高 艷，李 嘯，段 杉，劉 丹，顧 琳，趙劍虹，孫靈利

(北京市朝陽(yáng)區(qū)疾病預(yù)防控制中心，北京 100021)

現(xiàn)代社會(huì)人們生活在密閉空間的時(shí)間不斷增加，受到室內(nèi)環(huán)境病原微生物感染的風(fēng)險(xiǎn)也隨之增高。近幾年，由嗜肺軍團(tuán)菌引起的軍團(tuán)菌病(Legionnaires′ disease，LD)的數(shù)量急速上升，引起世界各國(guó)的高度重視[1-2]。軍團(tuán)菌病是一種嚴(yán)重的潛在致命性肺炎，主要由吸入的嗜肺軍團(tuán)菌污染的霧化水引起[3]。軍團(tuán)菌主要在溫水中繁殖并存活，與人造水系統(tǒng)有關(guān)，包括冷卻塔、建筑用水、漩渦水療和裝飾性噴泉等。許多國(guó)家出臺(tái)了水環(huán)境中的嗜肺軍團(tuán)菌監(jiān)測(cè)方案，作為防止軍團(tuán)菌病暴發(fā)流行的重要控制環(huán)節(jié)[4-7]。

我國(guó)原衛(wèi)生部于2006年頒布了《公共場(chǎng)所集中空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)衛(wèi)生規(guī)范》的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，依據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)，各級(jí)疾控部門(mén)和監(jiān)督部門(mén)相繼開(kāi)展了公共場(chǎng)所集中空調(diào)嗜肺軍團(tuán)菌的監(jiān)測(cè)、評(píng)價(jià)和調(diào)查工作。2013年，中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《公共場(chǎng)所衛(wèi)生檢驗(yàn)方法》(GB/T 18204.5—2013)[8]出臺(tái)，其中，第5部分介紹了集中空調(diào)冷凝水、冷卻水中嗜肺軍團(tuán)菌的檢測(cè)方法。上述行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)集中空調(diào)冷凝水、冷卻水中嗜肺軍團(tuán)菌的檢測(cè)方法基本相同，且與歐美等國(guó)家監(jiān)測(cè)方法相似[9-10]，即通過(guò)對(duì)集中空調(diào)冷凝水、冷卻水進(jìn)行過(guò)濾、洗脫、酸處理、熱處理后進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)。該方法需要多種儀器，且耗材種類(lèi)繁多，流程復(fù)雜，須由多名試驗(yàn)人員共同完成，具有較高的試驗(yàn)成本。

近年來(lái)出現(xiàn)了幾種新的嗜肺軍團(tuán)菌定量檢測(cè)方法，其中，酶底物法是嗜肺軍團(tuán)菌利用酶底物試劑中氨基酸、維生素和其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)迅速生長(zhǎng)和增殖，其代謝產(chǎn)物與試劑發(fā)生反應(yīng)使溶液顯褐色，基于最可能數(shù)(most probable number，MPN)方法對(duì)樣本中嗜肺軍團(tuán)菌進(jìn)行定量分析。2018年，北美、歐洲開(kāi)始相繼應(yīng)用該方法在飲用水和非飲用水中檢測(cè)嗜肺軍團(tuán)菌[11-14]。目前，我國(guó)還未對(duì)該方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。

本研究應(yīng)用我國(guó)GB/T 18204.5—2013[8]推薦的過(guò)濾培養(yǎng)法與酶底物法同時(shí)對(duì)本地區(qū)公共場(chǎng)所非飲用水中嗜肺軍團(tuán)菌進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，比較兩種方法的優(yōu)點(diǎn)和不足，探討酶底物法應(yīng)用于非飲用水中嗜肺軍團(tuán)菌檢測(cè)的可行性。

1 材料和方法

1.1 樣本來(lái)源

84件非飲用水樣本采集于2019年8月—10月朝陽(yáng)區(qū)24家公共場(chǎng)所。樣本包括集中空調(diào)冷凝水9件，冷卻水55件，淋浴水20件。樣品采集方法依據(jù)GB/T 18204.5—2013[8]。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器

Quanti-tray plus程控定量封口機(jī)(IDEXX)，六聯(lián)不銹鋼微生物過(guò)濾系統(tǒng)(Sartorius)，羅氏LightCycler 480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(羅氏公司)。

1.2.2 試劑

GVPC瓊脂平板、BCYE瓊脂平板、L-半胱氨酸缺失的BCYE瓊脂平板，購(gòu)于OXOID公司。嗜肺軍團(tuán)菌乳膠凝集試劑 Lp-1型、Lp2-14型，購(gòu)于OXOID公司。嗜肺軍團(tuán)菌生化鑒定試劑盒，購(gòu)于環(huán)凱微生物。嗜肺軍團(tuán)菌核酸檢測(cè)試劑盒，購(gòu)于江蘇碩世。Legiolert試劑、預(yù)處理試劑、Legiolert定量盤(pán)，購(gòu)于IDEXX公司。

1.3 方法

1.3.1 酶底物法

(1)樣本處理與培養(yǎng)

根據(jù)Legiolert說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。在無(wú)菌微管中加入1 mL Legiolert預(yù)處理液及1 mL樣品，渦旋混勻后室溫下溫育1 min，轉(zhuǎn)移至100 mL溶解的Legiolert試劑中，充分混合并倒入Legiolert定量盤(pán)，用SealerPlus程控定量封口機(jī)密封。

將密封好的Legiolert定量盤(pán)紙側(cè)向下置于(37±0.5)℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)7 d。7 d后，定量盤(pán)中棕色孔或渾濁孔即為陽(yáng)性孔。

(2)陽(yáng)性孔確證試驗(yàn)

為了檢驗(yàn)酶底物法的特異性，對(duì)Legiolert定量盤(pán)中陽(yáng)性孔進(jìn)行確證試驗(yàn)。Legiolert定量盤(pán)共有6個(gè)大孔，90個(gè)小孔。如果陽(yáng)性孔數(shù)小于10個(gè)，全部進(jìn)行確證；如果陽(yáng)性孔數(shù)大于10個(gè)，先選取10個(gè)(包括全部大孔及隨機(jī)選取的小孔)，再加上隨機(jī)選取剩余陽(yáng)性孔數(shù)的25%進(jìn)行確證。確證方法為使用無(wú)菌注射器抽取10 μL懸浮液，涂布BCYE和L-半胱氨酸缺失的BCYE，35～37 ℃培養(yǎng)48～72 h，在BCYE上生長(zhǎng)、L-半胱氨酸缺失的BCYE上無(wú)生長(zhǎng)的菌落進(jìn)行生化鑒定、血清型別鑒定及real-time PCR鑒定。

(3)酶底物法的計(jì)量結(jié)果

酶底物法采用MPN法確定樣本中嗜肺軍團(tuán)菌含量，計(jì)算陽(yáng)性大孔和小孔的數(shù)目，并從Legiolert MPN表獲得所得的MPN值。MPN是應(yīng)用概率理論來(lái)估算細(xì)菌濃度，實(shí)際菌落數(shù)有可能落在置信區(qū)間內(nèi)的任何一點(diǎn)，MPN值是落在這個(gè)置信區(qū)間內(nèi)概率最大的一點(diǎn)。

1.3.2 過(guò)濾培養(yǎng)法

(1)過(guò)濾、洗脫、前處理

依據(jù)GB/T 18204.5—2013[8]，使用六聯(lián)不銹鋼微生物過(guò)濾系統(tǒng)對(duì)非飲用水樣本進(jìn)行過(guò)濾處理。抽濾完成后，取下濾膜置于15 mL滅菌水中充分洗脫，洗脫液在培養(yǎng)前進(jìn)行酸處理與熱處理。

(2)接種與培養(yǎng)

取酸處理樣品、熱處理樣品各0.1 mL接種GVPC。于35～37 ℃、2.5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)10 d。24 h內(nèi)長(zhǎng)出的為非嗜肺軍團(tuán)菌，24 h后長(zhǎng)出的為可疑嗜肺軍團(tuán)菌，繼續(xù)鑒定。

(3)菌落驗(yàn)證

選取可疑菌落，如果數(shù)量小于10個(gè)則全部選??；如多于10個(gè)，則選取10個(gè)及超過(guò)10個(gè)數(shù)量的25%。將選取菌落接種BCYE和L-半胱氨酸缺失的BCYE，35～37 ℃培養(yǎng)48 h，在BCYE上生長(zhǎng)、L-半胱氨酸缺失的BCYE上無(wú)生長(zhǎng)的菌落繼續(xù)進(jìn)行生化鑒定、血清型別鑒定及real-time PCR鑒定。

(4)結(jié)果判定

定性結(jié)果：酸處理與熱處理后的培養(yǎng)結(jié)果，只要有一種方法培養(yǎng)出嗜肺軍團(tuán)菌，即判斷該樣本含有嗜肺軍團(tuán)菌。

定量結(jié)果：酸處理與熱處理后的培養(yǎng)結(jié)果，選取菌落數(shù)量較大值為該樣本定量結(jié)果。

1.4 質(zhì)量控制

ATCC33152為本次研究質(zhì)控菌株。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用origin 繪圖軟件進(jìn)行繪圖。嗜肺軍團(tuán)菌陽(yáng)性率組間比較采用卡方檢驗(yàn)，嗜肺軍團(tuán)菌定量結(jié)果組間比較采用皮爾遜相關(guān)性分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05(雙側(cè))。

2 結(jié)果和討論

2.1 結(jié)果

2.1.1 兩種方法對(duì)嗜肺軍團(tuán)菌檢測(cè)的定性結(jié)果

兩種方法對(duì)84件非飲用水樣本進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，兩種方法均陽(yáng)性樣本15件，均陰性樣本56件；兩種方法相結(jié)合，共有28件樣本分離出嗜肺軍團(tuán)菌，其中，3件樣本只在過(guò)濾培養(yǎng)法中有檢出，10件樣本只在酶底物法中有檢出(表1)。

表1 酶底物法與過(guò)濾培養(yǎng)法檢測(cè)嗜肺軍團(tuán)菌的結(jié)果Tab.1 Determination Results of Positive Samples Containing Legionella pneumophila by Enzyme Substrate and Filter Culture Methods

酶底物法與過(guò)濾培養(yǎng)法對(duì)非飲用水樣本中嗜肺軍團(tuán)菌檢出結(jié)果采用McNemar檢驗(yàn)，兩種方法檢測(cè)的差異性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.092)。

2.1.2 兩種方法的特異度與靈敏度

本研究對(duì)酶底物法和過(guò)濾培養(yǎng)法的陽(yáng)性樣本均進(jìn)行了確證，無(wú)假陽(yáng)性。因此，兩種方法特異度均為100%。將檢出的嗜肺軍團(tuán)菌的全部樣本定義為真陽(yáng)性樣本(28件)，酶底物法和過(guò)濾培養(yǎng)法的靈敏度分別為89.29%(25/28)和64.29%(18/28)。結(jié)果顯示，酶底物法靈敏度高于過(guò)濾培養(yǎng)法。

2.1.3 過(guò)濾培養(yǎng)法中酸處理與熱處理檢測(cè)結(jié)果

由表2可知，過(guò)濾培養(yǎng)法中酸處理和/或熱處理后培養(yǎng)出嗜肺軍團(tuán)菌的樣本數(shù)量為18件，其中，7件只在酸處理后檢出，5件只在熱處理后檢出，6件在兩種方法處理后均有檢出。

2.1.4 兩種方法對(duì)不同樣本的檢測(cè)結(jié)果

本研究共檢測(cè)3種樣本(表2)。除了冷凝水，冷卻水與淋浴水中均有檢出嗜肺軍團(tuán)菌。酶底物法與過(guò)濾培養(yǎng)法對(duì)冷卻水和淋浴水中嗜肺軍團(tuán)菌的檢出率經(jīng)卡方費(fèi)希爾精確檢驗(yàn)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.480)。

表2 兩種方法在不同種類(lèi)樣本中檢出嗜肺軍團(tuán)菌的樣本數(shù)量Tab.2 Positive Samples Containing Legionella pneumophila by Two Methods in Different Kinds of Samples

2.1.5 兩種方法對(duì)不同血清型別嗜肺軍團(tuán)菌的檢出結(jié)果

28個(gè)樣本中嗜肺軍團(tuán)菌的血清型別分布為L(zhǎng)p-1型13個(gè)，Lp2-14型10個(gè)，另有5個(gè)樣本Lp-1型與Lp2-14型均有檢出(表3)。這5個(gè)樣本中，有4個(gè)樣本在過(guò)濾培養(yǎng)法中血清型別是單一的。在酶底物法的陽(yáng)性孔驗(yàn)證過(guò)程發(fā)現(xiàn)有混合血清型別菌落存在。

表3 兩種方法檢測(cè)嗜肺軍團(tuán)菌的血清型別分布Tab.3 Serotype Distribution of Legionella pneumophila Detected by Two Methods

兩種方法分離出的嗜肺軍團(tuán)菌的血清型別分布采用卡方費(fèi)希爾精確檢驗(yàn)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.690)。

2.1.6 兩種方法對(duì)嗜肺軍團(tuán)菌檢測(cè)的定量結(jié)果

28個(gè)樣本經(jīng)過(guò)濾培養(yǎng)法和/或酶底物法檢出嗜肺軍團(tuán)菌，其定量結(jié)果計(jì)算原理并不相同。過(guò)濾培養(yǎng)法根據(jù)GVPC上生長(zhǎng)菌落數(shù)量計(jì)算樣本中的CFU含量。酶底物法根據(jù)定量盤(pán)中變?yōu)樽厣虺霈F(xiàn)濁度的大孔和小孔的數(shù)目，從Legiolert MPN表獲得所得的MPN值，MPN值則是應(yīng)用概率理論來(lái)估算細(xì)菌濃度，但并不能表示實(shí)際菌落數(shù)。本研究采用皮爾遜相關(guān)分析法對(duì)28對(duì)定量結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(圖1)。結(jié)果顯示，兩種方法獲得的嗜肺軍團(tuán)菌的定量結(jié)果具有相關(guān)性(皮爾遜相關(guān)系數(shù)為0.718，P=0.000)。

注：(a)為28個(gè)非飲用水樣本中嗜肺軍團(tuán)菌定量結(jié)果散點(diǎn)圖； (b)為(a)圖方框部分放大圖圖1 過(guò)濾培養(yǎng)法與酶底物法檢測(cè)非飲用水中 嗜肺軍團(tuán)菌定量結(jié)果相關(guān)性分析Fig.1 Correlation Analysis of Quantitative Results of Legionella pneumophila in Nonpotable Water by Filter Culture and Enzyme Substrate Methods

2.2 討論

近年來(lái)，許多地區(qū)將熒光定量PCR、恒溫等溫?cái)U(kuò)增等定量方法[15-17]引入到對(duì)環(huán)境樣本中嗜肺軍團(tuán)菌的監(jiān)測(cè)，但培養(yǎng)方法仍然是金標(biāo)準(zhǔn)。非飲用水中嗜肺軍團(tuán)菌的含量較少，且存在其他微生物干擾，這是培養(yǎng)方法面臨的兩個(gè)挑戰(zhàn)。為了提高培養(yǎng)方法的靈敏性和特異性，GB/T 18204.5—2013[8]在培養(yǎng)前增加了膜過(guò)濾、酸處理及熱處理環(huán)節(jié)，但這些操作大大增加了操作環(huán)節(jié)和時(shí)間。酶底物法也是基于細(xì)菌培養(yǎng)進(jìn)行微生物檢測(cè)的方法，目前已廣泛應(yīng)用于檢測(cè)水樣中總大腸菌群和大腸埃希氏菌。本研究所采用的酶底物法通過(guò)選擇性培養(yǎng)基和預(yù)處理環(huán)節(jié)，保證了該方法檢測(cè)水樣中嗜肺軍團(tuán)菌的靈敏性和特異性。在對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，3個(gè)樣本酶底物法出現(xiàn)假陰性，過(guò)濾培養(yǎng)法計(jì)量結(jié)果為0.8 CFU/mL，有10個(gè)樣本過(guò)濾培養(yǎng)法出現(xiàn)假陰性，酶底物法計(jì)量結(jié)果為1.1～36.1 MPN/mL?？梢?jiàn)，在樣本中細(xì)菌含量較低時(shí)，兩種方法均可能出現(xiàn)漏檢，但酶底物法假陰性率低于過(guò)濾培養(yǎng)法，呈現(xiàn)較高的靈敏度。該結(jié)果與Barrette等[14]的研究結(jié)果相同。

不同血清型別的嗜肺軍團(tuán)菌引發(fā)的疾病不同。嗜肺軍團(tuán)菌Lp-1、Lp-4 和Lp-6 是引起人類(lèi)肺炎最常見(jiàn)的血清型[18-19]。其中，Lp-1 型是引起社區(qū)獲得性肺炎和醫(yī)院感染性肺炎的重要病原體[20]。因此，確定嗜肺軍團(tuán)菌的血清型別可為病因溯源和臨床診斷提供依據(jù)。雖然本次研究發(fā)現(xiàn)兩種方法分離出的嗜肺軍團(tuán)菌血清型別差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但有4個(gè)樣本在過(guò)濾培養(yǎng)法中培養(yǎng)出來(lái)的菌落為1～3個(gè)，血清型別是單一的。在酶底物法的陽(yáng)性孔驗(yàn)證過(guò)程發(fā)現(xiàn)多種血清型別?？梢?jiàn)，在樣本中細(xì)菌含量較少時(shí)，酶底物法更便于發(fā)現(xiàn)混合的血清型別。

3 結(jié)論

嗜肺軍團(tuán)菌是導(dǎo)致軍團(tuán)病的病原體，本地區(qū)集中空調(diào)冷卻水及公共場(chǎng)所淋浴水中存在嗜肺軍團(tuán)菌污染。因此，加強(qiáng)這種病原體的檢測(cè)與控制對(duì)公眾健康至關(guān)重要。本研究表明，酶底物法與過(guò)濾培養(yǎng)法對(duì)非飲用水中嗜肺軍團(tuán)菌的檢出結(jié)果具有一致性，但酶底物法呈現(xiàn)更高的靈敏度，結(jié)合其結(jié)果易于判讀、試驗(yàn)流程簡(jiǎn)化等特點(diǎn)，可考慮將酶底物法作為過(guò)濾培養(yǎng)法的替代方法。