王治會(huì)，彭 華，岳翠男，李 琛，李文金，楊普香

(江西省蠶桑茶葉研究所/江西省茶葉質(zhì)量與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330202)

功能育種是根據(jù)功能食品或功能飲料的開(kāi)發(fā)需求，以功能成分為主要目標(biāo)的育種方式，目前是國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)[1-3]。茶葉飲品是世界上僅次于水的第二大飲料[4]，具備獨(dú)特的風(fēng)味特征，其功能價(jià)值備受關(guān)注[5-7]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)和茶學(xué)領(lǐng)域研究表明，茶葉內(nèi)含大量具有醫(yī)療與保健價(jià)值的功能成分，這些成分主要來(lái)源于茶樹(shù)本身[8]。因此，以滿(mǎn)足供給側(cè)結(jié)構(gòu)性改革為重點(diǎn)的功能性茶樹(shù)品種選育成為新熱點(diǎn)。研究茶樹(shù)功能成分的評(píng)價(jià)指標(biāo)與綜合評(píng)價(jià)方法，篩選功能性強(qiáng)的茶樹(shù)資源，對(duì)于茶樹(shù)功能育種工作具有重要意義。目前，對(duì)于茶葉主要化學(xué)成分的功能研究取得較大成就，如茶多酚具有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、清除自由基和抗氧化等功能[9]，咖啡堿具有利尿、減疲勞和消水腫等功能[10]，游離氨基酸具有增強(qiáng)記憶力、鎮(zhèn)靜、提高免疫等功能[11]。同時(shí)，也有學(xué)者從各地茶樹(shù)資源中選育出部分功能性(高茶多酚、高咖啡堿、高氨基酸)茶樹(shù)[12-13]，如齊桂年等[14]從四川主栽的茶樹(shù)品種中篩選出高茶多酚資源1份，林金科等[15]從福建780份茶樹(shù)資源中篩選出高EGCG資源11份，方開(kāi)星等[16]從廣東茶樹(shù)資源庫(kù)中篩選出高氨基酸資源55份。但這些茶樹(shù)資源篩選均是基于單一功能成分含量高的角度，并非從整體主要功能成分的多層面進(jìn)行綜合分析評(píng)價(jià)。目前，有關(guān)茶樹(shù)資源的功能品質(zhì)與主要功能指標(biāo)的綜合評(píng)價(jià)研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

主成分分析是多指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)中常用的方法[17]，目前已廣泛應(yīng)用于食品營(yíng)養(yǎng)功能評(píng)價(jià)[18-20]、作物優(yōu)良品種評(píng)價(jià)[21-24]、植物優(yōu)良資源篩選[25-26]等方面，因此，利用主成分分析探索功能性茶樹(shù)資源的評(píng)價(jià)指標(biāo)，構(gòu)建其評(píng)價(jià)體系，篩選功能優(yōu)異的茶樹(shù)資源更加科學(xué)。鑒于此，以江西省內(nèi)不同區(qū)域和省外引種馴化的45份茶樹(shù)資源為材料，對(duì)其茶葉中14個(gè)主要功能成分指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，明確不同茶樹(shù)資源的功能成分差異，找到關(guān)鍵評(píng)價(jià)指標(biāo)，并從中篩選出部分功能優(yōu)異的茶樹(shù)資源，為茶樹(shù)功能成分評(píng)價(jià)及后續(xù)功能型茶樹(shù)品種的選育奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

以江西省內(nèi)不同區(qū)域及省外引種馴化的45份茶樹(shù)資源為試驗(yàn)材料，具體見(jiàn)表1，各茶樹(shù)資源的樹(shù)齡均在4 a以上。樣品編號(hào)1—24為江西省內(nèi)選育出的新品系，包括南昌8份、修水3份、浮梁4份、永修3份、廬山1份、遂川1份、婺源1份、寧都2份和撫州1份；樣品編號(hào)25—45為省外引種馴化的茶樹(shù)資源，包括湖南3份、福建3份、湖北1份、臺(tái)灣1份、四川4份、云南1份和浙江8份。2017—2018年春季采摘其一芽二葉進(jìn)行微波殺青，采用80 ℃烘干固樣，進(jìn)行功能成分檢測(cè)分析。

1.2 功能性成分測(cè)定

總游離氨基酸含量參照GB/T 8314—2013測(cè)定。茶多酚含量參照GB/T 8313—2018測(cè)定。表兒茶素(EC)、沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(GCG)、兒茶素沒(méi)食子酸酯(CG)、沒(méi)食子酸(GA)、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)、表沒(méi)食子兒茶素(EGC)、表兒茶素沒(méi)食子酸酯(ECG)、兒茶素(C)、咖啡堿含量測(cè)定采用高效液相色譜法，色譜柱采用Hypersil BDS C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相A為3‰冰乙酸水溶液，流動(dòng)相B為乙腈。流動(dòng)相A的梯度變化：0～5 min為95%～92%，5～15 min為92%～88%，15～30 min為88%～80%，30～31 min為88%～0，31～35 min為0；流動(dòng)相B的梯度變化0～5 min為5%～8%，5～15 min為8%～12%，15～30 min為12%～20%，30～31 min為20%～100%，31～35 min為100%；進(jìn)樣量10 μL；柱溫35 ℃；流速1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)278 nm。各個(gè)樣品功能性成分測(cè)定設(shè)置3次重復(fù)。EC、GCG、CG、GA、EGCG、EGC、ECG、C、咖啡堿9份標(biāo)準(zhǔn)品純度均為98%，由成都普瑞法科技開(kāi)發(fā)有限公司生產(chǎn)；乙醇、乙腈為色譜純；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 19.0 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)、相關(guān)性分析、主成分分析。綜合評(píng)價(jià)指數(shù)閾值的確定依據(jù)綜合評(píng)價(jià)指數(shù)的差異，使用LSD法對(duì)閾值劃分等級(jí)進(jìn)行多重比較，若各等級(jí)的評(píng)價(jià)指數(shù)差異全部達(dá)到顯著水平，則說(shuō)明閾值劃分合理；若沒(méi)有顯著差異，則重新劃分閾值，直到找到合適的閾值為止。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹(shù)資源的功能成分含量描述性統(tǒng)計(jì)

由表2可見(jiàn)，供試45份茶樹(shù)資源的茶多酚含量為13.51%～23.97%，均值為18.82%，從峰度和偏度上來(lái)看，分布曲線呈現(xiàn)出平闊負(fù)偏峰，整體波動(dòng)較大，變異系數(shù)達(dá)到13.05%；總游離氨基酸含量為1.57%～3.49%，均值為2.36，分布曲線呈平闊正偏鋒，變異系數(shù)達(dá)到20.57%，整體波動(dòng)也較大。此結(jié)論符合江西茶樹(shù)資源的特點(diǎn)，即茶樹(shù)資源在茶多酚和總游離氨基酸含量上差異較大[27]。咖啡堿含量為1.77%～4.28%，均值為3.50%，分布曲線呈現(xiàn)出尖峭負(fù)偏峰，變異系數(shù)為12.55%，整體差異較大，且表現(xiàn)出取值較為密集地分布在眾數(shù)周?chē)?，與咖啡堿含量相似的還有非酯型兒茶素、GCG、EGC、C含量，這4個(gè)功能成分含量指標(biāo)的分布曲線呈現(xiàn)出尖峭正偏峰，變異系數(shù)均較大，取值也較為密集地分布在眾數(shù)周?chē)?。GA和CG含量的分布曲線呈平闊正偏鋒，EC、ECG分布曲線呈平闊正偏鋒。總兒茶素含量為9.16%～20.94%，均值為15.31%，分布曲線呈平闊負(fù)偏峰，接近正態(tài)分布，EGCG、酯型兒茶素和總兒茶素含量變異系數(shù)均較大。由此可見(jiàn)，江西茶樹(shù)資源在功能成分含量上差異較大，各功能成分含量呈現(xiàn)不同的分布曲線，且沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的離群點(diǎn)。說(shuō)明收集的茶樹(shù)資源樣品具有代表性，能夠從中篩選出綜合功能性較好的茶樹(shù)種質(zhì)。

表2 45份茶樹(shù)資源各功能成分的描述性統(tǒng)計(jì)

2.2 茶樹(shù)資源各功能成分的相關(guān)性分析

對(duì)45份茶樹(shù)資源的功能成分含量進(jìn)行相關(guān)性分析結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可見(jiàn)，茶多酚含量與總游離氨基酸含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，與EC、ECG、EGCG、酯型兒茶素、總兒茶素含量呈極顯著正相關(guān)，與非酯型兒茶素含量呈顯著正相關(guān)，說(shuō)明在茶樹(shù)資源的功能成分含量中，茶多酚含量越高，總游離氨基酸含量越低，EC、ECG、EGCG、酯型兒茶素、總兒茶素、非酯型兒茶素含量越高?？傆坞x氨基酸含量與GA含量呈顯著正相關(guān)，與EGCG、酯型兒茶素、總兒茶素含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，與EC含量呈顯著負(fù)相關(guān)?？Х葔A含量與GA含量呈顯著正相關(guān)，與EC含量呈極顯著正相關(guān)，與C含量呈極顯著負(fù)相關(guān)。EGC含量與非酯型兒茶素含量呈極顯著正相關(guān)，與總兒茶素含量呈顯著正相關(guān)。C含量與EC含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，與ECG、酯型兒茶素含量呈顯著正相關(guān)。EC含量與非酯型兒茶素含量、ECG含量與EGCG含量呈顯著正相關(guān)。非酯型兒茶素含量與總兒茶素含量，ECG、EGCG含量分別與酯型兒茶素、總兒茶素含量，酯型兒茶素與總兒茶素含量均呈極顯著正相關(guān)。在各項(xiàng)功能成分之中，只有GCG和CG與各項(xiàng)功能成分之間無(wú)顯著相關(guān)性。由此可以看出，不同茶樹(shù)資源的功能成分含量之間存在不同程度的相關(guān)性，14項(xiàng)功能成分中有12項(xiàng)成分之間存在不同程度的信息重疊，進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)時(shí)需剔除指標(biāo)間的重復(fù)，以免評(píng)價(jià)出現(xiàn)偏差。

2.3 茶樹(shù)資源各功能成分的主成分分析

對(duì)45份茶樹(shù)資源的14個(gè)功能成分含量進(jìn)行主成分分析，以探尋影響茶樹(shù)資源功能性最為關(guān)鍵的指標(biāo)。以初始特征值大于1、在碎石圖(圖1)中較為陡峭、累積方差貢獻(xiàn)率大于80%為原則進(jìn)行主成分提取[28]，結(jié)果見(jiàn)表4，可以看出，前5個(gè)主成分的初始特征值大于1，累積方差貢獻(xiàn)率為81.224%，故可采用前5個(gè)主成分代替14項(xiàng)功能成分對(duì)于茶樹(shù)資源的功能性進(jìn)行評(píng)價(jià)，其中PC1的方差貢獻(xiàn)率最大，為32.907%，說(shuō)明PC1在整體功能性評(píng)價(jià)中為主要影響因子；PC2的方差貢獻(xiàn)率為15.530%，為次要因子；PC3、PC4、PC5的方差貢獻(xiàn)率分別為13.289%、10.991%、8.506%。

主成分分析的載荷矩陣見(jiàn)表5，PC1主要綜合了茶多酚、總游離氨基酸、EGCG、ECG、酯型兒茶素、總兒茶素的信息，可稱(chēng)為茶多酚功能性因子，在此功能因子中茶多酚、EGCG、ECG、酯型兒茶素、總兒茶素為正貢獻(xiàn)，總游離氨基酸為負(fù)貢獻(xiàn)，可能的原因是總游離氨基酸對(duì)于茶多酚和兒茶素的功能存在負(fù)面影響；PC2主要綜合了咖啡堿、C、EC的信息，可稱(chēng)為咖啡堿功能因子；PC3主要綜合了EGC、非酯型兒茶素的信息，可稱(chēng)為非酯型兒茶素功能因子；PC4主要綜合了GA、CG的信息，可稱(chēng)為沒(méi)食子酸功能因子，在此功能因子中總游離氨基酸具有正貢獻(xiàn)，可能的原因是總游離氨基酸對(duì)于酸類(lèi)和酯類(lèi)的功能作用具有正面影響；PC5主要綜合了GCG的信息，可稱(chēng)為GCG功能因子。

結(jié)合相關(guān)分析和主成分分析的結(jié)果來(lái)看，在PC1的主要貢獻(xiàn)成分中，茶多酚、EGCG、ECG、酯型兒茶素、總兒茶素含量之間存在顯著或極顯著正相關(guān)，所以可以把重合指標(biāo)進(jìn)行簡(jiǎn)化，使用總兒茶素、總游離氨基酸含量來(lái)代替此功能因子；PC2的主要貢獻(xiàn)成分中咖啡堿含量與EC含量存在極顯著正相關(guān)，所以可以使用咖啡堿、C含量來(lái)代替此項(xiàng)功能因子；PC3中EGC含量與非酯型兒茶素含量存在極顯著正相關(guān)，所以使用非酯型兒茶素含量來(lái)代替；PC4中兩者相關(guān)性不明顯。因此，將茶樹(shù)資源功能性評(píng)價(jià)指標(biāo)簡(jiǎn)化為總兒茶素、總游離氨基酸、咖啡堿、C、非酯型兒茶素、GA、CG、GCG含量，即此8項(xiàng)指標(biāo)基本可以反映茶樹(shù)資源的功能性品質(zhì)。

2.4 功能型茶樹(shù)資源的綜合評(píng)價(jià)

通過(guò)表4各主成分的初始特征值與表5各主成分指標(biāo)的載荷值構(gòu)建出5個(gè)主成分的線性方程模型，分別為模型1—5，即使用各主成分中功能成分的載荷向量除以對(duì)應(yīng)主成分初始特征值的算術(shù)平方根，從而得出來(lái)各個(gè)主成分中功能成分的特征值[18,28]。構(gòu)建出的5個(gè)主成分線性方程模型見(jiàn)表6，據(jù)此5個(gè)主成分的線性方程模型可以計(jì)算出茶樹(shù)資源中功能成分在各主成分中的評(píng)價(jià)指數(shù)。再以表4中5個(gè)主成分所對(duì)應(yīng)的初始特征值除以5個(gè)主成分初始特征值之和作為權(quán)重，分別乘以各主成分中茶樹(shù)資源的功能成分評(píng)價(jià)指數(shù)，最終建立出來(lái)茶樹(shù)資源的綜合評(píng)價(jià)指數(shù)模型，結(jié)果見(jiàn)表6，據(jù)此模型可以對(duì)于茶樹(shù)資源的功能性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

圖1 主成分分析特征值碎石圖Fig.1 Gravel map of eigenvalues in principal component analysis

表4 主成分的特征值與方差貢獻(xiàn)率Tab.4 Characteristic value and variance contribution rate of principal components

表5 主成分分析載荷矩陣Tab.5 Load matrix of principal component analysis

表6 綜合評(píng)價(jià)模型構(gòu)建Tab.6 Construction of comprehensive evaluation model

使用構(gòu)建的綜合評(píng)價(jià)指數(shù)模型(表6)對(duì)45份茶樹(shù)資源的功能性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，按照綜合評(píng)價(jià)指數(shù)大小對(duì)綜合評(píng)價(jià)結(jié)果進(jìn)行降序排列，結(jié)果見(jiàn)圖2，綜合評(píng)價(jià)指數(shù)越大，說(shuō)明茶樹(shù)資源的功能性越好。結(jié)合圖2各資源綜合評(píng)價(jià)指數(shù)差異分布確定等級(jí)劃分的閾值，將各份茶樹(shù)資源的功能性品質(zhì)優(yōu)劣劃分為4個(gè)等級(jí)，綜合評(píng)價(jià)指數(shù)>7.0，為功能性最好的資源，依次為編號(hào)7、22、21、27、19等5份資源；綜合評(píng)價(jià)指數(shù)6.0～7.0為功能性較好的茶樹(shù)資源，依次為編號(hào)23、31、10、1、20、13、30、18、6、28、24、8、41、5、9、42、29、4、26、32、17、12等22份資源；綜合評(píng)價(jià)指數(shù)5.0～6.0為功能性一般的茶樹(shù)資源，依次為編號(hào)33、3、14、16、25、37、38、15、45、34、36、40、11、2等14份資源；綜合評(píng)價(jià)指數(shù)<5.0為功能性較差的茶樹(shù)資源，依次為35、44、39、43等4份資源。

用LSD法對(duì)上述所劃分的類(lèi)群進(jìn)行多重比較結(jié)果表明，所劃分的4個(gè)等級(jí)茶樹(shù)資源的綜合評(píng)價(jià)指數(shù)在0.05水平差異顯著，說(shuō)明該等級(jí)劃分結(jié)果合理。

圖2 45份茶樹(shù)資源的綜合評(píng)價(jià)指數(shù)

3 結(jié)論與討論

本研究測(cè)定了江西省內(nèi)45份茶樹(shù)資源的14個(gè)主要功能成分指標(biāo)，各個(gè)指標(biāo)的變異系數(shù)為12.55%～74.05%，均值33.25%，比四川[29]、廣西[30]、陜西[31]的偏高，說(shuō)明供試45份茶樹(shù)資源的功能成分差異較大，但各個(gè)資源沒(méi)有離群點(diǎn)，均在可接受范圍之內(nèi)。由此說(shuō)明，從江西省內(nèi)選育出具備優(yōu)良功能性茶樹(shù)品種的潛力較大。羅理勇等[32]研究重慶主栽茶樹(shù)品種生化成分時(shí)發(fā)現(xiàn)，茶多酚與氨基酸含量呈顯著負(fù)相關(guān)，EGCG、ECG、酯型兒茶素、總兒茶素含量之間呈顯著正相關(guān)。趙洋等[33]研究22個(gè)茶樹(shù)品種春梢生化成分時(shí)發(fā)現(xiàn)，茶多酚含量與氨基酸含量呈負(fù)相關(guān)。王小萍等[34]研究不同茶樹(shù)資源春梢生化成分時(shí)發(fā)現(xiàn)，EGCG、酯型兒茶素、總兒茶素含量之間存在顯著正相關(guān)。同樣，本研究在對(duì)茶樹(shù)資源14個(gè)主要功能成分指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)分析時(shí)也發(fā)現(xiàn)，部分功能成分指標(biāo)之間顯著相關(guān)，存在較大的信息重疊，故使用相關(guān)分析與主成分分析從14個(gè)主要功能成分指標(biāo)中篩選出了總兒茶素、總游離氨基酸、咖啡堿、C、非酯型兒茶、GA、CG、GCG等8個(gè)關(guān)鍵評(píng)價(jià)指標(biāo)。此種簡(jiǎn)化評(píng)價(jià)指標(biāo)的方法在核桃果實(shí)評(píng)價(jià)[35]、獼猴桃品質(zhì)指標(biāo)評(píng)價(jià)[36]、棗類(lèi)優(yōu)良單株篩選[37]中被準(zhǔn)確應(yīng)用，能夠較為有效和科學(xué)地降低評(píng)價(jià)指標(biāo)的重復(fù)性。

主成分分析通過(guò)降維把茶樹(shù)資源的功能簡(jiǎn)化為5個(gè)代表性的功能因子，分別為茶多酚功能因子、咖啡堿功能因子、非酯型兒茶素功能因子、沒(méi)食子酸功能因子和GCG功能因子，以上結(jié)果基本符合茶葉功能品質(zhì)的要求[8,38-40]。依據(jù)構(gòu)建出來(lái)的5個(gè)模型可以按照不同主因子的功能分類(lèi)進(jìn)行針對(duì)性的選種，從而篩選出具有單獨(dú)功能的茶樹(shù)資源。關(guān)于綜合評(píng)價(jià)指數(shù)等級(jí)閾值的劃分，前人更多是按照指數(shù)差異進(jìn)行直接劃分，這樣進(jìn)行等級(jí)劃分過(guò)于主觀，缺乏閾值檢驗(yàn)性，本研究采用LSD法進(jìn)行多重比較檢驗(yàn)，直到劃分的等級(jí)閾值達(dá)到顯著差異水平，劃分方法更加合理。依據(jù)綜合評(píng)價(jià)結(jié)果來(lái)看，功能性最好的茶樹(shù)資源有浮梁櫧葉、巖背垴2號(hào)、江茶15號(hào)、黃金茶、浮梁廣明2號(hào)共5份，此5份資源中有4份為江西本地資源，是從浮梁和寧都選育出的新品系，在抗性、適應(yīng)性與適制性方面表現(xiàn)較好，有望成為功能性新品種；另1份(黃金茶)為省外引種馴化的資源，可作為遺傳親本材料或直接使用。

對(duì)茶樹(shù)資源功能成分進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)是茶樹(shù)功能品種選育的基礎(chǔ)[41]，另外，功能茶樹(shù)品種的抗性、適應(yīng)性、適制性等也應(yīng)作為評(píng)價(jià)的主要因素。本研究使用的茶葉功能成分指標(biāo)僅有14項(xiàng)，目前研究出的茶葉功能成分已近500余項(xiàng)，下一步研究將集中在擴(kuò)大功能成分的評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)所篩選的功能性強(qiáng)的茶樹(shù)資源進(jìn)行創(chuàng)新利用與功能品種選育。