艾澤馨， 李 家， 吳洋歐， 于 淼， 李生嬌

（1. 上海牙組織修復(fù)與再生工程技術(shù)研究中心，同濟(jì)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院·同濟(jì)大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科教研室，2. 口腔修復(fù)教研室，上海 200072）

骨質(zhì)疏松是一種全身性疾病，頜骨的骨質(zhì)疏松會(huì)影響種植體與骨組織的骨結(jié)合[1-4]。 該病的預(yù)防仍是目前的難點(diǎn)和熱點(diǎn)。 骨質(zhì)疏松時(shí)，成骨細(xì)胞的成骨能力下降。 因此，如何促進(jìn)其成骨能力一直是研究的熱點(diǎn)。目前，骨形成的機(jī)制尚不明確?，F(xiàn)有研究表明，影響骨形成的因素有很多，包括激素、細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)錄因子、miRNA 等[5-8]。 與骨形成關(guān)系最密切的是成骨細(xì)胞，其增殖分化受多種因素影響[9-11]。 目前的研究證明氧化應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致成骨細(xì)胞凋亡增加，骨形成減少[12]。 另有報(bào)道證明，紅茶中的茶黃素-3, 3′-雙沒(méi)食子酸酯（TF3）具有較強(qiáng)的抗氧化能力[13]。TF3 能否改善骨質(zhì)疏松及其作用機(jī)制未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。 本研究建立小鼠骨質(zhì)疏松模型和MC3T3-E1 細(xì)胞氧化應(yīng)激模型， 探討TF3 對(duì)骨質(zhì)疏松小鼠骨丟失的作用，并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行初步探討。

1 材料和方法

1.1 材料

MC3T3-E1 細(xì)胞 （武漢普諾賽生命科技有限公司，中國(guó)）；茶黃素-3, 3′-雙沒(méi)食子酸酯（上海伏龍生物科技有限公司，中國(guó)）；α-MEM 培養(yǎng)基（Hyclone 公司，美國(guó)）；胎牛血清（BI 公司，以色列）；胰蛋白酶（凱基公司，中國(guó)）；CCK-8 試劑盒（碧云天公司，中國(guó)）；DCFH-DA 熒光染料（Sigma 公司，美國(guó)）；TRIzol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara 公司，日本）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）試劑盒（翊圣公司，中國(guó)）。

1.2 藥物配制

電子天平稱取10 mg TF3 溶于1 150 μL 無(wú)水乙醇中， 配制得到濃度為1×104μmol/L 的儲(chǔ)存液，避光置于-20 ℃下保存。用α-MEM 培養(yǎng)基將儲(chǔ)存液分別稀釋至1 μmol/L 和10 μmol/L 作為工作液，工作液避光保存于4 ℃下。

1.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組及Micro-CT 掃描

雌性C57BL/6J 小鼠（8 周齡）24 只，SPF 級(jí)，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供[生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2017-0005]。 所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在同濟(jì)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行，且獲得同濟(jì)大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。 將小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham 組）、卵巢切除組（OVX 組）、低濃度TF3 治療組和高濃度TF3 治療組，每組各6 只。Sham 組僅切除卵巢周圍脂肪組織, 其余組切除小鼠雙側(cè)卵巢。 術(shù)后1 周，治療組腹腔注射TF3 （1 mg/kg 和10 mg/kg），Sham組和OVX 組腹腔注射0.9%氯化鈉溶液,每周給藥3 次。 連續(xù)給藥3 個(gè)月后，處死小鼠, 取雙側(cè)股骨并剔凈軟組織, 4%多聚甲醛固定。 將各組股骨進(jìn)行Micro-CT 分析。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

MC3T3-E1 細(xì)胞于含10% 胎牛血清及1%青霉素、鏈霉素混合液的α-MEM 完全培養(yǎng)基中，培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中。 細(xì)胞融合至80%～90%時(shí)以1∶3 的比例傳代。

1.5 CCK-8 實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞以2×103/孔的密度接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，24 h 后加入300 μmol/L H2O2和不同濃度的TF3（0、1、10、20、40 μmol/L）。 4 h 后去除培養(yǎng)液，每孔加入新鮮配制的含10 μL CCK-8 和90 μL α-MEM 培養(yǎng)基的液體，避光孵育2 h 后，于450 nm 波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度值。

1.6 建立細(xì)胞氧化應(yīng)激模型

用濃度為300 μmol/L 的H2O2處理MC3T3-E1細(xì)胞4 h。 并將實(shí)驗(yàn)分為4 組：陰性對(duì)照組（NC 組）：不做任何處理， 用α-MEM 完全培養(yǎng)液培養(yǎng)4 h；陽(yáng)性對(duì)照組（C 組）：加入300 μmol/L H2O2處理4 h；低濃度藥物組（L 組）：加入300 μmol/L H2O2和1 μmol/L TF3 處理4 h；高濃度藥物組（H 組）：加入300 μmol/L H2O2和10 μmol/L TF3 處理4 h。

1.7 細(xì)胞內(nèi)ROS 檢測(cè)

細(xì)胞以3×104/孔的密度鋪于24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，24 h 后， 按上述分組分別加入不同的處理因素作用4 h，然后去除培養(yǎng)液，磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗3 次。 將新鮮配制的濃度為10 μmol/L 的DCFH-DA 溶液加入每孔中， 避光孵育30 min 后，去除染液，用PBS 洗3 次，在熒光顯微鏡下拍照。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)

細(xì)胞以1.5×105/孔的密度接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，按上述分組分別處理細(xì)胞4 h。用TRIzol 法提取細(xì)胞總RNA， 將1 μg 總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)。 引物序列見(jiàn)表1。小鼠GAPDH 基因用作內(nèi)參。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 20.0 進(jìn)行分析， 使用的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法是單因素方差分析。P＜0.05 被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TF3 對(duì)股骨骨小梁丟失的作用

為了檢測(cè)TF3 對(duì)骨質(zhì)疏松的作用，我們建立了OVX 骨質(zhì)疏松小鼠模型。 Micro-CT 分析結(jié)果表明，TF3 可以減少OVX 引起的骨小梁丟失，并隨劑量增加，效果越明顯（圖1）。

表1 引物序列Table 1 Primers sequence

圖1 Micro-CT示TF3 對(duì)小鼠股骨骨小梁丟失的作用Figure 1 Micro-CT images showing the effect of TF3 on the loss of femoral trabecular bone

2.2 TF3 對(duì)MC3T3-E1 細(xì)胞活性的作用

結(jié)合文獻(xiàn)[14]，用300 μmol/L H2O2處理MC3T3-E1細(xì)胞4 h 可建立氧化應(yīng)激模型。 我們?cè)诖嘶A(chǔ)上檢測(cè)了不同濃度的TF3（0 、1、10、20、40 μmol/L）對(duì)細(xì)胞活性的影響。 結(jié)果表明，20 μmol/L 以下的TF3 不會(huì)影響細(xì)胞的活性（圖2）。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們分別選擇了1、10 μmol/L 作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的藥物濃度。

2.3 TF3 對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS 的作用

為了檢測(cè)TF3 對(duì)H2O2誘導(dǎo)的MC3T3-E1 細(xì)胞內(nèi)ROS 的產(chǎn)生情況，我們使用DCFH-DA 熒光染料檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS 的水平。 結(jié)果表明，與NC 組相比，H2O2顯著增加了細(xì)胞內(nèi)ROS 的產(chǎn)生， 而TF3 處理組（L 組和H 組）細(xì)胞內(nèi)ROS 的水平顯著降低，且隨TF3 濃度增高，效果越明顯（圖3）。

2.4 TF3 對(duì)細(xì)胞抗氧化基因表達(dá)的作用

為了闡明TF3 減少ROS 的原因， 我們從基因水平方面研究了TF3 的作用機(jī)制。 結(jié)果顯示，TF3可以提高抗氧化基因Nrf2 的表達(dá)水平，并增加其下游基因HO-1、CAT 的表達(dá)， 并隨著TF3 濃度增加，效果越明顯（圖4）。

圖2 TF3 對(duì)細(xì)胞活性的影響Figure 2 The effect of TF3 on cell viability

圖3 TF3 對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS 的作用(×100)Figure 3 The effect of TF3 on intracellular ROS （×100）

3 討論

TF3 是紅茶中的主要成分，具有抗炎、抗氧化等多種藥理活性[15-16]。 TF3 可以通過(guò)抑制ROS 的產(chǎn)生減少破骨細(xì)胞的形成，抑制骨吸收[17-19]。 細(xì)胞內(nèi)ROS的含量受到轉(zhuǎn)錄因子Nrf2 的調(diào)控， 當(dāng)細(xì)胞內(nèi)ROS升高時(shí)，胞質(zhì)中的Nrf2 進(jìn)入細(xì)胞核，與抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant responsive element，ARE）結(jié)合[20-22]，促進(jìn)下游抗氧化酶的表達(dá)， 進(jìn)而清除過(guò)多的ROS。有關(guān)TF3 對(duì)骨質(zhì)疏松的作用及作用機(jī)制， 目前尚未見(jiàn)報(bào)道。

圖4 TF3 對(duì)細(xì)胞抗氧化基因表達(dá)的作用Figure 4 The effect of TF3 on antioxidant gene expression

OVX 骨質(zhì)疏松模型是一種能很好地模擬因雌激素減少引起骨質(zhì)疏松的經(jīng)典模型。 雌性動(dòng)物卵巢被切除后，雌二醇水平降低,模擬了絕經(jīng)后婦女的高轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松狀態(tài)。 這類模型成功率高、重復(fù)性好、適用范圍廣。 因此，我們建立了小鼠OVX 模型以檢測(cè)TF3 在小鼠體內(nèi)對(duì)骨質(zhì)疏松的預(yù)防作用。 股骨Micro-CT 分析結(jié)果顯示， 注射3 個(gè)月TF3 后，OVX 引起的骨小梁丟失程度可以降低，治療組骨小梁的數(shù)目和體積明顯大于OVX 組， 且隨著TF3 劑量的增加，這種預(yù)防作用更加明顯。

為了進(jìn)一步探討TF3 預(yù)防骨質(zhì)疏松的原因，我們使用前成骨細(xì)胞系MC3T3-E1 進(jìn)行機(jī)制部分的探討。骨質(zhì)疏松時(shí)，細(xì)胞內(nèi)ROS 水平增加，細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)， 可影響成骨細(xì)胞的增殖和功能[14,23-25]。因此本實(shí)驗(yàn)用H2O2建立了細(xì)胞氧化應(yīng)激模型，研究TF3 對(duì)細(xì)胞氧化應(yīng)激的作用及機(jī)制。 CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與既往研究結(jié)果不同， 可能與細(xì)胞類型不同、處理時(shí)間不同有關(guān)。 DCFH-DA 染色結(jié)果顯示，經(jīng)H2O2處理后， 能夠建立較為成功的氧化應(yīng)激模型，這與以往的研究結(jié)果一致[14]。 TF3 在H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激過(guò)程中確實(shí)發(fā)揮了抗氧化作用，減少了細(xì)胞內(nèi)ROS 的產(chǎn)生， 對(duì)H2O2誘導(dǎo)的MC3T3-E1 細(xì)胞的氧化損傷具有保護(hù)作用。由于Nrf2 在抗氧化過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，我們進(jìn)一步檢測(cè)了抗氧化基因的表達(dá)。 qRT-PCR 結(jié)果表明，TF3 可以促進(jìn)Nrf2及其下游基因HO-1、CAT 的表達(dá)，清除細(xì)胞內(nèi)過(guò)多的ROS。

綜上所述，TF3 可能通過(guò)增加抗氧化基因Nrf2、HO-1 及CAT 的表達(dá)，清除過(guò)多的ROS，發(fā)揮抗氧化作用，保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷，從而抑制OVX骨質(zhì)疏松小鼠股骨的骨小梁丟失，這可為骨質(zhì)疏松的預(yù)防和治療提供潛在的靶點(diǎn)。 關(guān)于TF3 影響成骨分化的具體機(jī)制尚有待于進(jìn)一步研究。