向炬富 ，劉紅羽，趙 靜，鄢 冉，王政業(yè)，王 軍*，呂文發(fā)*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物生產(chǎn)與產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林長(zhǎng)春 130118；2.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)教育部國(guó)際合作聯(lián)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林長(zhǎng)春 130118；3.長(zhǎng)春職業(yè)技術(shù)學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130118；4.長(zhǎng)春市九臺(tái)區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，吉林長(zhǎng)春 130118）

奶牛子宮內(nèi)膜炎是臨床上常見的繁殖障礙性疾病之一，主要是由于奶牛產(chǎn)后生殖道擴(kuò)張、病原微生物持續(xù)侵入感染發(fā)病，如致病性大腸桿菌（EPEC）。大腸桿菌通過(guò)黏附于子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞激發(fā)相關(guān)炎癥通路，從而導(dǎo)致大量細(xì)胞因子（IL-6、IL-8和IL-10）釋放[1-2]。子宮內(nèi)膜炎常導(dǎo)致母畜妊娠中斷、屢配不孕，嚴(yán)重時(shí)可致使奶牛繁殖能力喪失，造成大量經(jīng)濟(jì)損失。對(duì)于大腸桿菌引起的奶牛子宮內(nèi)膜炎，臨床上主要的治療方法是應(yīng)用抗生素，但長(zhǎng)期使用會(huì)引起藥品殘留、環(huán)境污染等問(wèn)題[3-4]。乳酸菌制劑已被證明具有抗炎和提高機(jī)體免疫力的潛力，有望替代抗生素成為治療奶牛子宮內(nèi)膜炎的新一代藥劑[5]。有研究表明，乳酸菌的益生作用主要表現(xiàn)在與病原菌的營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)，以及代謝產(chǎn)物的抑菌作用[6]。乳酸菌通過(guò)強(qiáng)力附著于奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，可以更好且持續(xù)地發(fā)揮其益生效果[7]。殼聚糖及其衍生物常被用于藥物的載體，可運(yùn)載細(xì)菌特異性靶向目的細(xì)胞，且已被證明具有一定的抗炎作用[8-9]。為挑選出能夠有效抵御大腸桿菌的乳酸菌，有研究表明從健康奶牛子宮內(nèi)分離的乳酸菌能夠生產(chǎn)抑菌的有效物質(zhì)[10]。為進(jìn)一步探究乳酸菌對(duì)細(xì)胞炎癥的影響，本研究挑選了3株分離自健康奶牛子宮的優(yōu)勢(shì)乳桿菌，即魏斯氏乳桿菌（L.weissella）、唾液乳桿菌（L.salivarius）和約氏乳桿菌（L.johnsonii），研究其對(duì)奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞炎癥的影響，并探究其與殼聚糖季銨鹽（Chitosan Quaternary Ammonium Salt，CQN）的聯(lián)合作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料 MRS培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基均購(gòu)自賽奧克生物科技有限公司。DEPC水、胎牛血清、胰蛋白酶、DMEM/ F-12（1:1）均購(gòu)自上海生工生物工程有限公司。Trizol、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、TB GreenTMPremix Ex TaqTMII均購(gòu)自大連TaKaRa公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將凍存的奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞系（ATCC提供）置于37℃水浴鍋中快速?gòu)?fù)蘇，然后添加含10% 胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，置于5% 二氧化碳培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)。細(xì)胞計(jì)數(shù)，每個(gè)大皿達(dá)到20萬(wàn)個(gè)即可分組處理。

1.3 細(xì)菌培養(yǎng) 約氏乳桿菌、唾液乳桿菌、魏斯氏乳桿菌和致病性大腸桿菌均由本實(shí)驗(yàn)室提供。將凍存的3株乳桿菌放至室溫，用接種環(huán)蘸取菌液在MRS固體培養(yǎng)基上連續(xù)劃線，恒溫箱37℃培養(yǎng)24 h后用接種環(huán)挑取單菌落于MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h達(dá)1010CFU/mL，純化3次后予以備用。將凍存的大腸桿菌放至室溫，用接種環(huán)蘸取菌液在LB固體培養(yǎng)基上連續(xù)劃線，恒溫箱37℃培養(yǎng)24 h后用接種環(huán)挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)8 h達(dá)1010CFU/mL，純化3次后予以備用。

1.4 細(xì)胞活力檢測(cè) 將不同濃度的大腸桿菌（105、106、107、108CFU/mL）懸浮于含1%胎牛血清的無(wú)雙抗培養(yǎng)液中處理細(xì)胞24 h。稱取1 g殼聚糖季銨鹽（北京酷爾化學(xué)科技有限公司提供）溶于100 mL純水，梯度稀釋至10、1、0.1、0.01、0.001 mg/mL后處理細(xì)胞24 h。按照乳酸脫氫酶（LDH）檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司提供）說(shuō)明書操作，檢測(cè)大腸桿菌處理和乳桿菌處理對(duì)細(xì)胞活力的影響。

1.5 奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞炎癥模型建立 大皿細(xì)胞培養(yǎng)至20萬(wàn)個(gè)，添加105CFU/mL和106CFU/mL的大腸桿菌懸液分別處理3、6、9、12、24 h，收集上清液，ELISA盒子（上海酶聯(lián)提供）檢測(cè)細(xì)胞因子IL-6和IL-8的變化以確定炎癥的發(fā)生。

1.6 細(xì)胞因子分析 細(xì)胞炎癥模型建立完成后，分組進(jìn)行不同處理。對(duì)照組：正常培養(yǎng)的細(xì)胞；E.coli組：106CFU/mL大腸桿菌處理3 h致炎；LAB組：致炎后單獨(dú)添加108CFU/mL乳桿菌處理12 h；CQN組：致炎后單獨(dú)添加0.01 mg/mL殼聚糖季銨鹽處理12 h；LAB+CQN組：致炎后添加乳桿菌和殼聚糖季銨鹽混合處理12 h。處理完畢后3000 r/min離心10 min后取上清，按照說(shuō)明書進(jìn)行操作，ELISA盒子（上海酶聯(lián)生物科技有限公司提供）檢測(cè)細(xì)胞因子IL-6、IL-8和IL-10的變化。

1.7 RT-qPCR分析 細(xì)胞處理后棄上清，PBS沖洗3次，Trizol法提取細(xì)胞RNA，然后按照試劑盒要求（PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser）對(duì)提取的樣本RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，熒光定量PCR法檢測(cè)IL-6和IL-8的mRNA表達(dá)。熒光定量PCR反應(yīng)體系：10 μL GreenTMPremix Ex TaqTMII，上、下游引物（10 μmol/L）各0.8 μL，0.4 μL ROX reference Dye II，2 μL cDNA。熒光定量PCR所需引物見表1。

表1 熒光定量PCR引物信息

1.8 細(xì)菌黏附檢測(cè) 將細(xì)胞爬片（φ15 mm，NEST）置于24孔板中，分別加入等量的細(xì)胞過(guò)夜培養(yǎng)，不同處理后進(jìn)行革蘭染色，油鏡下觀察細(xì)菌黏附情況。PBS沖洗3次后用胰蛋白酶將細(xì)胞吹落，稀釋涂布平板進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，黏附率表示為每個(gè)細(xì)胞黏附的細(xì)菌數(shù)（CFU/個(gè)）。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析 采用Graghpad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，所有結(jié)果均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05表示差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大腸桿菌和殼聚糖季銨鹽對(duì)細(xì)胞活力的影響 通過(guò)對(duì)LDH釋放量的檢測(cè)來(lái)評(píng)估大腸桿菌和殼聚糖季銨鹽對(duì)奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞活力的影響。由圖1-A可得，107、108CFU/mL的大腸桿菌對(duì)細(xì)胞均有顯著的損傷作用；而105、106CFU/mL的大腸桿菌無(wú)明顯損傷作用。由圖1-B可得，添加10、1 mg/mL的CQN極顯著降低了細(xì)胞活率，而0.1、0.01、0.001 mg/mL的處理并未對(duì)細(xì)胞顯示出損傷影響。

2.2 大腸桿菌誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥發(fā)生 選擇105CFU/mL和106CFU/mL的大腸桿菌處理細(xì)胞，通過(guò)評(píng)估細(xì)胞因子的變化來(lái)確定炎癥的發(fā)生。如圖2所示，添加105CFU/mL的大腸桿菌處理6 h后，炎性因子IL-6（P＜0.05）和IL-8（P＜0.01）的分泌量均上升；而添加106CFU/mL的大腸桿菌處理3 h后即可觀察到炎性因子的顯著上升，且在24 h內(nèi)持續(xù)升高。結(jié)果表明，105CFU/mL的大腸桿菌處理6 h后或106CFU/mL的大腸桿菌處理3 h后，均可引起奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的持續(xù)性炎癥。

2.3 不同處理對(duì)細(xì)胞因子的影響 如圖3所示，單獨(dú)添加魏斯氏乳桿菌、唾液乳桿菌和約氏乳桿菌處理均顯著降低了細(xì)胞因子IL-6的蛋白和mRNA表達(dá)（圖3-A、B），但對(duì)趨化因子IL-8的表達(dá)無(wú)顯著影響（圖3-C、D）。單獨(dú)添加CQN處理也顯著降低了IL-6的表達(dá)，而對(duì)IL-8無(wú)影響。約氏乳桿菌加CQN混合處理同時(shí)降低了IL-6和IL-8的表達(dá)（P＜0.05），而其他乳桿菌加CQN混合處理的抑炎效果并不明顯。IL-10是體內(nèi)的抑炎因子，炎性因子IL-6、IL-8與其比值反映了體內(nèi)細(xì)胞因子的平衡。相比其他處理組，約氏乳桿菌加CQN混合處理使得細(xì)胞因子的平衡恢復(fù)至常態(tài)，具有較好的抗炎效果（圖3-E、F）。

2.4 細(xì)菌黏附的變化 通過(guò)對(duì)細(xì)菌黏附的檢測(cè)觀察到，CQN的添加極顯著提升了約氏乳桿菌的黏附率（P＜0.001），但約氏乳桿菌和CQN混合處理并沒(méi)有顯著降低大腸桿菌的黏附率（圖4）。

3 討論

奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞作為抵抗病原菌侵染的第一道防線，對(duì)機(jī)體健康有著非常重要的作用[11]。大腸桿菌侵染內(nèi)膜上皮細(xì)胞引起奶牛子宮內(nèi)膜炎，從而阻礙受精和胚胎植入，甚至可能導(dǎo)致孕畜早期流產(chǎn)[12]。本研究結(jié)果表明，利用大腸桿菌可誘導(dǎo)奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞發(fā)生持續(xù)性炎癥，添加約氏乳桿菌和CQN治療后可顯著改善炎癥。

本試驗(yàn)首先添加了不同濃度的大腸桿菌對(duì)奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的處理，發(fā)現(xiàn)106CFU/mL的大腸桿菌處理3 h后，細(xì)胞因子IL-6和IL-8的表達(dá)顯著上升，且在24 h內(nèi)持續(xù)上升，確定了奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞炎癥的持續(xù)發(fā)生。致炎處理后，單獨(dú)添加乳桿菌和單獨(dú)CQN處理細(xì)胞12 h后均顯著降低了IL-6的釋放，但是未降至正常水平，且對(duì)IL-8的釋放無(wú)顯著影響，這可能是由于持續(xù)性的炎癥需要更長(zhǎng)時(shí)間的治療。Wang等[13]在添加植物乳桿菌處理炎癥細(xì)胞時(shí)也觀察到相似現(xiàn)象，于是將治療時(shí)間延長(zhǎng)后發(fā)現(xiàn)促炎因子的顯著下調(diào)。然而，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)約氏乳桿菌和CQN混合添加處理炎癥細(xì)胞后，細(xì)胞因子IL-6、IL-8和IL-10均恢復(fù)至正常水平，這表明乳桿菌和CQN混合后大大提高了其抗炎效果。有研究表明，大腸桿菌依賴菌體表面黏蛋白黏附于細(xì)胞膜進(jìn)行侵染[4]。因此，本研究對(duì)大腸桿菌和約氏乳桿菌的黏附細(xì)胞的狀態(tài)進(jìn)行了觀察，發(fā)現(xiàn)約氏乳桿菌和CQN混合處理盡管沒(méi)有顯著降低大腸桿菌對(duì)細(xì)胞的黏附率，但是抑制了其生長(zhǎng)，并且CQN的添加顯著增強(qiáng)了約氏乳桿菌的黏附率，這可能是導(dǎo)致細(xì)胞炎癥減緩的重要原因之一。Inturri等[14]研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)雙歧桿菌和鼠李糖乳桿菌的聯(lián)合使用可有效降低革蘭氏陰性菌的黏附性能。大量研究表明，乳桿菌聯(lián)合中藥、維生素和一些糖類可以有效減緩炎癥的發(fā)生并提高機(jī)體的免疫功能[15-17]。這些證據(jù)均表明，乳桿菌聯(lián)合多種物質(zhì)將會(huì)是高效治療奶牛子宮內(nèi)膜炎的新走向。盡管本研究發(fā)現(xiàn)約氏乳桿菌和殼聚糖季銨鹽的混合處理可以有效抑制細(xì)胞因子的上升，但其是基于細(xì)胞層面的體外研究，且機(jī)制尚不明確，需要更深入的研究。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，約氏乳桿菌聯(lián)合CQN顯著減緩了大腸桿菌誘導(dǎo)的奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞炎癥，可用于奶牛子宮內(nèi)膜炎的治療。