何波，崔清洋，逯軍

本文要點：

（1）采用全外顯子測序確定了罹患反復(fù)呼吸道感染17年余的患者病因，解除了患者及其家庭的苦惱；在基因測序方興未艾的時代，臨床上遇到反復(fù)感染的患者應(yīng)想到免疫缺陷的可能，進(jìn)一步行全外顯子或全基因組測序可能對診斷有所幫助；（2）本例患者在基因檢測結(jié)果出來之前即自動要求出院，加上醫(yī)院條件限制，患者臨床表型與原發(fā)性纖毛運動功能障礙相似而未能行肺部透視電鏡檢查確診。

活化的PI3K-δ綜合征（APDS） 是 ANGULO 等［1］于2013年首次報道的一種臨床上罕見的常染色體顯性遺傳性原發(fā)性聯(lián)合免疫缺陷病，其發(fā)生原因為PIK3CD基因（NM_005026）發(fā)生功能獲得性（GOF）變異引起該基因編碼的p110δ活性升高，PI3K-AKT-mTOR信號途徑過度活化，可導(dǎo)致反復(fù)呼吸道感染、肝脾淋巴結(jié)腫大及巨細(xì)胞病毒和/或EB病毒血癥。APDS具有較強的表型異質(zhì)性，病情輕者可至成年期才出現(xiàn)相關(guān)癥狀，嚴(yán)重者于兒童期即表現(xiàn)為致死性嚴(yán)重免疫缺陷［2］。目前APDS國內(nèi)報道較少，本文回顧性分析了中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院收治的1例APDS患者的臨床資料和基因檢測結(jié)果，旨在加深臨床醫(yī)師對該病的認(rèn)識。

1 病例資料

患者，男，18歲，因反復(fù)呼吸道感染17年余，咳嗽10余天于2019-02-25入院?；颊咦詪雰浩诔霈F(xiàn)反復(fù)呼吸道感染（＞1次/月），支氣管肺炎2～3次/年，感染時伴肝脾腫大，在當(dāng)?shù)蒯t(yī)院住院多次并經(jīng)抗感染及對癥支持治療后好轉(zhuǎn)。10余天前無誘因出現(xiàn)發(fā)熱，熱峰39 ℃，經(jīng)對癥處理后發(fā)熱緩解，但伴有咳嗽、咳黃色黏痰，再次就診于當(dāng)?shù)蒯t(yī)院門診，按“支氣管炎”予抗感染及對癥治療1周后未再發(fā)熱，咳嗽稍好轉(zhuǎn)。患者2 d前受涼后咳嗽較前加重，伴雙下肢乏力而入住本院。10年前患者于某醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院診斷為免疫功能低下；2004年患者因全身多處淋巴結(jié)腫大于某醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院診斷為慢性淋巴結(jié)炎；2007年患者左側(cè)頸部淋巴結(jié)活檢結(jié)果顯示淋巴結(jié)反應(yīng)性增生改變，經(jīng)治療全身淋巴結(jié)腫大基本消失；2011年患者雙膝關(guān)節(jié)腫痛并就診于當(dāng)?shù)蒯t(yī)院門診，初始予以中藥熱敷等治療后癥狀消失，但2017年再次出現(xiàn)雙膝關(guān)節(jié)腫痛，雙膝關(guān)節(jié)MRI提示雙膝關(guān)節(jié)積液，考慮滑膜炎，予抗感染及對癥治療后雙膝關(guān)節(jié)腫痛緩解；2017年2月當(dāng)?shù)厥兄嗅t(yī)院送檢患者遺傳代謝病基因檢測結(jié)果顯示攜帶PHKB基因Exon26的c.2603_2604insGCATC雜合變異（糖原貯積癥IXb型？）；患者系第2胎第2產(chǎn)，足月剖宮產(chǎn)，出生時無產(chǎn)傷及窒息史，3個月抬頭，6個月獨坐，11個月會行走，智力發(fā)育同于同性別同齡兒。父母否認(rèn)近親結(jié)婚，父母體健。入院體格檢查：體溫 36.3 ℃，脈搏 92次/min，呼吸25次/min，體質(zhì)量44 kg，左側(cè)頸部可捫及淺表淋巴結(jié)腫大，呼吸規(guī)則，雙肺可聞及中等量濕性啰音。心臟查體未見異常。腹部平坦，肝臟右肋下3 cm觸及，脾臟左肋下5 cm觸及，質(zhì)韌，無明顯壓痛。2017-12-31患者于外地市中醫(yī)院查免疫球蛋白（Ig）：IgA 0.07 g/L，IgG 0.09 g/L，IgM 0.28 g/L；本院實驗室檢查：白細(xì)胞計數(shù)（WBC）4.38×109/L，紅細(xì)胞計數(shù)（RBC）4.92×1012/L，血紅蛋白（Hb）121 g/L，血小板計數(shù)（PLT）202×109/L；超敏 C 反應(yīng)蛋白（hs-CRP）11.7 mg/L；IgA 0.03 g/L，IgM 0.20 g/L，IgG 0.90 g/L；抗鏈球菌溶血素“O”、類風(fēng)濕因子、紅細(xì)胞沉降率及抗環(huán)瓜氨肽抗體均為陰性；肝腎功能、電解質(zhì)、心肌酶、肌鈣蛋白T、血脂全項、銅藍(lán)蛋白、血糖及乳酸均未見異常；血氣分析結(jié)果基本正常；抗肺炎支原體、肺炎衣原體、腺病毒、呼吸道合胞病毒、EB病毒及巨細(xì)胞病毒IgM均為陰性。乙肝五項及傳染病三項（人類免疫缺陷病毒、丙型肝炎病毒及梅毒）均為陰性；流式細(xì)胞儀檢測外周血T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、自然殺傷（NK）細(xì)胞結(jié)果顯示：CD19+1.9%，CD19+30 個 /μl，CD16+CD56+6.9%，CD16+CD56+111 個 /μl，CD3+1 702 個 /μl，CD4+350 個 /μl，CD8+1 312 個 /μl，CD4+/CD8+為0.27。人類白細(xì)胞抗原B-27（HLAB27）陽性。心臟彩超：右房室瓣輕度反流，余心內(nèi)結(jié)構(gòu)及血流未見明顯異常；左心功能未見異常。肝膽脾胰及泌尿系彩超結(jié)果顯示：肝臟稍大，脾臟輕～中度腫大；膽管系統(tǒng)及胰腺未見異常；雙腎、輸尿管、膀胱及前列腺未見明顯異常。胸部CT結(jié)果顯示：雙肺多發(fā)支氣管擴張伴肺內(nèi)感染；雙側(cè)胸膜局限性增厚；縱隔及雙側(cè)腋窩多發(fā)稍大淋巴結(jié)（見圖1）。顱腦MRI結(jié)果顯示：腦室系統(tǒng)增大，腦實質(zhì)萎縮；雙側(cè)頜竇、篩竇、蝶竇及額竇炎癥；左側(cè)乳突炎癥。入院初步診斷：（1）支氣管肺炎；（2）免疫缺陷；（3）糖原貯積癥？

入院后給予頭孢曲松鈉、阿奇霉素聯(lián)合抗感染，咳嗽好轉(zhuǎn)，肺部濕性啰音減少。

2 基因檢測

因考慮到某些免疫缺陷病與基因突變有關(guān)，故采集患者外周血4 ml及其父母外周血各2 ml，乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，送北京康旭醫(yī)學(xué)檢驗有限公司進(jìn)行基因檢測。提取患者及其父母基因組DNA，使用Illumina高通量測序儀和Agilgent公司的SureSelect探針富集體系進(jìn)行二代基因檢測。使用軟件CASAVA（1.8.2）將原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為可識別的堿基序列，然后進(jìn)行Align分析、SNP分析和DIP分析，獲得靶向區(qū)域變異位點的信息。通過PolyPhen-2、SIFT、Mutation Taster進(jìn)行蛋白質(zhì)損傷分析，獲得需要進(jìn)一步驗證的變異位點。PIK3CD及SPAG1基因引物見表1。PCR擴增條件為：95 ℃預(yù)變性 10 min，95 ℃變性 30 s（35 個循環(huán)），60 ℃退火 30 s（35個循環(huán)），72 ℃延伸45 s（35個循環(huán)），72 ℃徹底延伸5 min（35個循環(huán)）。

在人類基因組數(shù)據(jù)庫GenBank中獲得PIK3CD及SPAG1變異位點基因序列，在引物設(shè)計網(wǎng)站Primer Z（http：//genepipe.ncgm.sinica.edu.tw/primerz/primerz4.do）設(shè)計并合成引物。對變異位點進(jìn)行PCR擴增后進(jìn)行一代測序驗證，排除二代測序中假陽性的位點。

測序分析發(fā)現(xiàn)患者PIK3CD基因第24號外顯子c.3061G＞A（p.Glu1021Lys）雜合錯義變異和SPAG1基因（NM_172218）第10號外顯子c.1059_1060insGAC （p.Ser354delinsAspSer）純合變異。使用Sanger測序進(jìn)行驗證及父母來源分析。患者父母均未攜帶PIK3CD基因c.3061G＞A （p.Glu1021Lys）位點的雜合錯義變異，考慮為新生變異（見圖2、表2）。患者父母SPAG1 基因均攜帶 c.1059_1060insGAC （p.Ser354delinsAspSer）雜合變異，證實患者SPAG1基因變異分別來源于其父母（見表2）。

根據(jù)美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會（ACMG）聯(lián)合美國分子病理學(xué)會（AMP）2015年制定的“基因序列變異的解釋標(biāo)準(zhǔn)和指南”進(jìn)行致病性分析［3］。（1）PIK3CD基因c.3061G＞A變異致病性：①c.3061G＞A變異為錯義變異，為致病變異（強致病性證據(jù)，PS1）；②新生變異（De novo）且無家族史（經(jīng)家系驗證）（強致病性證據(jù)，PS2）；③c.3061G＞A變異通過比照千人基因組數(shù)據(jù)庫（1 000 Genomes）、人類基因突變數(shù)據(jù)庫（HGMD）未見其收錄（中等致病性證據(jù)，PM2）；④位于突變熱點和/或位于已知無良性變異的關(guān)鍵功能區(qū)域（中等致病性證據(jù)，PM1）；⑤近期有可靠機構(gòu)報告該變異為致病的，但證據(jù)尚不足以支持進(jìn)行實驗室獨立評估（支持性致病性證據(jù)，PP5）；⑥在某基因中良性的錯義變異比例很低，且該基因中的錯義變異是導(dǎo)致疾病發(fā)生的常見原因，則該基因的錯義變異適用該證據(jù)（支持性致病性證據(jù)，PP2）；⑦經(jīng)多種算法預(yù)測會對基因或基因產(chǎn)物功能造成有害影響的變異（支持性致病性證據(jù)，PP3）；⑧c.3061G＞A變異經(jīng)PolyPhen2、SIFT、Mutation Taster軟件預(yù)測結(jié)果分別為 Deleterious、Probably damaging 和 Disease _causing（ 見 表3），且c.3061G＞A變異發(fā)生在PI3Kc_IA_delta結(jié)構(gòu)域內(nèi)（參考BCBI數(shù)據(jù)庫）。綜合上述c.3061G＞A變異的證據(jù)強度為“PS1+PM2+PS2+PM1+PP2+PP5+PP3”，判斷為致病性變異。因患者父母均無該病的臨床表型，故為新生變異，且符合常染色體顯性遺傳方式。（2） SPAG1基因c.1059_1060insGAC變異致病性：①因非重復(fù)區(qū)域內(nèi)的整碼插入/缺失（插入、缺失的堿基數(shù)是3的整倍數(shù)），或終止密碼子缺失導(dǎo)致蛋白質(zhì)長度變化的變異（中等致病性證據(jù)，PM4）；②插入GAC三個堿基后沒有導(dǎo)致前后編碼氨基酸發(fā)生變化，且該位置不在結(jié)構(gòu)域內(nèi)。綜合上述，c.1059_1060insGAC變異的證據(jù)強度為“PM4”，判斷為臨床意義不明，且該基因變異經(jīng)Mutation Taster軟件預(yù)測為可能良性（見表3）。SPAG1基因是原發(fā)性纖毛運動障礙的致病基因，為常染色體隱性遺傳方式，對于該類遺傳方式，純合變異可能導(dǎo)致發(fā)病。檢測患者SPAG1基因發(fā)現(xiàn)的c.1059_1060insGAC純合變異分別遺傳自其父母，父母均為雜合狀態(tài)，符合常染色體隱性遺傳方式，且患者有反復(fù)呼吸道感染、胸部CT顯示支氣管擴張及顱腦MRI顯示副鼻竇炎等表型，但ACMG聯(lián)合AMP綜合判斷SPAG1基因c.1059_1060insGAC位點的致病性為臨床意義不明，因此目前數(shù)據(jù)尚不能認(rèn)為SPAG1基因c.1059_1060insGAC變異位點具有致病性。

2017年2月當(dāng)?shù)厥兄嗅t(yī)院送檢患者遺傳代謝病基因檢測顯示攜帶PHKB基因Exon26的c.2603_2604insGCATC雜合變異，該突變?yōu)橐拼a變異（預(yù)計會使翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)從第868位氨基酸Phe開始編碼發(fā)生紊亂，并導(dǎo)致翻譯提前終止），預(yù)計會導(dǎo)致編碼蛋白質(zhì)截短而喪失其正常功能，但該基因位點未見文獻(xiàn)報道，ESP6500siv2_ALL、dbSNP147和千人基因組（10002015aug_ALL）數(shù)據(jù)庫未見收錄，父母未送標(biāo)本進(jìn)行基因檢測，考慮為新發(fā)變異，但PHKB基因所致糖原貯積癥IXb型通常以常染色體隱性方式遺傳，故該基因位點變異無致病性。

表1 PIK3CD和SPAG1基因引物Table 1 Primers of PIK3CD and SPAG1 genes

表2 PIK3CD和SPAG1基因變異位點及父母攜帶情況Table 2 PIK3CD and SPAG1 gene mutation sites and parental carrier

表3 PIK3CD和SPAG1基因變異位點致病性生物信息性軟件預(yù)測Table 3 The pathogenicity of PIK3CD and the SPAG1 gene mutation site predicted by bioinformatics software

依據(jù)患者的臨床癥狀、免疫表現(xiàn)及基因檢測結(jié)果，APDS診斷明確，因患者在基因檢測結(jié)果出來前即要求出院，故未予相應(yīng)治療。

3 討論

圖1 患者胸部CT檢查結(jié)果Figure 1 Chest CT examization results of one case of activated PI3K delta syndrome caused by PIK3CD gene mutation

圖2 PIK3CD基因c.3061G＞A 突變測序峰圖Figure 2 Peak map of c.3061G＞A mutation in PIK3CD gene

原發(fā)性免疫缺陷（PID）是一組可引起免疫功能障礙的疾病，表現(xiàn)為感染易感性增加，許多PID是單基因疾病。迄今為止，超過300個基因的突變被證明會導(dǎo)致PID，其中APDS為最近描述的PID，由功能獲得性PIK3CD基因突變所致，該基因編碼PIK3CD的催化亞單位，免疫特征是高IgM，IgG和IgA缺陷，CD4+淋巴細(xì)胞減少。由于目前全球APDS病例報道較少，故尚沒有相關(guān)發(fā)病率，且尚無統(tǒng)一的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，其確診主要依靠基因檢測?？贵w缺陷是兒童最常見的PID類型。認(rèn)識免疫功能受損的發(fā)病機制不僅對預(yù)防復(fù)發(fā)性或正確治療危及生命的感染非常重要，而且對載體檢測、產(chǎn)前診斷和可能的基因治療也非常重要。

PIK3CD位于1p36.22，含22個外顯子，編碼1044位氨基酸。大部分APDS患者為常染色體顯性功能獲得性E1021K變異，位于激酶結(jié)構(gòu)域。目前，已發(fā)現(xiàn)數(shù)個常染色體顯性功能獲得性錯義變異如N334K、C416R、E525K、G124D、E81K也可引起 APDS［4］。

PI3Kδ通路中的信號平衡對維持正常的免疫功能至關(guān)重要。APDS患者的臨床特點是反復(fù)發(fā)作的肺部感染、淋巴結(jié)病變和淋巴細(xì)胞增生，以及EB病毒感染和巨細(xì)胞病毒感染易感性增加。p110δ主要在造血細(xì)胞系中表達(dá)，是T、B淋巴細(xì)胞抗原受體（TCR和BCR）、Toll樣受體（TLR）、共刺激分子、T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和骨髓細(xì)胞的細(xì)胞因子受體下游的主要PI3K亞型信號，PI3Kδ主要激活下游的細(xì)胞因子受體、TLR、B細(xì)胞和T細(xì)胞受體［5］。PI3K在淋巴細(xì)胞的功能維持發(fā)揮著重要的作用，分別編碼PI3K p110δ和p85α亞基的PIK3CD和PIK3R1基因變異可導(dǎo)致PI3K活性增加，造成免疫缺陷和免疫失調(diào)。

PIK3CD編碼的p110δ催化亞基（PIK3CA與PIK3CB分別編碼p110α 與p110β）與調(diào)節(jié)亞基p85α共同形成的二聚體結(jié)構(gòu)脂質(zhì)激酶P13Kδ主要參與P13K-AKT-mTOR信號通路功能［1］，可調(diào)節(jié)亞基穩(wěn)定催化亞基，防止被蛋白酶體降解，抑制催化亞基活性，并將其吸收到細(xì)胞質(zhì)膜上；催化亞基p110α和p110β廣泛表達(dá)，而p110δ主要表達(dá)在髓細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。P13Kδ是一種脂質(zhì)激酶，磷酸化PIP2即為PIP3，而PIP3為最活躍的脂質(zhì)第二信使，控制著細(xì)胞代謝、生長、增殖、分化、移動和存活。PIK3CD基因變異具有GOF變異的特點，c.3061G＞A（E1021K）點突變是PIK3CD基因的熱點突變，劉輝等［6］首次報道了該基因位點的純合變異病例，而p110δ蛋白質(zhì)、E1021K定位類似于另一個PI3K的體細(xì)胞突變H1047R同種型p110α，且E1021K和H1047R均可通過增強催化亞基與膜的結(jié)合而促進(jìn)PIP2更有效地磷酸化，從而提高PI3K的活性。PIK3R1基因（編碼p85α，p55α and p50α）變異也可引起PI3Kδ的過度活化，出現(xiàn)和APDS相似的臨床綜合征，并把其命名為APDS2［5］。APDS2屬常染色體隱性遺傳，其中PIK3R1的變異可引起調(diào)節(jié)亞基p85α的表達(dá)缺失，導(dǎo)致P13K-AKT-mTOR信號通路的過度活化。PIK3CD基因的E1021Kp110δ和野生型p110δ相比具有更高的細(xì)胞膜親和力和調(diào)節(jié)亞基p85α的結(jié)合力，可導(dǎo)致P13KAKT-mTOR信號通路過度激活，引起肝、脾、淋巴結(jié)腫大等。

本例患者基因檢測結(jié)果顯示為熱點突變的c.3061G＞A（E1021K），而其父母未攜帶該基因位點，且其父母臨床表型正常，故為新生變異［1，5，7-8］。

原發(fā)性纖毛運動障礙屬常染色體隱性遺傳是一種異質(zhì)性遺傳病，主因纖毛運動異常所致，其主要臨床表現(xiàn)包括反復(fù)的呼吸道感染、鼻竇炎、中耳炎、支氣管擴張、內(nèi)臟轉(zhuǎn)位、不孕不育等，目前認(rèn)為有33個已知基因突變可導(dǎo)致該病。本例患者表現(xiàn)為反復(fù)呼吸道感染17年余，胸部CT顯示支氣管擴張，顱腦MRI顯示副鼻竇炎，符合上述臨床表現(xiàn)的一部分，且基因測序發(fā)現(xiàn)患者SPAG1 基因c.1059_1060insGAC為純合變異，分別遺傳自父母，父母均為雜合狀態(tài)，符合常染色體隱性遺傳方式，且Mutation Taster軟件預(yù)測為可能良性，但透射電鏡檢查為診斷該病的金標(biāo)準(zhǔn)，由于本院條件限制及患者出院時基因檢測結(jié)果尚未返回，故綜合目前數(shù)據(jù)尚不能認(rèn)為SPAG1基因c.1059_1060insGAC變異位點具有致病性并診斷為原發(fā)性纖毛運動障礙。

APDS的臨床特點為反復(fù)發(fā)作的肺部感染，淋巴結(jié)病變和淋巴細(xì)胞增生，本例患者反復(fù)呼吸道感染17年余，感染時伴肝脾腫大，15年前因全身多處淋巴結(jié)腫大而于外院診斷為慢性淋巴結(jié)炎，12年前左側(cè)頸部淋巴結(jié)活檢結(jié)果顯示淋巴結(jié)反應(yīng)性增生改變，但APDS易和其他PID如高IgM綜合征、EB病毒相關(guān)淋巴細(xì)胞增殖病及自身免疫性淋巴細(xì)胞增生癥等相混淆，鑒別診斷需進(jìn)行基因檢測。

本例患者病程中出現(xiàn)雙膝關(guān)節(jié)炎，經(jīng)抗感染及對癥治療后雙膝關(guān)節(jié)腫痛緩解，與唐紅霞等［9］報道類似。本例患者免疫特征是CD4+淋巴細(xì)胞減少，外院及本院的免疫球蛋白檢查均顯示其IgM，IgG和IgA均明顯降低，與APDS的高IgM特征不同。

APDS患者的治療方案包括抗生素預(yù)防和免疫球蛋白替代療法。造血干細(xì)胞移植已成功應(yīng)用于多例APDS患者，可作為治療選擇，尤其是年輕患者［8，10］；旨在減少淋巴增生的免疫抑制療法包括用利妥昔單抗和雷帕霉素靶向mTOR途徑激活治療，其中雷帕霉素治療能改善免疫標(biāo)志物，減少脾腫大和淋巴結(jié)病［9］。此外，APDS病因和激活PI3Kδ突變致病作用為使用選擇性PI3Kδ抑制劑進(jìn)行新的特異性治療提供了機會，而PI3Kδ抑制劑可使體外培養(yǎng)的APDS患者細(xì)胞PI3Kδ超活化正?；?，5，11-14］，這為臨床應(yīng)用PI3Kδ抑制劑治療APDS患者開辟了新途徑。目前正在進(jìn)行的Ⅱ期臨床試驗旨在研究PI3Kδ抑制劑在APDS患者中的安全性、藥動學(xué)、藥效學(xué)和療效。

由于PID涉及的病種繁多，且APDS的臨床癥狀復(fù)雜、涉及全身多個系統(tǒng)，本例患者至成年才被確診，故臨床醫(yī)師增強對罕見?。òˋPDS）的認(rèn)識顯得至為重要，而及時的基因檢測有助于確診，早期適時治療有助于改善臨床癥狀。

作者貢獻(xiàn)：何波負(fù)責(zé)病例資料的收集與分析、整理及文章的撰寫；崔清洋對文章部分內(nèi)容、文字表達(dá)給予建議并進(jìn)行修改；逯軍負(fù)責(zé)文章的審核及部分專業(yè)知識的指導(dǎo)工作，對文章整體負(fù)責(zé)、監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。