 材料

煙草K326由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所贈予，氨水、鹽酸（濃度為1.18 g·mL-1）、NaCl、葡萄糖均購自重慶川東化工有限公司，乙二醇購自重慶北碚精細(xì)化工廠，高碘酸鈉購自成都市科龍化工試劑廠，海藻酸鈉（SA）（黏度200±20 mpa·s）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，瓊脂購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)責(zé)任有限公司，考馬斯亮藍(lán)G250購自上?？道噬锟萍加邢薰尽?/p>

紫外分光光度計(jì)PGENERAL（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司），布魯克納米表面儀（BRUKER，布魯克（北京）科技有限公司），離心機(jī)（Sartorius stedim，德國賽多利斯集團(tuán)），透射電鏡（JEM-1200EX Japan JEOL，捷歐路（北京）科貿(mào)有限公司），掃描電鏡（su8020，日本日立公司），Zeta粒徑分析儀（ZS90，英國馬爾文公司），冷凍干燥機(jī)（FD-1A-50，上海豫明儀器有限公司），電導(dǎo)儀（DDS-11C，青島明博環(huán)保科技有限公司），水浴鍋（Keelrein，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 海藻酸鈉合成銀納米顆粒

稱取0.02 g海藻酸鈉，用5 mL蒸餾水完全溶解備用。0.04 g硝酸銀溶于2 mL水中然后逐滴加入2%氨水溶液直到看到黃色絮狀物消失停止滴加，將海藻酸鈉溶液加至銀氨溶液并在65℃水浴中反應(yīng)6 min，得到粒徑為10 nm左右的銀納米顆粒，并在12 000 r/min，4℃條件下離心5 min，離心3次后將沉淀溶解在超純水中備用。

1.3 表征方法

采用透射電鏡（TEM）、原子力顯微鏡（AFM）、掃描電鏡（SEM）觀察S-AgNPs的形貌特征、粒徑分布；用紫外分光光度計(jì)獲得S-AgNPs的紫外-可見吸收光譜；Zeta粒徑分析儀測試S-AgNPs的粒徑與電位；SEM觀察S-AgNPs處理后的赤星病菌菌絲。

1.4 S-AgNPs抑菌作用測定

制作PDA培養(yǎng)基[19]，并將已知原始濃度的S-AgNPs添加到PDA中，使PDA培養(yǎng)基中S-AgNPs的濃度分別為0.0625、0.125、0.25、0.5、1.0 μg·mL-1，移入直徑為0.8 cm的赤星病菌菌餅（病菌生長5 d后移接），清水為空白對照。當(dāng)對照板中菌絲體的生長到達(dá)培養(yǎng)皿的邊緣時，計(jì)算抑制率，每個處理設(shè)置3次重復(fù)。抑制率（%）=100×（清水對照組菌圈直徑-處理組菌圈直徑）/清水對照組菌圈直徑。

1.5 S-AgNPs菌絲抑制作用測定

制作PDB培養(yǎng)基（不帶瓊脂的PDA培養(yǎng)基），即將液體滅菌后，分裝在錐形瓶中，每瓶100 mL培養(yǎng)基，并在每個錐形瓶中移入10個0.8 cm的培養(yǎng)5 d的赤星病菌菌餅，然后28℃，180 r/min的搖床中黑暗培養(yǎng)2 d后加入S-AgNPs，使S-AgNPs在PDB培養(yǎng)基中的濃度分別為0、1.0 μg·mL-1，繼續(xù)在28℃，180 r/min搖床中黑暗培養(yǎng)4 d后用三層紗布收集菌絲，并用滅菌水洗滌2—3次后用濾紙吸干表面水分后稱重（鮮重）。將收集好的菌絲冷凍干燥后稱重（干重），統(tǒng)計(jì)各處理組菌絲質(zhì)量，每個處理設(shè)置3次重復(fù)。

1.6 細(xì)胞通透率測定

培養(yǎng)基制作及菌餅放置方法同1.5，在28℃，180 r/min的搖床中黑暗培養(yǎng)6 d后收集菌絲并冷凍干燥。稱取100 mg冷凍干燥的菌絲于試管中，加入S-AgNPs并定容至10 mL，使試管中S-AgNPs溶液濃度分別為0、1.0 μg·mL-1。并分別在0、5、10、15、20 min后用電導(dǎo)儀測試各處理組電導(dǎo)率。等待測試期間在25℃，160 r/min搖床中培養(yǎng)。若細(xì)胞膜通透性被破壞，細(xì)胞質(zhì)將泄漏到細(xì)胞膜外，可通過測試細(xì)胞膜外溶液DNA或RNA濃度來判斷細(xì)胞膜通透性受影響程度。因此，待測完電導(dǎo)率后，將每處理組的菌絲去除掉，收集培養(yǎng)液，并用紫外分光光度計(jì)在260nm測定每處理組溶液中DNA的含量，每個處理設(shè)置3次重復(fù)。

1.7 可溶性蛋白含量測定

菌絲收集方法同1.5，將收集好的菌絲冷凍干燥后備用。取0.25 g菌絲，液氮冷卻滅菌好的研缽體后加入0.025 mol·L-1的Tris-HCl 2 mL研磨菌絲至糊狀。12 000 r/min，4℃離心15min，收集上清液備用。然后取上述蛋白質(zhì)粗提液0.2 mL，加入考馬斯亮藍(lán)G-250染色液5 mL，25℃環(huán)境下靜止3 min后在595 nm處測其吸光值?？捡R斯亮藍(lán)G250染液配制方法：稱取考馬斯亮藍(lán)G-250 100 mg，用50 mL 95%乙醇溶解后加入100 mL 85% m/v磷酸溶液，去離子水定容至1 L，每個處理設(shè)置3次重復(fù)。

1.8 離體葉片病害控制效果測定

選用煙草品種為K326（40d煙齡）。分別用不同濃度的S-AgNPs（0.125、0.25、0.5、1.0 μg·mL-1）噴施葉面，每株噴灑50mL，每個濃度5株重復(fù)。噴施24 h后選取第4、5位葉片并用注射孢子懸浮液法（106個/mL）接種赤星病菌。在28℃恒溫培養(yǎng)箱保濕培養(yǎng)3d后觀察葉片發(fā)病情況。病害分級標(biāo)準(zhǔn)0級：全葉無病，1級：病斑面積占葉面積1%以下，3級：病斑面積占葉面面積2%—5%，5級：病斑面積占葉面面積6%—10%，7級：病斑面積占葉面面積11%—20%，9級：病斑面積占葉面面積21%以上。依據(jù)赤星病葉面病害分級標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算其病情指數(shù)：病情指數(shù)=100×Σ（各級病斑數(shù)×相應(yīng)級數(shù)值）/（病斑總數(shù)×最大級數(shù)），每個處理設(shè)置3次重復(fù)。

1.9 S-AgNPs的水體安全性

選擇若干條長度為3—4cm的鯽魚，配置好體積為1 L濃度為1.0 μg·mL-1的S-AgNPs并在其中放入10條生長良好的鯽魚，純自來水作為空白對照，每組重復(fù)3次。分別在24、48、72、96 h觀察并記錄鯽魚的死亡數(shù)量。

1.10 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010與OriginPro 8處理數(shù)據(jù)及作圖，采用Photoshop對圖片進(jìn)行調(diào)色處理，采用SPSS Statistics 20對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（Duncan法）。

2 結(jié)果

2.1 S-AgNPs紫外吸收與X射線光電子能譜分析

S-AgNPs在421 nm左右有紫外特征吸收峰（圖1-A），且XPS能譜顯示S-AgNPs表面結(jié)合能為3.01 keV，明確了銀主要以零價(jià)態(tài)存在，說明S-AgNPs中的Ag元素主要是單質(zhì)銀（圖1-B），表明在整個反應(yīng)中所合成的物質(zhì)為金屬銀單質(zhì)，且具有銀納米顆粒的紫外吸收特質(zhì)，能夠充分肯定該反應(yīng)可成功合成納米級銀單質(zhì)。

圖1 S-AgNPs紫外可見吸收光譜（A）與X射線光電子能譜（B）

2.2 S-AgNPs形貌與穩(wěn)定性表征

經(jīng)TEM觀測，S-AgNPs為球形顆粒，形貌規(guī)則，具有較好的分散性，能均勻分散在溶劑中，團(tuán)聚現(xiàn)象較少（圖2-A、2-B）。此外，SEM與AFM觀測到S-AgNPs粒徑相對均一，顆粒形貌大小無明顯差異（圖2-E—2-H）。對TEM與AFM圖像進(jìn)行粒徑統(tǒng)計(jì)（圖2-I、2-J）得到該S-AgNPs粒徑大約8.14 nm（TEM）與11.23 nm（AFM）。為明確S-AgNPs的穩(wěn)定性，將S-AgNPs水溶液直接進(jìn)行冷凍干燥制成S-AgNPs粉末，而后將其復(fù)溶在水中發(fā)現(xiàn)水接觸S-AgNPs粉末后無需攪拌S-AgNPs立刻均勻分散在水中，肉眼觀察復(fù)溶溶液顏色、狀態(tài)與未凍干前S-AgNPs溶液極度相似。進(jìn)一步將其進(jìn)行TEM觀察發(fā)現(xiàn)，S-AgNPs凍干后粒徑與穩(wěn)定性與凍干前無明顯差異，只觀察到少許顆粒發(fā)生局部團(tuán)聚現(xiàn)象，但整體分散性與粒徑無明顯變化（圖2-C、2-D）。

A、B：S-AgNPs溶液TEM圖TEM image of S-AgNPs solution；C、D：S-AgNPs冷凍干燥后復(fù)溶于水中的TEM圖TEM image of S-AgNPs solution re-dissolved in water after freeze-drying；E、F：S-AgNPs掃描電鏡圖SEM images of S-AgNPs；G、H：S-AgNPs原子力顯微鏡圖AFM images of S-AgNPs；I：S-AgNPs的TEM粒徑統(tǒng)計(jì)TEM particle size statistics of S-AgNPs；J：S-AgNPs的AFM粒徑統(tǒng)計(jì)圖AFM particle size statistics of S-AgNPs

2.3 S-AgNPs的Zeta電位與粒徑統(tǒng)計(jì)分析

對S-AgNPs進(jìn)行進(jìn)一步表征以明確其粒徑分布，Zeta粒徑儀分析試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)S-AgNPs粒徑分布在5—12 nm，60%的S-AgNPs粒徑集中在8—9 nm，統(tǒng)計(jì)所得平均粒徑為9.83 nm（圖3-A）。選用上海函郎新材料有限公司生產(chǎn)的無表面活性劑的銀納米顆粒（AgNPs）作為對照組分與S-AgNPs一起進(jìn)行Zeta電位測定（圖3-B），結(jié)果顯示AgNPs電位為+4.6 mv，這主要是AgNPs無表面活性劑干擾銀顆粒的電位，而S-AgNPs電位為-32.29 mv，這是銀納米顆粒表面包裹的海藻酸鈉中和了銀顆粒表面電位而使其顯負(fù)電，該結(jié)果證實(shí)了海藻酸鈉還原銀離子后又作為表面活性劑包覆在銀納米顆粒表面。

圖3 S-AgNPs Zeta粒徑統(tǒng)計(jì)圖（A）與Zeta電位圖（B）

2.4 S-AgNPs對煙草赤星病菌的抑制作用

生測結(jié)果發(fā)現(xiàn)S-AgNPs在0.0625 μg·mL-1時就對煙草赤星病菌具有一定抑制作用（抑制率10%），且在濃度為1.0 μg·mL-1時抑制率可達(dá)83.9%。初步確定S-AgNPs具有較強(qiáng)的抗菌活性，在低濃度下能夠明顯抑制煙草赤星病菌菌絲生長（圖4）。

2.5 S-AgNPs對煙草赤星病菌菌絲生長的影響

如圖5所示，清水對照組（CK）菌絲生長迅速，培養(yǎng)基中充滿了白色菌絲且飽滿（圖5-A），而S-AgNPs（1.0 μg·mL-1）處理后的菌餅未觀察到明顯的菌絲生長，在菌餅周圍僅看到少了菌絲附著，培養(yǎng)基較清澈且無菌絲漂浮在培養(yǎng)基中（圖5-B）。將兩組菌絲取出測定其菌絲鮮重與干重后發(fā)現(xiàn)，對照組的菌絲鮮重與干重均顯著高于S-AgNPs組（圖5-C、5-D）。

2.6 S-AgNPs處理后菌絲表面觀察

將S-AgNPs處理后菌絲采用掃描電鏡觀察表面是否受損。掃描電鏡圖片顯示清水對照組菌絲生長良好，菌絲結(jié)構(gòu)完整，飽滿無損傷。S-AgNPs處理后的菌絲顯示不同程度的損傷，菌絲表面凹陷，局部膨大，菌絲整體干癟褶皺明顯，表明S-AgNPs對煙草赤星病菌菌絲有較強(qiáng)的破壞作用（圖6）。

2.7 細(xì)胞膜通透性測定

抗菌機(jī)制試驗(yàn)結(jié)果顯示，S-AgNPs處理后的菌絲在0—5 min時就出現(xiàn)了大量的細(xì)胞質(zhì)滲漏，細(xì)胞外液電導(dǎo)率迅速提升，5—20 min電導(dǎo)率也呈緩慢上升。CK對照組電導(dǎo)率在0—20 min無明顯變化（圖7-A）。與此同時，S-AgNPs處理過后的菌絲在20 min內(nèi)DNA累積滲漏量要顯著高于CK對照組（圖7-B）[20]。

2.8 可溶性蛋白含量測定

S-AgNPs組分的菌絲可溶性蛋白含量要遠(yuǎn)低于CK對照組（圖8），表明S-AgNPs抑制菌絲生長或破壞菌絲細(xì)胞膜可能與抑制其可溶性總蛋白有關(guān)[21]。

柱上標(biāo)有不同小寫字母表示處理間差異顯著（p＜0.05），豎條表示標(biāo)準(zhǔn)差。下同

A、B：健康菌絲與S-AgNPs處理后的菌絲Healthy mycelium and S-AgNPs treated mycelium；C：菌絲干重Dry weight of mycelium；D：菌絲鮮重fresh weight of mycelium

圖7 菌絲電導(dǎo)率變化（A）與DNA泄露（B）

圖8 菌絲可溶性蛋白含量

2.9 離體葉片病害控制效果

如圖9所示，清水對照組在接種3 d后發(fā)病較嚴(yán)重，能明顯觀察到深褐色病斑。而S-AgNPs處理組僅濃度為0.125 μg·mL-1時觀察到發(fā)病，但發(fā)病程度與病斑大小要明顯低于對照組，且其病情指數(shù)也顯著低于對照組（表1）。說明S-AgNPs在較低濃度時能夠抑制赤星病菌侵染植株，在較高濃度時能夠完全保護(hù)植株不受侵染。

2.10 S-AgNPs的安全性測定

將S-AgNPs加入水中后觀察鯽魚96 h內(nèi)的生命活動，結(jié)果發(fā)現(xiàn)清水對照組與S-AgNPs處理組鯽魚在96 h內(nèi)生命活動均正常，無不安、上下翻滾的情況，初步判斷S-AgNPs在抑菌范圍濃度內(nèi)對水生生物無明顯毒害作用（表2）。

圖9 不同處理下煙草赤星病發(fā)病情況

表1 不同處理下煙草赤星病病情指數(shù)

數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示處理間差異顯著（＜0.05）

Different lowercases after the data indicate significantly different among different treatments according to the Duncan’s multiple range test (＜0.05)

表2 S-AgNPs對鯽魚的毒性測定

3 討論

赤星病屬暴發(fā)性病害，在高溫高濕等適于發(fā)病的田間環(huán)境中可短時間大面積暴發(fā)，且其田間防治主推藥劑菌核凈也面臨著高抗藥性威脅，因此研究高效的赤星病防治策略迫在眉睫[22]。在諸多研究中，化學(xué)新藥劑的研發(fā)與生物防治是目前針對赤星病研究最多且最受關(guān)注的兩大途經(jīng)[23-24]。但新藥劑的研發(fā)周期較長，無法短時間投入于赤星病防治工作中[25]。生物防治也存在見效慢，農(nóng)民可接受度低等問題，還需要更進(jìn)一步完善以提高其應(yīng)用前景[26]。因此，亟需開發(fā)并評價(jià)新的煙草赤星病防控藥劑。

銀納米顆粒是公認(rèn)的具有良好抗菌活性的金屬納米材料，具有低耐藥性，抗菌機(jī)制多樣等特點(diǎn)，其已被證實(shí)具有優(yōu)越的廣譜抗植物病原真菌/細(xì)菌活性[27-28]。因此，銀納米顆粒是可應(yīng)用于煙草赤星病防治的理想備選材料。而綠色合成銀納米顆粒的方法也可改善銀納米抗菌活性以及提高生物安全性，研究中利用一些生物提取成分或者有效物質(zhì)對銀離子進(jìn)行還原合成銀納米顆?？蓽p少有毒副產(chǎn)物的產(chǎn)生，同時生物活性成分的加入也可協(xié)同銀納米抗菌以增加抗菌活性[29-31]。其中，最常見的綠色合成銀納米顆粒的方式就是利用微生物還原銀離子[16]。有報(bào)道評價(jià)了購自Quantum Sphere公司直徑為20nm左右的銀納米顆粒對植物病原真菌抑制活性，其濃度在高達(dá)50 μg·mL-1時才能抑制小麥根腐病菌（）侵染小麥[21]。但Mishra等利用土壤細(xì)菌BHU-S4的上清液綠色合成了粒徑為20 nm的銀納米顆粒（bsAgNPs）并同樣用于小麥根腐病的防治，發(fā)現(xiàn)bsAgNPs在濃度為4.0 μg·mL-1時就能完全抑制病菌侵染植株[32]，表明BHU-S4綠色合成銀納米顆粒確實(shí)很大程度上提高了銀顆粒對小麥根腐病的防治效果，在達(dá)到相同的防治效果時bsAgNPs相比于所購買的普通銀顆粒用量更少。微生物在合成銀納米顆粒過程中可能存在難以有效控制銀納米顆粒粒徑，所合成的納米顆粒易出現(xiàn)粒徑分散不均勻甚至團(tuán)聚等現(xiàn)象[33-35]。而銀納米顆粒在抗菌時具有很強(qiáng)的尺度依賴性，其粒徑越小抗菌活性越強(qiáng)[36]。同時，銀納米顆粒的穩(wěn)定性也會直接影響其藥效時長[36]。因此，提高銀納米顆粒綠色合成的顆粒穩(wěn)定性與粒徑均一性是增強(qiáng)該方法抗菌應(yīng)用前景的重要一步。在本研究中，筆者通過前期調(diào)查發(fā)現(xiàn)羧基與銀納米顆粒的配對作用最強(qiáng)，工業(yè)中常用帶有羧基的表面活性劑控制銀納米顆粒粒徑并增強(qiáng)其穩(wěn)定性[37]。海藻酸鈉表面具有豐富的羧基，在本研究中羧基與銀顆粒強(qiáng)烈配對作用使海藻酸鈉作為表面活性劑包裹在銀顆粒表面以控制銀顆粒粒徑，提高銀顆粒穩(wěn)定性，最終合成平均粒徑為9.83 nm的海藻酸鈉-銀納米顆粒（S-AgNPs）。因此，S-AgNPs的高效抗菌效果可能與其超強(qiáng)穩(wěn)定性、粒徑統(tǒng)一以及小粒徑特性有關(guān)。

此外，利用生物多糖合成銀納米顆粒也逐漸受到各界關(guān)注，特別是關(guān)于生物多糖協(xié)同銀納米顆?？咕嚓P(guān)工作的研究。WEI等利用殼聚糖為還原劑制備了殼聚糖基銀納米顆粒，試驗(yàn)證明殼聚糖合成的銀納米顆粒相比于純殼聚糖與硝酸銀溶液抗菌作用更迅速，抗菌時間更持久且抗菌作用更強(qiáng)，在5 μg·mL-1時就能對大腸桿菌具有較強(qiáng)的抑制作用[38]。該策略最終實(shí)現(xiàn)了殼聚糖抗菌與銀納米抗菌的雙重抗菌作用，實(shí)現(xiàn)了快速、高效的協(xié)同抗菌行為。海藻酸鈉是從褐藻類中提取而來的一種生物多糖，其降解產(chǎn)物海藻酸鈉寡糖（AOS）具有促進(jìn)植物生長、緩解非生物脅迫和誘導(dǎo)抗病的作用[39]。利用海藻酸鈉所合成的銀納米顆粒（S-AgNPs）在1.0 μg·mL-1時就能高效抑制赤星病菌生長，一方面可能是病菌對藥劑的敏感性存在差異，另一方面也可能是包覆在銀納米顆粒表面的海藻酸鈉在使用過程中降解產(chǎn)生了海藻酸鈉寡糖，增強(qiáng)了抗菌效果。

綜上所述，綠色合成銀納米顆粒可成為增強(qiáng)銀納米顆?？咕钚浴⒔档豌y納米顆粒生物毒性的重要途經(jīng)之一[32,38,40]，同時此類方法也增強(qiáng)了銀納米顆粒在赤星病防治工作中的應(yīng)用前景，有望成為煙草赤星病防治研究的一個新方向。

4 結(jié)論

利用海藻酸鈉成功合成了粒徑統(tǒng)一、穩(wěn)定性高、分散性強(qiáng)的海藻酸鈉-銀納米顆粒，所合成的銀納米顆粒在低濃度下便具有高效抑制赤星病菌的活性，其主要通過破壞菌絲細(xì)胞膜通透性，抑制可溶性蛋白合成等途經(jīng)抑制菌絲生長，最終實(shí)現(xiàn)抑制病菌侵染植株，具有廣闊的農(nóng)業(yè)應(yīng)用前景。

[1] 劉學(xué)敏, 常穩(wěn), 李大壯. 煙草赤星病研究現(xiàn)狀及存在問題. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2000, 31(1): 80-85.

LIU X M, CHANG W, LI D Z. Researching advance of tobacco brown spot caused by., 2000, 31(1): 80-85. (in Chinese)

[2] 朱俊峰. 中國煙草產(chǎn)業(yè)發(fā)展研究[D]. 長春: 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué), 2008.

ZHU J F. tobacco industry development in China[D]. Changchun: Jilin agricultural university, 2008. (in Chinese)

[3] 張萬良, 翟爭光, 謝揚(yáng)軍, 栗廣增. 煙草赤星病研究進(jìn)展. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2011, 23(1): 118-120.

ZHANG W L, ZHAI Z G, XIE Y J, LI G Z. Research advance in tobacco brown spot., 2011, 23(1): 118-120. (in Chinese)

[4] 劉丹, 段寧東, 董毅明, 楊明. 普洱市煙葉種植的比較效益分析. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2013, 41(3): 1372-1375.

LIU D, DUAN N D, DONG Y M, YANG M. Analysis of the comparative effectiveness of planting tobacco in Puer City., 2013, 41(3): 1372-1375. (in Chinese)

[5] 王佩, 歐雅姍, 張強(qiáng), 孫渭, 朱浩, 齊寧海, 陳耀鋒. 煙草赤星病研究進(jìn)展. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2018, 46(21): 33-36.

WANG P, OU Y S, ZHANG Q, SUN W, ZHU H, QI N H, CHEN Y F. Research advance in tobacco brown spot., 2018, 46(21): 33-36. (in Chinese)

[6] STAVELY J R, MAIN C E. Influence of temperature and other factors on initiation of tobacco brown spot., 1970, 60: 1591-1596.

[7] CHEN Y H, LU M H, GUO D S, ZHAI Y Y, MIAO D, YUE J Y, YUAN C H, ZHAO M M, AN D R. Antifungal effect of magnolol and honokiol fromoncausing tobacco brown spot., 2019, 24: 2140.

[8] 易龍, 肖崇剛. 煙草赤星病防治研究進(jìn)展. 植物保護(hù), 2003, 29(5): 10-14.

YI L, XIAO C G. Advances in studies on control of tobacco brown spot., 2003, 29(5): 10-14. (in Chinese)

[9] TIAN L, MEI G Y, LONG Z F, LUO D Q.Effects offungicides on tobacco brown spot and yield of flue-cured tobacco leaves., 2016, 17(7): 1736-1737, 1748.

[10] 蔣彩虹, 羅成剛, 任民, 楊愛國, 馮全福, 王元英. 一個與凈葉黃抗赤星病基因緊密連鎖的ssr標(biāo)記. 中國煙草科學(xué), 2012, 33(1): 19-22.

JIANG C H, LUO C G, REN M, YANG A G, FENG Q F, WANG Y Y. A SSR marker tightly linked to the resistant gene of Jingyehuang on tobacco brown spot., 2012, 33(1): 19-22. (in Chinese)

[11] 孟建玉, 曹毅, 陸寧, 商勝華. 貴州省煙草赤星病菌對菌核凈的抗藥性. 植物保護(hù)學(xué)報(bào), 2013, 40(5): 479-480.

MENG J Y, CAO Y, LU N, SHANG S H. Resistance ofto dimethachlon in Guizhou Province., 2013, 40(5): 479-480. (in Chinese)

[12] OLSON M E, WRIGHT J B, LAM K, BURRELL R E. Healing of porcine donor sites covered with silver-coated dressings., 2010, 166(6): 486-489.

[13] AYMONIER C, SCHLOTTERBECK U, ANTONIETTI L, ZACHARIAS P, THOMANN R, TILLER J C, MECKING S. Hybrids of silver nanoparticles with amphiphilic hyperbranched macromolecules exhibiting antimicrobial properties., 2002, 8(24): 3018-3019.

[14] Aguilar-Mendez M A, Martin-Martinez E S, Ortega- Arroyo L, Cobian-Portillo G, Sanchez-Espindola E. Synthesis and characterization of silver nanoparticles: effect on phytopathogen., 2011, 13(6): 2525-2532.

[15] RAI M, YADAV A, GADE A. Silver nanoparticles as a new generation of antimicrobials., 2009, 27: 76-83.

[16] ELBESHEHY E K F, ELAZZAZY A M, Aggelis G. Silver nanoparticles synthesis mediated by new isolates ofspp., nanoparticle characterization and their activity againstand human pathogens., 2015, 6: Article 453.

[17] SINGH D, KUMAR A. Identifying knowledge gaps in assessing health risks due to exposures of nanoparticles from contaminated edible plants//RAJU N J, GOSSEL W, RAMANATHAN A L, SUDHAKAR M.:. Springer International Publishing, 2015: 235-247.

[18] WANG S J, ZHANG Y W, Ma H L, ZHANG Q L, XU W G, PENG J, LI J Q, YU Z Z, ZHAI M L. Ionic-liquid-assisted facile synthesis of silver nanoparticle-reduced graphene oxide hybrids by gamma irradiation., 2013, 55: 245-252.

[19] De FARIAS V L, MONTEIRO K X, RODRIGUES S, FERNANDES F A, PINTO G A. Comparison ofspore production on potato dextrose agar (PDA) and crushed corncob medium., 2010, 56(5): 399-402.

[20] 阮元, 任偉, 申進(jìn)文, 孫曉萍, 麻兵繼, 王曉龍, 徐俊蕾. 鹽酸小檗堿對植物病原真菌抑制作用及其抑菌的生理指標(biāo)分析. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2014, 48(2): 194-198.

RUAN Y, REN W, SHEN J W, SUN X P, MA B J, WANG X L, XU J L. Inhibition effect of berberine hydrochloride on plant pathogenic fungi and its inhibition physiological index analysis., 2014, 48(2): 194-198. (in Chinese)

[21] JO Y K, KIM B H, JUNG G. Antifungal activity of silver ions and nanoparticles on phytopathogenic fungi., 2009, 93(10): 1037-1043.

[22] 賀剛, 廖衡斌, 李文宇, 朱旭東. 煙草品種和打頂時期對煙草赤星病發(fā)病情況的影響. 農(nóng)學(xué)學(xué)報(bào), 2017, 7(12): 65-69.

HE G, LIAO H B, LI W Y, ZHU X D. Influence of varieties and topping time on tobacco brown spot morbidity., 2017, 7(12): 65-69. (in Chinese)

[23] 宋莉莎, 司世飛, 龍友華, 劉仁祥, 李忠. 煙草赤星病生防芽孢桿菌的篩選鑒定及其生長條件研究. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué), 2019, 48(1): 84-89.

SONG L S, SI S F, LONG Y H, LIU R X, LI Z. Isolation, identification and growth conditions analysis of antagonisticagainst tobacco brown spot., 2019, 48(1): 84-89. (in Chinese)

[24] 曾超寧, 車騰飛. 不同化學(xué)藥劑對煙草赤星病的防治效果. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2015, 43(24): 99-100, 113.

ZENG C N, CHE T F. Control effects of different chemical agents against brown spot., 2015, 43(24): 99-100, 113. (in Chinese)

[25] 李華. 農(nóng)藥合成新技術(shù). 化學(xué)工程與裝備, 2012(1): 109-110, 116.

LI H. New technology of pesticide synthesis., 2012(1): 109-110, 116. (in Chinese)

[26] 許靈杰, 譚應(yīng)舉, 鄒光進(jìn), 蔡翼?xiàng)? 楊靜, 張繼, 曲振飛, 楊金陸. 煙草赤星病研究進(jìn)展及防治對策. 農(nóng)技服務(wù), 2018, 35(6): 53-55, 57.

XU L J, TAN Y J, ZOU G J, CAI Y Y, YANG J, ZHANG J, QU Z F, YANG J L. Research progress and control countermeasures of tobacco brown spot., 2018, 35(6): 53-55, 57. (in Chinese)

[27] PRABHU S, POULOSE E K. Silver nanoparticles: mechanism of antimicrobial action, synthesis, medical applications, and toxicity effects., 2012, 2: 32.

[28] RAI M, KON K, INGLE A, DURAN N, GALDIERO S, GALDIRO M. Broad-spectrum bioactivities of silver nanoparticles: the emerging trends and future prospects., 2014, 98(5): 1951-1961.

[29] MEDDA S, HAIRA A, DEY U, BOSE P, MONDAL N K. Biosynthesis of silver nanoparticles fromleaf extract and antifungal activity againstsp. andsp.., 2015, 5(7): 875-880.

[30] QIAN Y Q, YU H M, HE D, YANG H, WANG W T, WAN X, WANG L. Biosynthesis of silver nanoparticles by the endophytic fungusand their activity against pathogenic fungi., 2013, 36(11): 1613-1619.

[31] KATHIRAVAN V, RAVI S, ASHOKKUMAR S, VELMURUGAN S, ELUMALAI K, KHATIWADA C P. Green synthesis of silver nanoparticles usingleaf extract and their antibacterial and antifungal activities.:, 2015, 139: 200-205.

[32] MISHRA S, SINGH B R, SINGH A, KESWANI C, NAQVI A H, SINGH H B. Biofabricated silver nanoparticles act as a strong fungicide againstcausing spot blotch disease in wheat., 2014, 9(5): e97881.

[33] KLAUS T, JOERGER R, OLSSON E, GRANQVIST C G. Silver- based crystalline nanoparticles, microbially fabricated., 1999, 96(24): 13611-13614.

[34] KalimuthuK, Babu R S, VENKATARAMAN D, BILAL M, GURUNATHAN S. Biosynthesis of silver nanocrystals by.:, 2008, 65(1): 150-153.

[35] SUNDARAVADIVELAN C, PADMANABHAN M N. Effect of mycosynthesized silver nanoparticles from filtrate ofagainst larvae and pupa of dengue vectorL.., 2014, 21(6): 4624-4633.

[36] LOK C N, HO C M, CHEN R, HE Q Y, YU W Y , SUN H Z, TAM P K H, CHIU J F, CHE C M. Silver nanoparticles: partial oxidation and antibacterial activities., 2007, 12(4): 527-534.

[37] WANG W, CHEN X, EFRIMA S. Silver nanoparticles capped by long-chain unsaturated carboxylates., 1999, 103(34): 7238-7246.

[38] WEI D W, SUN W Y, QIAN W P, YE Y Z , MA X Y. The synthesis of chitosan-based silver nanoparticles and their antibacterial activity., 2009, 344(17): 2375-2382.

[39] 郭衛(wèi)華, 趙小明, 杜昱光. 海藻酸鈉寡糖對煙草幼苗生長及光合特性的影響. 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào). 2008, 39(6): 648-651.

GUO W H, ZHAO X M, DU Y G. Effects of alginate oligosaccharides on growth and photosynthetic characters of tobacco seedlings., 2008, 39(6): 648-651. (in Chinese)

[40] AHMAD A, MUKHERJEE P, SENAPATI S, MANDAL D, KHAN M I, KUMAR R, SASTRY M. Extracellular biosynthesis of silver nanoparticles using the fungus.:, 2003, 28(4): 313-318.

Preparation of A Novel Silver Nanoparticle and Its Antifungal Mechanism Against

XIANG ShunYu1,3, WANG Jing1, XIE ZhongYu1, SHI Huan1, CAO Zhe1, JIANG Long1, MA XiaoZhou1,3, WANG DaiBin4, ZHANG Shuai5, HUANG Jin2,3, SUN XianChao1,3

(1College of Plant Protection, Southwest University, Chongqing 400715;2School of Chemistry and Chemical Engineering, Southwest University, Chongqing 400715;3Chongqing Key Laboratory of Soft-Matter Material Chemistry and Function Manufacturing, Southwest University, Chongqing 400715;4Chongqing Tobacco Science Research Institute, Chongqing 400715;5Chongqing Tobacco Company Youyang Branch, Chongqing 409800)

【】In order to explore the agricultural application prospect of biological polysaccharide synthesis of silver nanoparticles and provide a theoretical basis for the development of safe and efficient antifungal agent, the silver nanoparticle based on the polysaccharide was prepared and its inhibitory activity and mechanism againstwas analyzed【】The sodium alginate was used as reductant and surfactant to synthesize the silver nanoparticles in water bath (65℃). The transmission electron microscopy (TEM), scanning electron microscopy (SEM), atomic force microscopy (AFM), ultraviolet spectrophotometer (Uv-vis), Zeta potential-particle size analyzer and X-ray diffraction energy spectrum (XPS) were used to characterize and analyze the particle size, dispersion, stability and chemical composition of S-AgNPs, respectively. The Nano measure software was used to measure the mean particle size of S-AgNPS in TEM and AFM images. Then, the S-AgNPs inhibition ability against mycelial growth was tested in the potato dextrose agar medium (PDA) with different S-AgNPs concentrations (0.0625, 0.125, 0.25, 0.5, 1.0 μg·mL-1). Aftercultivated in the liquid PDA medium (PDB) with S-AgNPs at the concentration of 1.0 μg·mL-1, the effects of S-AgNPs on the mycelium weight, morphology, the cell membrane permeability and the soluble protein content were investigated by testing the fresh and dry weights of mycelia, SEM observation, conductivity measurement and coomassie brilliant blue G-250 solution stain. Then, the control efficacy of S-AgNPs ontobacco brown spot was testedleaves by the spore suspension injection method. Finally, crucian carp was used to evaluate the biosafety of S-AgNPs.【】The TEM, AFM and SEM images showed that the strategy could be used to well control the size of the S-AgNPs (average particle size of 9.83 nm), and the prepared S-AgNPs showed a high stability and dispersibility in aqueous solvent. The results of bioassay showed that the inhibition rate of S-AgNPs on the growth ofreached 83.9% at 1.0 μg·mL-1. The fresh weight and dry weight of mycelium in S-AgNPs treatment group were significantly lower than those of the control group. The SEM image of mycelium showed that S-AgNPs could obviously destroy mycelium surface structure. Further investigation on the antifungal mechanism of S-AgNPs showed that S-AgNPs could destroy the biofilm structure by inhibiting the synthesis of soluble total protein in, reducing the water retention capacity of biofilm, rapidly destroying the membrane permeability of mycelium and causing a large amount of cytoplasmic leakage to inhibit the growth and development of mycelium. Finally,experiments confirmed that S-AgNPs could effectively inhibitinfecting tobacco leaves. Moreover, S-AgNPs in the effective antifungal concentration had no toxic effect on crucian carp and did not affect its normal life.【】The method established in this study can stably synthesize silver nanoparticles with good dispersion, uniform particle size and strong stability. In addition, the silver nanoparticle has a strong inhibitory ability againstand can effectively control tobacco brown spot, which suggests that S-AgNPs has a potential application prospect.

silver nanoparticle; sodium alginate; green synthesis;;tobacco brown spot;antifungal mechanism

10.3864/j.issn.0578-1752.2020.14.012

2020-01-02；

2020-02-15

國家自然科學(xué)基金（31670148，31870147）、中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金（XDJK2020B064）、中國煙草總公司重慶公司科技項(xiàng)目（NY20180401070010，NY20180401070001，NY20180401070008）

向順雨，E-mail：xiangshunyu0325@163.com。

孫現(xiàn)超，E-mail：sunxianchao@163.com。通信作者黃進(jìn)，E-mail：huangjin2015@swu.edu.cn

（責(zé)任編輯 岳梅）