李書光， 肖躍強， 程立坤， 趙家磊， 李來永， 劉吉山*

(1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600；2.青島農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，山東 青島 266109；3.山東省濱州畜禽蜂膠疫苗研究開發(fā)推廣中心，山東 濱州 256600；4.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；5.東營市河口區(qū)草原監(jiān)理站，山東 東營 257200)

支原體是已知最小、最簡單的能自我復制的原核微生物，普遍存在于自然界，是許多動物、植物及人類的病原體。目前支原體已接近200個種，其中有超過20種可感染牛。目前牛支原體病在世界上大部分的國家都有流行，是一種嚴重的、不可治愈的細菌性疾病，其病原為牛支原體，牛支原體在1961年在美國被首次分離到，能夠感染所有日齡的牛，影響動物生產(chǎn)性能，并降低動物福利[1]；臨床上以犢牛的肺炎、中耳炎、關(guān)節(jié)炎和奶牛的乳房炎為特征[2]，也有文獻報道心內(nèi)膜炎的發(fā)病[3]，呼吸道疾病是最嚴重和廣泛的，導致了肉牛和奶牛的疫病爆發(fā)和重要經(jīng)濟損失[4]，并有一定的死亡率。應用LAMP和熒光定量PCR能夠檢測到奶樣中牛支原體的病原[5]。

2019年對山東省濱州地區(qū)及周邊部分規(guī)?；膛鋈馀?，使用ELISA方法對560份血清進行了牛支原體的血清學抗體檢測，以期對規(guī)?；龅呐Ｖгw感染情況有所了解，為牛支原體病的科學防控提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 血清樣本的采集病料來源

2019年，對山東省濱州地區(qū)及周邊部分規(guī)?；膛龊腿馀龅难鍢颖具M行跟蹤采樣調(diào)查，選擇7家規(guī)?；馀?10～12月齡)和7家規(guī)模化奶牛場(24月齡)，采集血清樣本560份，室溫凝集后離心收集上清，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 ELISA檢測試劑盒

牛支原體間接Elisa試劑盒購自加拿大Biovet公司，批號：201012。

1.3 樣品檢測及分析

血清樣品用稀釋緩沖液做1∶100倍稀釋，加入到事先包被好了的牛支原體抗原的微孔板上，經(jīng)孵育，樣品中的抗牛支原體抗體和包被好的支原體抗原發(fā)生結(jié)合；經(jīng)幾遍洗滌并去除未發(fā)生反應的物質(zhì)，加入牛的酶標記抗體，經(jīng)孵育，牛的酶標記抗體和樣品中的抗體結(jié)合，形成抗原抗體和酶復合物；經(jīng)第2次洗滌，去除未反應的酶標記物抗體，加入底物顯色劑顯色，加入終止液終止顯色，用405 nm的單波長測定光密度值(OD值)，顏色的強弱表明檢測樣品中牛支原體抗體的含量。計算每個樣品和對照的平均值，獲得Radio(S/P)比值(Radio(S/P)=OD樣品值/陽性對照OD值平均值)。Radio(S/P)≥0.4為陽性。

1.4 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)檢測數(shù)據(jù)的結(jié)果，使用SPSS 20軟件進行統(tǒng)計學分析。

2 結(jié)果與分析

濱州地區(qū)及周邊，規(guī)?；膛?存欄1 000頭以上)牛支原體血清的陽性率介于30%～100%之間，奶牛支原體血清陽性率為74.29%；規(guī)?；馀?存欄1 000頭以上)牛支原體血清的陽性率介于67.5%～100%之間，肉牛支原體血清陽性率為81.43%；濱州地區(qū)及周邊牛的支原體血清陽性率為77.86%。使用SPSS 20軟件統(tǒng)計分析(表1)顯示，奶牛場1～5號場之間無統(tǒng)計學差異，6號場和7號場之間無統(tǒng)計學差異，6號場和7號場與1～5號場之間差異極顯著(Fisher雙尾精確檢驗P=0)；肉牛場8～12號場之間無統(tǒng)計學差異，13號場與14號場之間無統(tǒng)計學差異，13號場和14號場與8～11號場之間統(tǒng)計學差異極顯著(Fisher雙尾精確檢驗P=0)；奶牛群體牛支原體血清陽性率與肉牛群體相比，差異不顯著(Fisher雙尾精確檢驗P=5.3)。

表1 濱州地區(qū)及周邊部分規(guī)?；雠Ｖгw血清學抗體陽性率及統(tǒng)計學分析

3 討 論

牛支原體能夠定植在健康牛的上呼吸道，是引發(fā)牛呼吸道疾病的重要病原之一[6]。牛支原體利用菌毛、表面可變脂蛋白、生物膜等能夠侵入牛的免疫系統(tǒng)，牛支原體具有逃避中性粒細胞的特性[7]，宿主的免疫系統(tǒng)不能有效清除牛支原體的感染[8]，牛支原體感染后，免疫反應以TH2為主，產(chǎn)生的抗體類型以IgG1為主，并導致肺部炎癥[8]。

牛支原體缺乏有效的疫苗，該病的控制主要是依賴于良好的生產(chǎn)管理配合病原抗體檢測和有效的抗生素治療進行控制，有時與呼吸道病毒或者巴氏桿菌混合感染，常增加臨床及實驗室的有效診斷和檢測的難度。疫苗研制方面，活疫苗的應用前景更理想一些[9]，滅活疫苗在有些報道中有一定的效果，特別是使用皂素滅活的疫苗，免疫效果較為理想，但是目前為止亞單位疫苗方面沒有突破性進展[10]。牛支原體具有導致免疫系統(tǒng)功能低下的特性[11]，在抗體陽性率較高的區(qū)域，應該加強對該疾病的關(guān)注，降低其對牛群的危害。細胞免疫對牛支原體的清除效果要比體液免疫更有效[12]。以皂素和溶菌酶二聚體作為佐劑制備全菌體滅活疫苗，能夠有效激發(fā)牛支原體的機體細胞免疫[13]。史曉娜等成功利用家兔建立了牛支原體的感染模型，并證實滅活的牛支原體鋁膠佐劑疫苗能夠?qū)彝锰峁┮欢ǖ谋Ｗo，為疫苗回歸本動物的研究提供了有力的數(shù)據(jù)支撐[14]。Zhang等發(fā)現(xiàn)了膜蛋白P81和UgpB的抗體具有介導補體殺滅活性，具有作為疫苗候選抗原的特性[15]。

牛支原體可在宿主體內(nèi)長期存在，造成慢性感染，其對肉制品及奶制品行業(yè)的危害受到越來越多國家的關(guān)注。在美國，養(yǎng)殖場中牛支原體感染率最高可超過70%，每年對養(yǎng)牛業(yè)造成超過1.4億美元的損失。在歐洲，25%～33%的牛肺炎與牛支原體有關(guān)[16]。在我國，由辛九慶等人從犢牛肺臟中首次分離得到牛支原體[17]，隨后在國內(nèi)多個省市均發(fā)現(xiàn)牛支原體感染病例。2017—2019年，本實驗室接診多起犢牛肺炎的病例，通過病原的分離鑒定和PCR檢測方法確診為牛支原體感染[18]，為山東省首次分離到牛支原體病原，開創(chuàng)了山東省研究牛支原體的先河。

定期對牛群進行抗體或者抗原的檢測，結(jié)合鼻拭子病原的PCR檢測和血清抗體的檢測，杜絕支原體的傳入，是一種防控牛支原體的方法[19]。犢牛支原體的抗體可能會受到母源抗體的影響，因此在采集樣本時肉牛選擇10～12月齡、奶牛選擇24月齡左右的相對穩(wěn)定的群體進行隨機采樣。本文中對山東省濱州地區(qū)及周邊共14個規(guī)?；鲞M行了血清樣本的采集，并進行了IgG抗體的ELISA檢測。根據(jù)牛支原體血清ELISA檢測結(jié)果可以看到，山東省濱州地區(qū)及周邊規(guī)?；膛＜叭馀龃嬖趶V泛的牛支原體感染。在數(shù)據(jù)分析上，可以看出肉牛的感染率略高于奶牛的感染率，但統(tǒng)計學上差異不顯著。統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)顯示，不同的場區(qū)陽性率有差異，個別差異極顯著，則不同的奶牛場和肉牛場，管理水平和硬件設(shè)施會影響支原體的感染率，管理水平較高、硬件設(shè)施較好、分區(qū)管理的場區(qū)，其陽性率較低；管理水平較低、硬件設(shè)施一般、混區(qū)飼養(yǎng)的場區(qū)，其陽性率較高。本實驗室，使用實驗室分離的牛支原體病原，培養(yǎng)自制牛支原體玻片凝集抗原，對140份血清進行了檢測，總陽性率為63%，低于本文中使用的ELISA方法，而且兩者的符合率極低，后續(xù)需要進一步對該本實驗室的檢測方法進行優(yōu)化。

4 結(jié) 論

通過對濱州地區(qū)及周邊的牛場的牛支原體血清流行病學調(diào)查，試驗數(shù)據(jù)顯示該區(qū)域存在不同程度的牛支原體感染，且有的牛場感染率極高，牛支原體感染可能成為危害國內(nèi)規(guī)模化奶牛場奶牛健康的主要疫病之一，并存在垂直傳播的風險，為了促進牛的健康養(yǎng)殖，有必要采取加強對牛支原體的流行病學調(diào)查和制訂相應的綜合防控方案的研究和推廣。