楊劍，彭心宇，張宏偉，楊靖，張永國，吳向未*

(1 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院肝膽外科，新疆 石河子 832002；2 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬 同濟(jì)醫(yī)院肝臟外科中心，湖北 武漢 430030)

包蟲病是一種危害嚴(yán)重的人畜共患寄生蟲性疾病，它與結(jié)核病、艾滋病、瘧疾等疾病一起被稱為“世界上被忽視的疾病”[1]。在我國其主要遍布于新疆、青海、西藏等西部牧區(qū)和半農(nóng)半牧地區(qū)，其中囊型肝包蟲病患病率較高，占90%以上[2]。在囊型肝包蟲病自然病程中，包蟲囊腫經(jīng)歷著由小—大—小的過程，活性逐漸降低[3]。我們臨床研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)肝包蟲外囊壁會(huì)逐步發(fā)生鈣化，且常伴有包蟲內(nèi)容物退化，生物學(xué)上稱之為“非活躍期”，臨床稱之為“靜止性病變”[4]；當(dāng)肝包蟲外囊壁鈣化范圍增大，蟲體則大量死亡，這是因?yàn)橥饽冶诖蠓秶}化使得蟲體很難從周圍組織中攝取營(yíng)養(yǎng)[5]?；诖死碚?，我們認(rèn)為引起和促進(jìn)肝包蟲外囊壁鈣化，可能成為治療囊型肝包蟲病新的方向，但目前國內(nèi)外對(duì)于肝包蟲囊壁鈣化發(fā)生、發(fā)展機(jī)制認(rèn)識(shí)尚不明確。有研究表明膽瘺的發(fā)生是一重要因素，其可在機(jī)體免疫機(jī)制作用下導(dǎo)致肝包蟲囊壁鈣化[6]。多年來國內(nèi)外學(xué)者陸續(xù)從人體病理性鈣化組織中分離獲得鈣化性納米微粒，最新觀點(diǎn)認(rèn)為鈣化性納米微粒是一類能夠自我復(fù)制的納米級(jí)蛋白復(fù)合體，具有自我礦化的特性[7]。鑒此，我們提出假設(shè)：囊型肝包蟲患者的膽汁中存在鈣化性納米微粒，由于肝包蟲膽瘺的發(fā)生其納米微?？蓪?dǎo)致肝包蟲外囊壁逐步發(fā)生鈣化。本實(shí)驗(yàn)擬探討囊型肝包蟲囊壁鈣化、包蟲膽漏與鈣化性納米微粒的關(guān)系，分別從囊型肝包蟲鈣化及非鈣化的外囊壁中試分離及培養(yǎng)鈣化性納米微粒，電鏡觀察該納米微粒特征，初步尋找鈣化性納米微粒誘發(fā)肝包蟲外囊壁鈣化的證據(jù)及相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

收集 37例囊型肝包蟲病患者于2018年1月至2018年12月在石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院門診確診并住院行手術(shù)治療，年齡43.5±7.6歲，其中女性為15例，男性為22例；術(shù)前CT明確包蟲囊腫數(shù)目、大小、位置、WHO影像學(xué)分型及外囊壁鈣化情況，術(shù)后明確手術(shù)方式、術(shù)中是否發(fā)膽瘺。本研究得到石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)術(shù)倫理委員會(huì)同意。

城市更新是一個(gè)由城市內(nèi)部多種因素復(fù)合驅(qū)動(dòng)的過程。城市更新的內(nèi)容已從單純“硬性”的物質(zhì)和形體更新擴(kuò)散到社會(huì)文化網(wǎng)絡(luò)、鄰里關(guān)系乃至人們的心理認(rèn)同等“軟性”更新。自改革開放以來，隨著城市化速度的加快，我國的城市更新改造運(yùn)動(dòng)以前所未有的規(guī)模與速度展開。在城市更新中，既定的環(huán)境是城市政府所供給的制度和法律，需要重點(diǎn)考慮的是如何在多元化主體和差異化利益訴求下保證其順利進(jìn)行。

(1)術(shù)前CT判斷肝包蟲外囊壁鈣化的程度由少到多為標(biāo)準(zhǔn)。

囊壁鈣化進(jìn)行分類：點(diǎn)片狀，弧狀，環(huán)狀。

(2)膽瘺診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.1 透射電鏡掃描-負(fù)染法

b：行開放式外膜內(nèi)外囊切除術(shù)或次全切除術(shù)時(shí)囊壁內(nèi)側(cè)可見有膽汁滲入，囊內(nèi)容物感染壞死，呈膽汁污染樣顏色。

（2）進(jìn)行電氣設(shè)備配管下料時(shí)，必須要由專業(yè)的監(jiān)理工程師進(jìn)行施工監(jiān)督，且施工的整個(gè)過程，都需要按照施工規(guī)范與設(shè)計(jì)規(guī)范進(jìn)行相應(yīng)施工，施工時(shí)若發(fā)現(xiàn)下料的材料不符合質(zhì)量要求，必須進(jìn)行更換，以確保電氣設(shè)備的質(zhì)量與安全性。

1.2 標(biāo)本的處理

包蟲外囊壁組織獲取與處理。根據(jù)術(shù)中發(fā)現(xiàn)，將肝包蟲囊腫分為膽漏組和非膽漏組，均用無菌剪取手術(shù)切除的外囊組織各2份(多點(diǎn)取材)。每份一部分剪成3 cm×3 cm，分別稱取術(shù)中所取包蟲外囊組織各500 mg，用無菌PBS洗凈，直到無肉眼可分離見血水為宜，37 ℃烘干，充分研磨組織至勻漿狀，0.1 mol·L-1鹽酸加入搖勻，37 ℃、30 min孵育脫礦，每次間隔10 min搖勻，調(diào)pH至7.0～7.4(1 mol·L-1HCl-Tris加入中和)，在離心管中自然沉淀后，取上清20 mL轉(zhuǎn)入離心機(jī)4 ℃、8,000 g，10 min離心，取上清液用0.22 μm 細(xì)菌濾器過濾約10 mL，56 ℃、30 min孵育去除支原體污染，4 ℃、12,000 g、離心40 min，再取上清液用0.22 μm細(xì)菌濾器過濾至15 mL試管中，每管2 mL，加入10%γ-PBS RPMI1640 4 mL作為培養(yǎng)基，放置于37 ℃、5%CO2條件下的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，上述所有所取標(biāo)本4周。

1.3 電鏡標(biāo)本的制作

由于普通光學(xué)顯微鏡難以鑒別納米級(jí)的微粒，故應(yīng)用電子顯微鏡觀察已成為鑒定鈣化性納米微粒形態(tài)學(xué)的金標(biāo)準(zhǔn)方法，本實(shí)驗(yàn)方法主要運(yùn)用電鏡針對(duì)囊型肝包蟲囊壁中分離、培養(yǎng)出來的鈣化性納米微粒進(jìn)行觀察和比較。

a：術(shù)中證實(shí)肝包蟲破入膽道，膽道內(nèi)可見囊內(nèi)容物。

將肉眼觀察有白色顆粒沉淀于管底的培養(yǎng)液，以16 000 g離心45 min，去上清，以PBS將沉淀沖洗，在4 ℃下應(yīng)用2.5%戊二醛固定24 h，雙蒸水5 min，3次洗滌，4 ℃、

12 000 g，離心40 min，加入1mLPBS制備混懸溶液，進(jìn)行負(fù)染色，將銅網(wǎng)放置于混懸溶液上10 min，完全吸盡液體，在15 mol·L-1磷鎢酸液滴上放置100 s，再次吸盡液體并晾干，在工作電壓80 kV，H-7650透射電鏡下予以觀察。

1.3.2 掃描電鏡

貨幣資金的國內(nèi)外流動(dòng)必然是伴隨對(duì)外貿(mào)易投資活動(dòng)的開展而進(jìn)行的，本國經(jīng)濟(jì)發(fā)展停滯，則商貿(mào)活動(dòng)減緩，貨幣流動(dòng)必然隨之而止，市場(chǎng)需求是一國貨幣走向國際市場(chǎng)的最根本動(dòng)力，靠人為拉動(dòng)或套利投機(jī)的貨幣國際化是不可持續(xù)的。絲綢之路上的古代貨幣的境外流通，完全就是市場(chǎng)需求帶動(dòng)的。因此，人民幣國際化要在市場(chǎng)需求的基礎(chǔ)上穩(wěn)妥推進(jìn)，無論是人民幣的跨境貿(mào)易結(jié)算還是人民幣的對(duì)外直接投資，都要注重海外市場(chǎng)的需求，現(xiàn)階段可以重點(diǎn)擴(kuò)大人民幣的計(jì)價(jià)使用，真正發(fā)揮貨幣互換在貿(mào)易投資中的功能。

用2.5%的戊二醛將肉眼觀察有白色顆粒沉淀于管底的培養(yǎng)液固定24 h，以PBS反復(fù)清洗3次，每次持續(xù)10 min，再用50%、70%、80%、90%、100%的乙醇進(jìn)行梯度脫水,各脫水10 min,到臨界點(diǎn)進(jìn)行干燥；以導(dǎo)電膠粘附樣品放置樣品臺(tái)上，真空離子鉑金膜噴鍍，在工作電壓25 kV和3 kV掃描電鏡下予以觀察。

中國是航運(yùn)大國，世界10大港口中，中國占據(jù)8個(gè)席位。2017年，中國港口完成貨物吞吐量140億噸，比上年增長(zhǎng)6%；完成集裝箱吞吐量2.38億標(biāo)箱（TEU），比上年增長(zhǎng)8.3%。2017年，外籍船舶靠泊中國港口數(shù)量超過28萬余艘次，是1994年的5倍以上，而國際航行船舶燃油平均含硫量高達(dá)2.6%～3.5%，是車用柴油的3500倍，船舶燃油質(zhì)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于陸上機(jī)動(dòng)車燃油品質(zhì)。上海市環(huán)境監(jiān)測(cè)中心的數(shù)據(jù)顯示，2012年，船舶排放二氧化硫、氮氧化物分別占當(dāng)?shù)嘏欧趴偭康?2.4%和11.6%，2015年分別上升到25.7%和29.4%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS21.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)數(shù)資料的組間比較采用卡方檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本文均采用雙側(cè)檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 囊型肝包蟲外囊有無鈣化與其膽瘺發(fā)生率的比較

1.2.3 食物成分調(diào)整 適當(dāng)增加精神分裂癥并2型糖尿病患者高纖維素等食物的攝入量，此類食物能夠?qū)ξ概趴盏乃俣瓤刂?，從而將患者的餐后血糖水平降低。若患者存在胃癱的情況，則應(yīng)減少其高纖維素食物的攝入量，同時(shí)增加維生素C的攝入量[8]。

經(jīng)過歷代的治理，特別是新中國成立60多年來的大力治理，現(xiàn)在全國大江大河的防洪體系已基本形成，可以防御新中國成立以來發(fā)生的最大洪水。但是，全國絕大多數(shù)中小河流治理滯后，大雨大災(zāi)、小雨小災(zāi)頻繁發(fā)生。目前全國大約有2/3的中小河流缺乏治理，防洪標(biāo)準(zhǔn)低于20年一遇~10年一遇洪水，達(dá)不到國家規(guī)定的防洪標(biāo)準(zhǔn)。

c：行“肝包蟲外膜內(nèi)外囊完整切除術(shù)”時(shí)證實(shí)囊壁外側(cè)與囊周肝內(nèi)膽管相通，或術(shù)后切開標(biāo)本時(shí)發(fā)現(xiàn)囊壁或囊內(nèi)容物呈膽汁污染樣顏色等存在膽瘺的間接表現(xiàn)。

表1 囊型肝包蟲外囊有無鈣化的膽漏發(fā)生率比較

2.2 實(shí)驗(yàn)圖片

2.2.2 組織獲取與處理

術(shù)前CT顯示囊型肝包蟲囊壁鈣化與術(shù)后證實(shí)囊型肝包蟲膽漏發(fā)生的關(guān)系(圖1～圖4)。術(shù)前CT檢查未見囊壁鈣化的肝包蟲，經(jīng)手術(shù)切除后證實(shí)包蟲囊內(nèi)未見膽漏發(fā)生，而術(shù)前CT檢查已明確囊內(nèi)、囊壁鈣化的肝包蟲，術(shù)后證實(shí)囊內(nèi)均存在膽漏的發(fā)生，囊內(nèi)物壞死。

圖1 囊型肝包蟲CT(囊壁無鈣化)

圖2 術(shù)后證實(shí)肝包蟲無膽漏發(fā)生

圖3 囊型肝包蟲CT(囊壁鈣化)

圖4 術(shù)后證實(shí)肝包蟲有膽漏發(fā)生

2.2.1 術(shù)前CT圖片

囊型肝包蟲外囊壁組織獲取與處理(圖5、6)。選取囊型肝包蟲鈣化性外囊壁，分別剪成碎片樣再將碎片鈣化組織研磨成泥漿狀，逐一進(jìn)行脫鈣、離心、過濾取上清液，加入10%γ-PBC RPMI1640 4 mL作為培養(yǎng)基，放置于37 ℃、5% CO2條件下的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

圖5 肝包蟲外囊壁組織獲取

圖6 肝包蟲外囊壁組織處理

2.2.3 培養(yǎng)結(jié)果

CFG樁復(fù)合地基變形計(jì)算，首先按照J(rèn)GJ 79—2012《建筑地基處理技術(shù)規(guī)范》第7.1.7條和7.1.8條確定復(fù)合土層的壓縮模量和變形計(jì)算深度范圍內(nèi)壓縮模量的當(dāng)量值，再按GB 50007—2011《建筑地基基礎(chǔ)設(shè)計(jì)規(guī)范》式（5.3.5）的有關(guān)規(guī)定計(jì)算復(fù)合地基變形。

經(jīng)過四周培養(yǎng)，鈣化的外囊壁組管底可見白色顆粒樣沉淀(圖7)，而無鈣化囊壁組未見白色沉淀物(圖8)。

圖7 鈣化外囊壁組管底見白色沉淀

圖8 無鈣化外囊壁組管底未見沉淀

2.2.4 透射電鏡掃描結(jié)果

在收集的37例囊型肝包蟲標(biāo)本中，其中膽漏出現(xiàn)外囊壁鈣化的有12例，有膽漏無鈣化5例，無膽漏無鈣化的20例，χ2=20.894，P<0.001，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

放置于透射電鏡下觀測(cè)，可見納米顆粒存在，這種顆粒的形態(tài)大多數(shù)呈現(xiàn)腎形或者圓球形，直徑約100～600 nm。

呈現(xiàn)出二分裂的形態(tài)，同時(shí)可見毛刺現(xiàn)象(圖9、10)，隨機(jī)選取透射電鏡(負(fù)染法)為陽性的樣本，進(jìn)行超薄切片透射電鏡觀測(cè)，發(fā)現(xiàn)在顆粒外周有一層黑色致密物包繞(圖11、12)，掃描電鏡下觀察這些顆粒大小不一，顆粒表面有類似結(jié)晶物(圖13、14)。

圖9 透射電鏡下可見黑色顆粒

圖10 透射電鏡下呈二分裂的形態(tài)

圖11 超薄切片電鏡下顆粒外周黑色致密物包繞

圖12 黑色顆粒外周可見毛刺現(xiàn)象

圖13 掃描電鏡顆粒大小不一，呈球形居多

圖14 顆粒表面有類似結(jié)晶物

2.3 囊型肝包蟲有無鈣化性納米微粒與其膽瘺發(fā)生率的比較

在收集的37例囊型肝包蟲標(biāo)本中，其中有膽漏培養(yǎng)出鈣化性納米微粒的有16例，有膽漏培養(yǎng)出無鈣化性納米微粒1例，無膽漏無鈣化納米微粒的20例，χ2=33.165，P<0.001，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

表2 囊型肝包蟲有無鈣化性納米微粒的膽漏發(fā)生率比較

2.4 囊型肝包蟲外囊有無鈣化性納米微粒與其膽瘺發(fā)生率的比較

在收集的37例囊型肝包蟲標(biāo)本中，有膽漏無鈣化外囊壁培養(yǎng)出鈣化性微粒4例，有膽漏鈣化外囊壁培養(yǎng)出鈣化性微粒12例，有膽瘺無鈣化組未發(fā)現(xiàn)鈣化性納米微粒1例，無膽漏無鈣化組未發(fā)現(xiàn)納米微粒20例，χ2=33.740，P<0.001，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3)。

表3 囊型肝包蟲有無鈣化性納米微粒的 膽漏與鈣化發(fā)生率比較

3 討論

鈣化性納米微粒(calcifying nanoparticles，CNPs)[8]，是由芬蘭科學(xué)家Kajander E.O等人在研究牛血清培養(yǎng)失敗時(shí)意外發(fā)現(xiàn)的，在被發(fā)現(xiàn)的初期又稱之為納米細(xì)菌(nanobacteria，NB)，CNPs在自然界及人體的許多組織中普遍存在，其直徑大約在100～600 nm之間，外形多呈圓球形或圓球桿狀，在該顆粒外層有磷灰石礦化致密外殼，革蘭氏染色呈陰性，代謝慢，耐酸、耐熱。當(dāng)前最新觀點(diǎn)認(rèn)為CNPs是一類能夠自我復(fù)制的納米級(jí)蛋白復(fù)合體，具有自我礦化的特性，CNPs在生理性鈣、磷濃度中能形成羥磷灰石碳酸鹽結(jié)晶，產(chǎn)生堅(jiān)硬的礦化外殼覆蓋于其周圍，構(gòu)成晶體核心，其分泌鈣化脂多糖生物膜，具有較大的毒性，可引起細(xì)胞空泡形成、組織的炎癥和腫脹，并出現(xiàn)一系列相關(guān)炎癥因子的反應(yīng)，因此與人類病理和感染性鈣化疾病相關(guān)密切[7]。Larry W Hunter等[9]研究表明外源性CNPs在體外被主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞吸收，并在礦化部位增強(qiáng)平滑肌源性凋亡小體的大量積累，加速血管鈣化；吳基華等[10]實(shí)驗(yàn)研究表明CNPs可以作為結(jié)晶的活性核心，黏附、侵入并破壞腎集合管的上皮細(xì)胞和腎乳頭細(xì)胞，形成磷灰石晶核，從而誘發(fā)腎結(jié)石形成；據(jù)李亞楠等[11]研究發(fā)現(xiàn)在61.3%患者膽汁中可分離及培養(yǎng)出來CNPs，并證實(shí)CNPs與膽結(jié)石的形成存在關(guān)系；多年來，國內(nèi)外研究表明鈣化性納米微粒與鈣化性主動(dòng)脈狹窄、動(dòng)脈粥樣硬化、腎結(jié)石、慢性Ⅲ前列腺炎、多囊肝、膽囊結(jié)石、胎盤的鈣化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、慢性牙周炎、周圍神經(jīng)性病變等人體內(nèi)組織的病理性鈣化及慢性炎性疾病的發(fā)生與發(fā)展存在緊密聯(lián)系[12-14]。而肝包蟲外囊壁中鈣鹽的沉積被認(rèn)為是機(jī)體局部反應(yīng)而引起的營(yíng)養(yǎng)不良性鈣化[15]，營(yíng)養(yǎng)不良性鈣化是與感染，炎癥，異物及細(xì)胞損傷密切相關(guān)，那么在肝包蟲的自然病程中包蟲囊壁的逐步鈣化是否也與鈣化性納米微粒有一定關(guān)聯(lián)？當(dāng)前國內(nèi)外均未見報(bào)道和研究，在本次實(shí)驗(yàn)中我們明確證實(shí)囊型肝包蟲囊壁鈣化與肝包蟲膽漏發(fā)生存在一定關(guān)系(發(fā)現(xiàn)包蟲囊壁出現(xiàn)鈣化均有膽漏發(fā)生)，進(jìn)一步從發(fā)生膽漏的囊型肝包蟲鈣化外囊壁中分離及培養(yǎng)出鈣化性納米微粒，其培養(yǎng)特性和電鏡觀察形態(tài)特征均與國內(nèi)外文獻(xiàn)相關(guān)信息描述高度一致，明確證實(shí)在肝包蟲鈣化外囊壁中同樣存在鈣化性納米微粒，初步說明在囊型肝包蟲自然病程中包蟲囊壁鈣化與鈣化性納米微粒可能存在一定相關(guān)性，但目前國內(nèi)外未見有此相關(guān)報(bào)道；至于鈣化性納米微粒與囊型肝包蟲囊壁鈣化之間的具體關(guān)系和機(jī)制需進(jìn)行深入研究和進(jìn)一步探討。

4 結(jié)論

(1)本實(shí)驗(yàn)首次在囊型肝包蟲鈣化外囊壁中分離和培養(yǎng)出與鈣化性納米微粒類似的納米顆粒，明確證實(shí)囊型肝包蟲鈣化囊壁中存在鈣化性納米微粒。

如表1所示，模型組和丁酸鈉組DAO和NO顯著高于對(duì)照組（P＜0.05、0.01），丁酸鈉組DAO和NO顯著低于模型組（P＜0.05）。

(2)鈣化性納米微?？赡苁菍?dǎo)致囊型肝包蟲外囊壁鈣化的其中因素之一，可為我們研究囊性肝包蟲病的自然病程和治療囊型肝包蟲病提供重要的補(bǔ)充和可能的思路。