陳東旭 （上海市綠化管理指導(dǎo)站，上海市黃浦區(qū) 200020；上海城市樹木生態(tài)應(yīng)用工程技術(shù)研究中心，上海市黃浦區(qū) 200020)

防治有害生物是園林植物養(yǎng)護(hù)過(guò)程中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，防治效果的好壞直接影響園林景觀和植物長(zhǎng)勢(shì)。有效地預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)園林植物病蟲害發(fā)生情況，可以較好地為養(yǎng)護(hù)人員提供預(yù)警信息，以便園林養(yǎng)護(hù)人員及時(shí)對(duì)病蟲害進(jìn)行人為干預(yù)，降低病蟲害對(duì)景觀的影響，從而達(dá)到病蟲害綠色防控的目的。在病蟲預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)工作中常使用自動(dòng)蟲情測(cè)報(bào)燈（自動(dòng)蟲情測(cè)報(bào)燈可以自動(dòng)啟動(dòng)關(guān)閉，轉(zhuǎn)換接蟲器，自動(dòng)排出雨水，且每天誘捕到的標(biāo)本被裝入一個(gè)幼蟲袋，測(cè)報(bào)員一周進(jìn)行一次收蟲工作即可，可大大減少工作量）進(jìn)行蟲害監(jiān)測(cè)，其原理主要是利用黑光燈誘集鱗翅目、鞘翅目等有趨光性的成蟲[1-2]。但在害蟲測(cè)報(bào)與綜合治理工作中，測(cè)報(bào)員主要通過(guò)捕捉到昆蟲的翅膀紋路和病蟲圖譜進(jìn)行初步比對(duì)，缺少了對(duì)雄性外生殖器及外部形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行分類這一專業(yè)環(huán)節(jié)，鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確度難以保證[3-4]；同時(shí)，自動(dòng)蟲情測(cè)報(bào)燈收集到的很多鱗翅目、鞘翅目昆蟲的形態(tài)學(xué)特征相似，標(biāo)本局部損壞易導(dǎo)致成蟲區(qū)分特征不明顯，這也為昆蟲種類鑒定帶來(lái)了很大難度。而利用DNA條碼技術(shù)作為昆蟲種類鑒定的輔助手段，可提高昆蟲種類鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確度[5-7]。

DNA條碼技術(shù)的原理是提取樣本基因組DNA，擴(kuò)增其線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基I(COI)基因序列片段并在數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)進(jìn)行比對(duì)分析，進(jìn)而對(duì)物種進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的鑒定和分類[8]。目前，基于COI的DNA條形碼輔助物種分類技術(shù)已大量應(yīng)用于害蟲的測(cè)報(bào)工作，對(duì)鱗翅目昆蟲分類鑒定的案例也已有很多報(bào)道[9-10]。但是，鑒于鱗翅目是昆蟲綱中第2個(gè)大目，已知種類超過(guò)20萬(wàn)種，夜蛾科又是鱗翅目中最大的一科，具有2萬(wàn)多個(gè)種類，且其中有很多種類是為害農(nóng)作物的種類，也是林業(yè)生產(chǎn)中非常重要的害蟲[7]。故筆者擬對(duì)DNA條碼技術(shù)在鱗翅目夜蛾科昆蟲種類鑒定中的應(yīng)用效果進(jìn)行檢驗(yàn)，以期建立快速準(zhǔn)確的夜蛾科昆蟲鑒定方法，從而為夜蛾科昆蟲生態(tài)多樣性評(píng)估及綜合治理提供重要途徑。

1 材料與方法

1.1 樣本采集及形態(tài)鑒定

本研究選取的樣本為夜蛾科昆蟲標(biāo)本。供試?yán)ハx于2016年5月至2017年9月采自上海辰山植物園（植物園內(nèi)生物多樣性豐富，能為動(dòng)植物群落種類、生態(tài)評(píng)估、水體等方面的研究提供樣本）的三座自動(dòng)蟲情測(cè)報(bào)燈，分別位于園內(nèi)北、南、東三個(gè)方向。設(shè)備均為佳多牌自動(dòng)蟲情測(cè)報(bào)燈，型號(hào)為JDB1-Ⅲ型，黑光燈管主波長(zhǎng)為365 nm，誘蟲半徑為120 m。樣本收集后分類整理，選取肢體較為完整的43個(gè)樣本進(jìn)行展翅，并保存于上海市綠化管理指導(dǎo)站實(shí)驗(yàn)室，待形態(tài)學(xué)鑒定。

1.2 基因組DNA提取、PCR擴(kuò)增和測(cè)序

基因組DNA提?。貉心?3個(gè)樣本的昆蟲腿部肌肉組織，提取基因組DNA，然后置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR擴(kuò)增：合成鱗翅目COI基因通用引物，PCR擴(kuò)增所用引物為L(zhǎng)CO1490(5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’)和HCO2198(5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’)。EX-Taq DNA聚合酶、dNTP等PCR試劑均購(gòu)置于TakaRa公司。

PCR反應(yīng)體系(50μL) ： 10倍PCR緩沖液5 μL，正向引物（20μmol/L）2.5μL，反向引物(20μmol/L)2.5μL，dNTP(10 mmol/L)1.5μL，Ex-Taq 1μL，模板DNA 2μL，加無(wú)菌水至50μL。

EX-TaqPCR擴(kuò)增條件：94 ℃變性300 s；94℃、40 s，54 ℃、40 s，72 ℃、60 s，反應(yīng)50個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

表1 樣本信息及COI基因序列的GenBank登陸序列號(hào)

擴(kuò)增產(chǎn)物純化后，送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.3 序列比對(duì)分析、系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建及樣本種類確定

采用Gene-Explorer軟件對(duì)43條基因序列進(jìn)行修飾，利用BLAST檢索其相似性，所得序列均是線粒體COI基因片段。使用DNA Barcoding鑒定方法，用CLUSTAL軟件進(jìn)行多序列比對(duì)[11-12]，導(dǎo)出FASTA格式文件。采用MEGA10軟件分析序列的保守位點(diǎn)（conserved sites，C）數(shù)、變異位點(diǎn)（variable sites，V）數(shù)、簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)（parsimin-formative sites，Pi）數(shù)、種間遺傳距離、種內(nèi)遺傳距離、堿基偏倚性等信息。采用鄰接法，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(Neighbor-joining tree，NJ樹)[13-14]，并將測(cè)序基因片段在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)進(jìn)行檢索比對(duì)及鑒定種類。查閱文獻(xiàn)，根據(jù)樣本雄性外生殖器及外部特征，確定DNA條碼鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確度。

2 結(jié)果與分析

2.1 COI基因序列特征分析

以43個(gè)樣本的基因組DNA為模板，使用鱗翅目COI基因片段通用引物進(jìn)行擴(kuò)增，克隆得到了43條687 bp左右的基因片段，經(jīng)過(guò)BLAST比對(duì)分析，序列均為線粒體COI基因序列。相關(guān)信息見表1。

根據(jù)雄性外生殖器及外部形態(tài)特征，43個(gè)夜蛾科昆蟲樣本的鑒定結(jié)果為10個(gè)種。其中，2個(gè)種類無(wú)中文名對(duì)應(yīng)，且未查到這2個(gè)種的形態(tài)描述，未做形態(tài)鑒定。利用MEGA10軟件進(jìn)行堿基含量分析，使用CLUSTAL軟件進(jìn)行序列比對(duì)，43個(gè)樣本COI基因序列中均未發(fā)生缺失和插入情況，保守位點(diǎn)數(shù)、變異位點(diǎn)數(shù)、簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)數(shù)、單突變位點(diǎn)數(shù)分別為520個(gè)、163個(gè)、146個(gè)、16個(gè)。各堿基平均含量分別為：A（30.0%）、T（40.6%）、C（14.7%）、G（14.7%），其中G+C的含量（29.4%）明顯低于A+T的含量（70.6%），這與昆蟲線粒體堿基含量特征一致[15]。

由表2可知，10種夜蛾科昆蟲COI基因的堿基顛換率（Transversional Pairs）和轉(zhuǎn)換率（Transitionsal Pairs）分別為33%和19%，偏倚率R值（si/sv）為0.6。堿基的轉(zhuǎn)換以TC（84.2%）為主，少數(shù)為AG（15.8%）間的轉(zhuǎn)換；顛換多發(fā)生于TA堿基間（90.6%），CA堿基間顛換占總數(shù)的9.4%。鑒于物種間的親緣關(guān)系越近堿基轉(zhuǎn)換率越高，物種間親緣關(guān)系越遠(yuǎn)則堿基替換率越高[8]，故不同夜蛾科昆蟲間親緣關(guān)系可以通過(guò)COI基因片段多序列分析結(jié)果推斷出。

表2 10種夜蛾科昆蟲COI基因片段堿基替換

2.2 種內(nèi)及種間遺傳距離

基于p-distance模型，計(jì)算出43個(gè)樣本種內(nèi)及種間的遺傳距離，并利用bootstrap（1 000次）進(jìn)行檢驗(yàn)[8]。由表3可知，種間遺傳距離在0.069 8～0.116 3之間，平均值為0.092 9。其中，粉紋夜蛾和白條夜蛾的遺傳距離是0.069 8，大耳紋夜蛾和中赫夜蛾的遺傳距離是0.070 8；乏夜蛾和粉紋夜蛾之間遺傳距離值最大（0.116 3）。43個(gè)樣本種內(nèi)遺傳距離在0～0.001 5之間，平均值為0.000 5。種間遺傳距離遠(yuǎn)大于種內(nèi)遺傳距離，且種內(nèi)遺傳距離最大值和種間遺傳距離最小值并未重疊，符合DNA條形碼檢驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)（種間差異是種內(nèi)差異10倍）[16]。

表3 夜蛾科10種不同害蟲的種間和種內(nèi)遺傳距離

2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建分析

以43個(gè)樣本的COI基因序列作為靶標(biāo)，采用MEGA10軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，使用ClustalW功能進(jìn)行序列比對(duì)，依據(jù)Kinura-2-Paramter 模型，采用鄰接法(Neighbour-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，并進(jìn)行重復(fù)1 000次的自舉檢驗(yàn)。由圖1可知，不同種類樣本形成了獨(dú)立的進(jìn)化分支。同時(shí)，聚類結(jié)果也反映了物種間的親緣關(guān)系，如淡劍紋灰翅夜蛾、梨劍紋夜蛾是近緣種，這兩個(gè)物種進(jìn)化分支聚集在一起。因此，夜蛾科昆蟲COI基因序列具有足夠的遺傳變異性和分化度，既可區(qū)分種間種類，同時(shí)種內(nèi)相對(duì)保守。

3 結(jié)論與討論

園林植物是城市園林綠化專類園和綠地的重要組成部分，蟲害的發(fā)生會(huì)對(duì)園林植物的健康生長(zhǎng)造成巨大威脅，所以蟲害綠色防控是園林植保工作的重要環(huán)節(jié)，且只有在蟲害發(fā)生后及時(shí)判別害蟲的種類和發(fā)生規(guī)律，才能采取有效措施控制其為害；同時(shí)，對(duì)一個(gè)城市來(lái)說(shuō)，一個(gè)區(qū)域的蟲害發(fā)生情況，對(duì)該城市的整體綠化養(yǎng)管也具有一定的警示作用。因此，需要對(duì)害蟲的消長(zhǎng)動(dòng)向進(jìn)行預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)，以便及時(shí)發(fā)出預(yù)警，從而更有效地對(duì)蟲害進(jìn)行綠色防控。但是，園林害蟲種類繁多、形態(tài)各異，幾乎所有的園林植物會(huì)受害，且在蟲害大發(fā)生前較難被發(fā)現(xiàn)。而自動(dòng)蟲情測(cè)報(bào)燈的應(yīng)用，可以準(zhǔn)確地對(duì)害蟲未來(lái)發(fā)生危害的時(shí)間和嚴(yán)重程度等情況進(jìn)行預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)，從而減少監(jiān)測(cè)員的勞動(dòng)強(qiáng)度。

自動(dòng)蟲情測(cè)報(bào)燈雖然能監(jiān)測(cè)目標(biāo)植物群落內(nèi)活動(dòng)昆蟲種類的消長(zhǎng)規(guī)律，且誘集到的昆蟲種類多樣，但誘集的鱗翅目昆蟲成蟲肢體和翅膀易破碎或粘成一團(tuán)，較難準(zhǔn)確區(qū)分和鑒定昆生種類[17]，再加上植保技術(shù)人員和監(jiān)測(cè)員在昆蟲分類學(xué)專業(yè)性知識(shí)上相對(duì)欠缺，導(dǎo)致很難使用傳統(tǒng)分類特征來(lái)區(qū)分昆生種類。同時(shí)，鱗翅目昆蟲屬于完全變態(tài)昆蟲，其在不同發(fā)育階段的形態(tài)特征差異較大，而鑒定往往要根據(jù)成蟲特征來(lái)進(jìn)行判斷，但鱗翅目昆蟲種類與數(shù)量龐大，且很多近似種成蟲差異細(xì)微，這也給非專業(yè)鑒定人員帶來(lái)了極大困難。因此，需在傳統(tǒng)根據(jù)成蟲進(jìn)行鑒別分類的基礎(chǔ)上，利用DNA條碼技術(shù)對(duì)近似種、隱形種和新種進(jìn)行鑒定，以縮短排查時(shí)間，提高工作效率，提升鑒定結(jié)果的精確性，這對(duì)于蟲害綜合治理意義重大[18]。

本研究結(jié)果表明，應(yīng)用DNA條碼技術(shù)輔助傳統(tǒng)分類方法進(jìn)行夜蛾科種類鑒定，具有較高的準(zhǔn)確度；對(duì)43個(gè)樣本基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，種間遺傳距離遠(yuǎn)大于種內(nèi)遺傳距離，且種內(nèi)遺傳距離最大值和種間遺傳距離最小值并未重疊，符合DNA條形碼檢驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)；采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹的結(jié)果顯示，不同種昆蟲也會(huì)各自聚集到一個(gè)單系群。

DNA條碼技術(shù)可輔助應(yīng)用于自動(dòng)蟲情測(cè)報(bào)燈誘捕到的夜蛾科昆蟲的分類鑒定與測(cè)報(bào)，其雖暫時(shí)不能取代傳統(tǒng)分類工作，但將其作為輔助手段用于形態(tài)鑒定，可有效提高種類鑒定的效率和準(zhǔn)確度。隨著GenBANK等數(shù)據(jù)庫(kù)的發(fā)展，DNA條碼技術(shù)在夜蛾科昆蟲種類鑒定工作中將得到更多的應(yīng)用。