陳 莉，李亞童，李歡歡，海力茜·陶爾大洪

（新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，新疆烏魯木齊 830011）

新疆和田大棗為鼠李科（Rhamnaceae） 棗屬（Zizyphusmill）植物的成熟果實(shí)棗（Zizyphus jujuba mill），經(jīng)烘干、烤制或者晾、曬而成的食用或藥用性產(chǎn)品。和田大棗的果皮呈深紅色，果肉飽滿有彈性[1]。藏醫(yī)名著中記載道，大棗具有性溫、味酸、清心熱、治心病等作用[2]。

多糖是由相同的單糖組合而成，如糖原和淀粉。多糖廣泛存在于植物、動(dòng)物和微生物的細(xì)胞壁中[3-4]。大量的藥理和臨床研究表明天然多糖具有廣泛的藥理活性，如免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗病毒、降血糖、調(diào)血脂、抗衰老等，又因其具有高效、安全、低副作用等特點(diǎn)，所以多糖成為國內(nèi)外學(xué)者研究熱點(diǎn)。近年來，多糖類化合物已在醫(yī)藥、食品、化妝品等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用[5-6]。試驗(yàn)采用超聲提取，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)最后確定新疆和田大棗多糖最佳提取工藝，以期為應(yīng)用于今后的試驗(yàn)研究提供理論參考。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

DHG-9075A型減壓真空干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品；DT-200型分析天平、UV-2550型紫外分光光度儀，日本島津公司產(chǎn)品。

1.2 試劑

無水乙醇、正丁醇，天津市富宇精細(xì)化工有限公司提供；95%乙醇，天津市大茂化學(xué)試劑廠提供；5%葡萄糖，國藥集團(tuán)新疆制藥有限公司提供；氯仿、濃硫酸、丙酮，均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 多糖的測定

采用苯酚－硫酸法測定大棗多糖含量。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取5%葡萄糖0.2 mL置于100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，精密移取葡萄糖溶液0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8 mL分別置于試管中，加水至2 mL，再依次加入5%苯酚1.0 mL，濃硫酸5.0 mL，于90℃下加熱15 min，冷卻至室溫，以2 mL蒸餾水，1.0 mL苯酚，5.0 mL濃硫酸定容至刻度的溶液做空白對照，于波長490 nm處測吸光度。以葡萄糖質(zhì)量濃度C（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y=17.057X+0.001 4（R2=0.999 7），樣品檢測量為 0.015～0.040 mg/mL時(shí)與吸光度線性關(guān)系良好。

2.3 方法學(xué)考查試驗(yàn)

2.3.1 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取完全反應(yīng)后的供試品2 mL，按上述方法顯色后，每隔30 min測1次吸光度，連續(xù)測6次，結(jié)果RSD值為1.3%，表明該樣品在1 h內(nèi)穩(wěn)定。

樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)見表1。

表1 樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn)

精密量取2 mL供試液，按上述方法顯色后，測其吸光度并計(jì)算RSD值為1.8%，表明樣品的重復(fù)性較好。

樣品重復(fù)性試驗(yàn)見表2。

表2 樣品重復(fù)性試驗(yàn)

2.3.3 精密度試驗(yàn)

精密吸取6份葡萄糖對照品溶液0.5 mL，置于試管中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制備重復(fù)操作，重復(fù)測定吸光度6次，結(jié)果RSD值為0.7%，表明該方法精密度良好。

精密度試驗(yàn)見表3。

2.3.4 加樣回收率試驗(yàn)

為了驗(yàn)證試驗(yàn)的準(zhǔn)確性，在樣品中加入葡萄糖對照品后測定并計(jì)算其回收率。取已知質(zhì)量濃度的多糖含量的供試品9份，各2.0 mL，置于100 mL容量瓶中，按低、中、高質(zhì)量濃度分別加入葡萄糖對照品 0.8，0.8，0.8，1.0，1.0，1.0，1.2，1.2，1.2 mL，按上述方法顯色后，用蒸餾水定容至刻度，于波長490 nm處測定吸光度，結(jié)果平均回收率98.1%，RSD值為1.3%。

表3 精密度試驗(yàn)

加樣回收試驗(yàn)見表4。

表4 加樣回收試驗(yàn)

2.4 單因素試驗(yàn)

2.4.1 料液比對大棗多糖提取率的影響

準(zhǔn)確稱取大棗粉末4份，每份2.00 g，分別設(shè)置料液比為1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，在提取溫度70℃，超聲功率80 W的超聲波清洗儀中超聲處理30 min，再抽濾、除蛋白、醇沉，將沉淀溶解并稀釋成樣液，然后精密加入1 mL苯酚和5 mL濃硫酸，靜置20 min，于波長490 nm處測定吸光度，計(jì)算提取率。

料液比對大棗多糖提取率的影響見圖1。

圖1 料液比對大棗多糖提取率的影響

由圖1可知，隨著料液比的增加，大棗多糖的提取率逐漸下降。當(dāng)料液比為1∶10（g∶mL） 時(shí)，提取率最大為6.10%。因此，選擇料液比為1∶10（g∶mL）時(shí)提取大棗中多糖最優(yōu)。

2.4.2 超聲時(shí)間對大棗多糖提取率的影響

準(zhǔn)確稱取大棗粉末4份，每份2.00 g，放入錐形瓶中，以1∶15的料液比配制溶液，分別設(shè)定超聲時(shí)間為10，20，30，40 min，在提取溫度70℃，超聲功率80 W的超聲波清洗儀中超聲提取后，再抽濾、除蛋白、醇沉，將沉淀溶解并稀釋成樣液，然后加入精密稱量的苯酚1 mL和濃硫酸5 mL，靜置20 min，于波長490 nm處測定吸光度，計(jì)算提取率。

超聲時(shí)間對大棗多糖提取率的影響見圖2。

圖2 超聲時(shí)間對大棗多糖提取率的影響

由圖2可知，隨著超聲時(shí)間的延長，多糖的提取率增加，但當(dāng)超聲時(shí)間繼續(xù)增加時(shí)，多糖的提取率有所降低，可能是因?yàn)殡S著超聲時(shí)間延長，多糖大分子被降解為小分子，小分子不易沉淀，所以使得多糖的提取率降低。因此，選擇超聲時(shí)間為30 min時(shí)提取大棗中多糖最優(yōu)。

2.4.3 提取溫度對大棗多糖提取率的影響

準(zhǔn)確稱取大棗粉末4份，每份2.00 g，放入錐形瓶中，以1∶15的料液比配制溶液，分別設(shè)定提取溫度為50，60，70，80℃，在超聲功率80 W的超聲波清洗儀中超聲30 min后，再抽濾、除蛋白、醇沉，將沉淀溶解并稀釋成樣液，然后加入精密稱量的苯酚1 mL和濃硫酸5 mL，靜置20 min，于波長490 nm處測定吸光度，計(jì)算提取率。

提取溫度對大棗多糖提取率的影響見圖3。

圖3 提取溫度對大棗多糖提取率的影響

由圖3可知，隨著提取溫度的升高，多糖的提取率增加，這是由于升高溫度使得分子間運(yùn)動(dòng)增加，多糖從大棗中溶出速率增加。因此，選擇提取溫度為70℃時(shí)提取大棗中多糖最優(yōu)。

2.4.4 超聲功率對大棗多糖提取率的影響

準(zhǔn)確稱取大棗粉末4份，每份2.00 g，放入錐形瓶中，以1∶15的料液比配制溶液，分別設(shè)定超聲功率為70，80，90，100 W，于提取溫度70℃條件下超聲處理30 min后，再抽濾、除蛋白、醇沉，將沉淀溶解并稀釋成樣液，然后加入精密稱量的苯酚1 mL和濃硫酸5 mL，靜置20 min，于波長490 nm處測定吸光度，計(jì)算提取率。

超聲功率對大棗多糖提取率的影響見圖4。

圖4 超聲功率對大棗多糖提取率的影響

由圖4可知，超聲功率對多糖提取率影響明顯，超聲功率80 W時(shí)多糖提取率最高為8.07%，但隨著功率的增大，多糖可能發(fā)生了降解，從而使得多糖的提取率有所降低。因此，選擇超聲功率為80 W提取大棗中多糖最優(yōu)。

2.5 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以超聲功率（A）、提取時(shí)間（B）、超聲溫度（C）、料液比（D） 為試驗(yàn)因素，以大棗多糖的提取率為評價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)L9（34），優(yōu)化最佳提取工藝條件。

正交試驗(yàn)因素水平見表5，正交試驗(yàn)結(jié)果見表6。

表5 正交試驗(yàn)因素水平

表6 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表6可知，影響新疆和田大棗提取的影響因素的順序?yàn)槌暪β?提取溫度>超聲時(shí)間>料液比，超聲提取大棗多糖的最佳提取條件為A1B2C2D2，即超聲功率70 W，超聲時(shí)間30 min，提取溫度70℃，料液比1∶15。

2.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

為了驗(yàn)證正交試驗(yàn)所得的最優(yōu)提取工藝的穩(wěn)定性，分別等量稱取大棗粉末2.00 g共3份，根據(jù)正交設(shè)計(jì)優(yōu)選的最佳大棗多糖提取工藝A1B2C2D2操作，即料液比1∶15，超聲時(shí)間30 min，提取溫度70℃，超聲功率70 W，平行操作，進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)。結(jié)果表明，驗(yàn)證試驗(yàn)與正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)基本一致，充分證明了大棗多糖提取工藝的合理性和穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

以大棗多糖提取率為考查指標(biāo)，采用超聲輔助提取大棗多糖，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，優(yōu)化確定大棗多糖的最佳提取工藝參數(shù)。結(jié)果表明，以大棗多糖提取率為考查指標(biāo)時(shí)，影響多糖提取率的主要因素為超聲功率，對大棗多糖的提取具有顯著性影響，其次是提取溫度和超聲時(shí)間，料液比影響最小。大棗多糖的最佳提取工藝為A1B2C2D2，即料液比1∶15，超聲時(shí)間30 min，提取溫度70℃，超聲功率70 W。在最佳提取工藝條件下，多糖的提取率為7.40%。通過驗(yàn)證試驗(yàn)，證明了大棗多糖提取工藝的合理性和穩(wěn)定性。相比傳統(tǒng)的水浸提取法，超聲提取法增大了物質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)的頻率和速度，提高了提取率，具有提取效率高、提取時(shí)間短、節(jié)省藥材等優(yōu)點(diǎn)，所以超聲提取法在中草藥提取領(lǐng)域有著廣闊的前景。