石先華， 張成峰， 李 靜， 柏中鋒， 孫秀玉， 王之保*

(1.泌陽縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，河南 泌陽 463700；2.泌陽縣動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，河南 泌陽 463700；3.泌陽縣夏南牛研究推廣中心，河南 泌陽 463700)

長期以來“北繁南育”一直是我國肉牛養(yǎng)殖的主流模式，這種模式是造成我國肉牛疫病流行的主要原因之一，同時(shí)運(yùn)輸應(yīng)激也為肉牛育肥企業(yè)帶來了較大損失。近年來隨著肉牛價(jià)格的持續(xù)攀升，肉牛育肥利潤空間的增大，作為夏南牛主產(chǎn)區(qū)的河南省泌陽縣，過去一些以飼養(yǎng)繁殖母牛為主的養(yǎng)殖場(chǎng)、特別是一些中小規(guī)模的養(yǎng)殖場(chǎng)戶逐步向自繁自育轉(zhuǎn)型。目前受飼養(yǎng)條件、飼養(yǎng)方式、從業(yè)人員文化素質(zhì)、技術(shù)人才缺乏、管理水平等因素的影響，口蹄疫仍然是制約中小規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)戶發(fā)展的重要瓶頸之一。為探索中小規(guī)模養(yǎng)牛場(chǎng)自繁自育條件下，繁殖母牛、斷奶犢牛口蹄疫適宜的免疫時(shí)間，檢測(cè)口蹄疫免疫的效果，為中小規(guī)模養(yǎng)牛場(chǎng)制定科學(xué)的口蹄疫免疫程序提供參考數(shù)據(jù)，河南省肉牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系泌陽綜合試驗(yàn)站，在河南省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)支持下，開展了《不同方法對(duì)夏南牛口蹄疫免疫抗體水平檢測(cè)的比對(duì)試驗(yàn)》。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試驗(yàn)牛 試驗(yàn)牛來自泌陽縣羊冊(cè)鎮(zhèn)保才養(yǎng)牛場(chǎng)飼養(yǎng)的32頭夏南牛繁殖母牛和12頭斷奶犢牛，繁殖母牛在免疫后30 d，60 d，90 d，120 d采集血樣；斷奶犢牛在免疫后10 d，40 d，70 d，100 d采集血樣，疫苗為國家招標(biāo)采購的口蹄疫O型滅活疫苗(OHM/02株)，每頭牛2 mL，肌肉注射。

1.1.2 采血器材 采血器材有采樣箱、試管架、一次性離心管、5 mL注射器、酒精棉球、干棉球、記號(hào)筆、牛鼻鉗或繩子、不干膠標(biāo)簽、簽字筆、采樣單、乳膠手套、一次性鞋帽、口罩、一次性防護(hù)服等。

1.1.3 檢測(cè)試劑與設(shè)備 口蹄疫O型抗體檢測(cè)LB-ELISA試劑盒(新模式，生產(chǎn)批號(hào)：E190704，生產(chǎn)日期：20190724)，生產(chǎn)廠家為：洛陽萊普生信息科技有限公司；口蹄疫O型抗體檢測(cè)固相競(jìng)爭(zhēng)ELISA試劑盒(生產(chǎn)批號(hào)：20190726)生產(chǎn)廠家為：內(nèi)蒙古金邁詩生物科技有限公司。檢測(cè)儀器為美國伯騰全自動(dòng)酶標(biāo)儀，型號(hào)ELX-800。

1.2 方 法

1.2.1 牛源準(zhǔn)備 對(duì)被選繁殖母牛、斷奶犢牛注射天康生物股份有限公司生產(chǎn)的口蹄疫O型滅活疫苗(OHM/02株)每頭牛2 mL，肌肉注射。

在繁殖母牛免疫后30 d，60 d，90 d，120 d，斷奶犢牛免疫后10 d，40 d，70 d，100 d采血5 mL，檢測(cè)口蹄疫抗體效價(jià)；當(dāng)O型口蹄疫抗體效價(jià)<1∶64時(shí)，視為抗體水平不合格。查找原因，確定下次免疫時(shí)間。

1.2.2 血樣制備 母牛采用尾靜脈采血，先將5 mL注射器針頭換用9號(hào)針頭備用，固定牛，使牛尾向上翹。在離尾根10 cm左右中點(diǎn)凹陷處，先用酒精棉球消毒，然后用換好的注射器垂直刺入約1 cm深，針頭觸及尾骨后退出1 mm進(jìn)行抽血，每頭牛不少于3 mL。采血結(jié)束，消毒并用棉球按壓止血。

犢牛采用頸靜脈采血：將斷奶犢牛保定好，使其頭部稍前伸，并稍偏向?qū)?cè)，對(duì)頸靜脈局部進(jìn)行剪毛、消毒，看清頸靜脈后，采血者用左手拇指或食指與中指，在采血部位稍下方，壓迫靜脈血管、使之充盈怒張。如果不剪毛時(shí)用手觸摸，感覺圓滑、有彈性即是血管，另一手執(zhí)5 mL注射器，與皮膚成45°角。由下方向上方用力刺入皮膚與血管內(nèi)，見有血液流出后即可采集血樣，每頭牛不少于3 mL。采血結(jié)束，消毒并用棉球按壓止血。

分離血清：將采集的牛全血傾斜45°角，放置室溫靜止1 h后，以4 000 r/min離心全血5 min，取上清液，并用記號(hào)筆對(duì)每份樣品進(jìn)行標(biāo)記，待備用。

1.2.3 檢測(cè)方法與判定標(biāo)準(zhǔn) 一是采用液相阻斷ELISA檢測(cè)試劑盒(LB-ELISA)，對(duì)制備的牛血清樣品進(jìn)行O型口蹄疫抗體檢測(cè)，試驗(yàn)操作及抗體效價(jià)判定。用液相阻斷ELISA檢測(cè)方法，對(duì)牛血清樣品進(jìn)行稀釋度檢測(cè)。根據(jù)抗體試劑盒說明書判定標(biāo)準(zhǔn)：抗體效價(jià)≥1∶128，判為陽性；抗體效價(jià)﹤1∶128，判為陰性；ELISA抗體效價(jià)與免疫動(dòng)物攻毒保護(hù)關(guān)系：牛、羊抗體效價(jià)≥1∶128，99%以上保護(hù)；抗體效價(jià)在(1∶22)～(1∶90)之間，50%保護(hù)；抗體效價(jià)≤1∶16，不保護(hù)。二是采用固相競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)試劑盒，對(duì)制備相對(duì)應(yīng)的牛血清樣品進(jìn)行O型口蹄疫抗體檢測(cè)，試驗(yàn)操作及抗體效價(jià)判定，根據(jù)抗體試劑盒說明書的判定標(biāo)準(zhǔn)：若S/N值≥0.4，樣品口蹄疫抗體為陽性，若S/N值<0.4，樣品口蹄疫抗體為陰性，陽性判定為抗體合格、陰性判定為抗體不合格并與液相阻斷ELISA檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 繁殖母?？谔阋逴型抗體檢測(cè)

兩種方法檢測(cè)在繁殖母牛口蹄疫免疫抗體合格率時(shí)結(jié)果符合度不高。從表1可以看出，從檢測(cè)的32頭繁殖母牛血樣中，采用液相阻斷ELISA檢測(cè)方法，在口蹄疫免疫后第60天，O型口蹄疫抗體合格率達(dá)87.5%，在免疫后120 d時(shí)抗體合格率達(dá)46.8%?？贵w合格率沒有達(dá)到100%；采用固相競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法，在口蹄疫免疫后第60，90天時(shí)抗體合格率均達(dá)到100%，在免疫后120 d抗體合格率達(dá)75%。

表1 繁殖母?？谔阋逴型抗體檢測(cè)結(jié)果分析

從圖1可以看出，采用液相阻斷ELISA檢測(cè)方法抗體衰減時(shí)間早于固相競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法。兩種檢測(cè)方法出現(xiàn)抗體衰減變化規(guī)律不一致。

圖1 繁殖母?？谔阋逴型抗體衰減變化

2.2 斷奶犢?？谔阋逴型抗體檢測(cè)結(jié)果

兩種方法在檢測(cè)犢?？谔阋呙庖呖贵w合格率時(shí)表現(xiàn)出一定的一致性。從表2中看出，從檢測(cè)的12頭斷奶犢牛血樣中，采用液相阻斷ELISA檢測(cè)方法，在免疫后第40天時(shí)抗體合格率達(dá)100%，而在免疫后第100天，抗體合格率下降至41.6%，已是群體免疫不合格；采用固相競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法，在口蹄疫免疫后第40，70天時(shí)抗體合格率均達(dá)到100%，在免疫后100 d抗體合格率達(dá)75%。兩種檢測(cè)方法在犢牛免疫第40天時(shí)，抗體合格率均達(dá)到了100%。

表2 斷奶犢牛口蹄疫O型抗體檢測(cè)結(jié)果分析

從圖2可以看出，采用液相阻斷ELISA和固相競(jìng)爭(zhēng)ELISA兩種檢測(cè)方法，在口蹄疫免疫后第40天時(shí)抗體合格率均達(dá)到100%檢測(cè)結(jié)果一致；在第70，100天時(shí)，液相阻斷ELISA檢測(cè)方法抗體衰減時(shí)間早于固相競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法。

圖2 斷奶犢?？谔阋逴型抗體衰減變化

3 結(jié) 論

(1)在肉牛養(yǎng)殖生產(chǎn)中，檢測(cè)?？谔阋呙庖呖贵w水平時(shí),液相阻斷ELISA和固相競(jìng)爭(zhēng)ELISA兩種檢測(cè)方法均可行。

(2)采用液相阻斷ELISA試驗(yàn)結(jié)果顯示：口蹄疫O型滅活疫苗抗體效價(jià)，繁殖母牛在免疫后30 d時(shí)免疫抗體合格率為65.6%，在免疫后60 d時(shí)抗體效價(jià)最高，免疫抗體合格率為87.5%，在免疫后90 d抗體效價(jià)開始下降，免疫抗體合格率為78.1%，在免疫后120 d時(shí)免疫抗體合格率為46.8%；斷奶犢牛在免疫后10d時(shí)免疫抗體合格率為75%，在免疫后40 d時(shí)抗體效價(jià)最高，免疫抗體合格率為100%，在免疫后70 d抗體效價(jià)開始下降，免疫抗體合格率為83.3%，在免疫后100 d時(shí)免疫抗體合格率為41.6%。

(3)采用固相競(jìng)爭(zhēng)ELISA試驗(yàn)結(jié)果顯示：口蹄疫O型滅活疫苗抗體效價(jià)，繁殖母牛在免疫后30 d時(shí)免疫抗體合格率為78.1%，在免疫后60 d，90 d時(shí)免疫抗體合格率均為100%，在免疫后120 d時(shí)免疫抗體合格率為75%；斷奶犢牛在免疫后10 d時(shí)免疫抗體合格率為83.3%，在免疫后40 d，70 d時(shí)免疫抗體合格率均為100%，在免疫后100 d時(shí)免疫抗體合格率為75%。

4 討 論

(1)固相競(jìng)爭(zhēng)ELISA試驗(yàn)操作簡(jiǎn)單方便，而且成本較低，適宜中小規(guī)模牛場(chǎng)推廣使用；但只能判定結(jié)果是抗體陰性,或陽性，并未能檢測(cè)出精確的抗體滴度。而液相阻斷ELISA雖然試驗(yàn)操作時(shí)間長、技術(shù)要求高、檢測(cè)成本也較高，但能夠檢測(cè)出準(zhǔn)確的抗體滴度，適宜大型規(guī)模牛場(chǎng)進(jìn)行檢測(cè)。

(2)液相阻斷ELISA試驗(yàn)結(jié)果顯示，繁殖母牛O型口蹄疫抗體在免疫疫苗后120 d時(shí)，抗體合格率為46.8%；斷奶犢牛在免疫疫苗后100 d時(shí)，抗體合格率為41.6%；遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于國家規(guī)定70%以上的標(biāo)準(zhǔn)，抗體效價(jià)已起不到群體保護(hù)作用，感染口蹄疫風(fēng)險(xiǎn)較大。

(3)液相阻斷ELISA與固相競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)口蹄疫抗體結(jié)果有一定的誤差，可能是試驗(yàn)人員操作原因，也可能是結(jié)果判斷不準(zhǔn)確的原因造成的，有待后續(xù)試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

(4)本試驗(yàn)缺少對(duì)參試?；A(chǔ)免疫的檢測(cè)數(shù)據(jù)，試驗(yàn)方案存在不完善的地方，對(duì)本試驗(yàn)結(jié)果也有一定的影響；同時(shí)試驗(yàn)結(jié)果僅是本批次試驗(yàn)數(shù)據(jù)的簡(jiǎn)單分析，沒有重復(fù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)做比對(duì)，不具有廣泛的代表性，僅做參考。

5 建 議

本次參試的繁殖母牛采用液相阻斷ELISA檢測(cè)法O型口蹄疫免疫抗體合格率沒有達(dá)到100%，犢牛雖然在第40天時(shí)達(dá)到了100%，但迅速衰減。說明該養(yǎng)牛場(chǎng)免疫程序、免疫操作不規(guī)范，建議繁殖母牛在免疫120 d后進(jìn)行補(bǔ)免補(bǔ)防，斷奶犢牛在免疫100 d后進(jìn)行補(bǔ)免補(bǔ)防。

感謝范秀麗老師免費(fèi)提供的固相競(jìng)爭(zhēng)ELISA試劑盒！