李宏權(quán)， 姜繼宗， 馬亭云， 吳玉波， 錢文昊， 王長(zhǎng)虹

（1. 上海市徐匯區(qū)牙病防治所，上海 200032；2. 上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所，上海 201203）

口腔白斑為口腔最重要的潛在惡性病變，是口腔鱗癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）的主要來源之一。 白斑由增生到異常增生再到癌變，是一個(gè)致癌基因改變逐步積累后，導(dǎo)致細(xì)胞異常和不可控生長(zhǎng)，直到癌癥發(fā)生的多步驟過程[1]。2015 年全球有354 864 例新發(fā)口腔癌[2]，口腔鱗癌已成世界范圍的健康問題。 目前，篩選中藥有效成分被認(rèn)為是一個(gè)探求腫瘤化學(xué)預(yù)防藥物的有效途徑。

穿心蓮內(nèi)酯（andrographolide，AND）是源于穿心蓮（andrographis paniculata）的二萜內(nèi)酯類化合物，具有抗炎[3]、抗腫瘤[4]等活性。Yang 等[5]證實(shí)，AND 有抗OSCC 增殖的活性。Manoharan 等[6]證實(shí)AND 有防治倉(cāng)鼠頰囊癌變的活性。 陳博藝等[7]總結(jié)出AND是通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、影響不同細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)、抑制腫瘤細(xì)胞周期進(jìn)展等方面，發(fā)揮其抗腫瘤作用。 但AND 溶解度低、 生物利用度差的缺點(diǎn)，限制了其臨床應(yīng)用。 納米載體是提高藥物生物利用度的有效方式[8]。Yang 等[9]證實(shí)，載有AND 的固體 脂 質(zhì) 納 米 粒 （AND-solid lipid nanoparticles，AND-SLNs）可增加AND 溶解度，SLNs 是增加AND生物利用度的理想載體。 本研究通過對(duì)比納米化的AND（AND-SLNs）與普通AND，對(duì)OSCC 或白斑細(xì)胞株細(xì)胞抑制作用的差異， 探討納米化能否增強(qiáng)AND 的抗腫瘤增殖作用，為體內(nèi)實(shí)驗(yàn)提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 藥物與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)用藥物 AND-SLNs 與AND 由上海中醫(yī)藥大學(xué)王長(zhǎng)虹教授團(tuán)隊(duì)提供，保存于恒溫干燥箱中。 AND 純度為98%。 實(shí)驗(yàn)用每批次AND-SLNs 濃度由王長(zhǎng)虹教授團(tuán)隊(duì)制備后用HPLC 法測(cè)量獲得；現(xiàn)用現(xiàn)配，80 ℃水浴后用0.22 μm 濾器過濾。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞系及培養(yǎng)條件 OSCC 細(xì)胞系HN6 由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院口腔腫瘤實(shí)驗(yàn)室（上海市口腔重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）提供，口腔白斑細(xì)胞系Leuk1 由美國(guó)馬里蘭州馬里蘭大學(xué)牙科學(xué)院毛力教授提供。 將HN6 細(xì)胞置于DMEM 高糖培養(yǎng)液 （上海源培生物科技股份有限公司，C40306）中培養(yǎng)。 將Leuk1 細(xì)胞置于人角化上皮細(xì)胞培養(yǎng)液[（keratinocyte serum free medium, K-SFM）+表皮生長(zhǎng)因子]中培養(yǎng)。 所有細(xì)胞均在37 ℃、5%CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。 參照美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)（American type culture collection，ATCC）提供的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件在10 cm 培養(yǎng)皿中養(yǎng)殖細(xì)胞。 待細(xì)胞在預(yù)成培養(yǎng)液中生長(zhǎng)至70%～80% 時(shí)接種。

1.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.2.1 細(xì)胞攝取藥物定量實(shí)驗(yàn)研究[10]HN6、Leuk1 細(xì)胞系以1×105個(gè)/mL 的細(xì)胞密度分別接種在2 塊24 孔板中孵育，每孔1 mL。 孵育24 h 細(xì)胞貼壁后，24 孔板培養(yǎng)液中加入適量的AND-SLNs 和AND 藥物儲(chǔ)存液， 使培養(yǎng)液中2 種藥物均有8、80 μg/mL共2 種質(zhì)量濃度，在37 °C 培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h，各有3 個(gè)復(fù)孔。 去除培養(yǎng)液，24 孔板內(nèi)加入300 μL/孔的4%的多聚甲醛溶液固定10 min； 磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌1 次，時(shí)長(zhǎng)5 min。按200 μL/孔加入細(xì)胞裂解液EBC（不加蛋白酶抑制劑），輕微振蕩15 min。 細(xì)胞裂解液中的AND 藥物質(zhì)量濃度用高效液相色譜儀（HPLC）檢測(cè)。

1.2.2 細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)（MTS 法）[11]HN6 和Leuk1細(xì)胞以30 個(gè)/μL 的細(xì)胞密度接種于96 孔板內(nèi)。 在96 孔板最外一圈的孔內(nèi)只加入PBS， 排除邊緣效應(yīng)。 96 孔板置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)過夜。 次日，吸除一側(cè)縱行6 孔內(nèi)培養(yǎng)液，立即加入用培養(yǎng)液配制好的藥液，AND-SLNs 和AND 在96 孔板中從200 μg/mL 的原始質(zhì)量濃度依次稀釋9 次， 即200、100、50、25、2.5、0.25、0.025、0.002 5、0.000 25 和0.000 025 μg/mL 共10 個(gè)質(zhì)量濃度梯度，每個(gè)質(zhì)量濃度的藥物各有6 個(gè)復(fù)孔， 放入培養(yǎng)箱內(nèi)，分別培養(yǎng)24、48、72、96 h。 在1 mL 的CellTiter 96?AQueous One Solution Reagent 內(nèi)加入5 mL 的PBS（1∶5 稀釋）混合備用。 在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，吸去相應(yīng)孔內(nèi)培養(yǎng)液。 立即在每孔內(nèi)加入120 μL 準(zhǔn)備好的CellTiter 96?Aqueous One Solution Reagent/PBS 混合液。將96 孔板置于培養(yǎng)箱內(nèi)，作用4 h 后取出。用SunriseTM光吸收酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔在490 nm 的吸光度值（optical density,OD 值）。 存活率＝實(shí)驗(yàn)組OD值/空白對(duì)照組OD值× 100%。 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞增殖周期阻滯實(shí)驗(yàn)[12]以細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)獲得2 種藥物在48 h 時(shí)HN6、Leuk1 細(xì)胞的IC50 值為實(shí)驗(yàn)組藥物質(zhì)量濃度，配取相應(yīng)培養(yǎng)液及沒有藥物的培養(yǎng)液作為陰性空白對(duì)照。 HN6 和Leuk1 以3 × 104個(gè)/mL 的細(xì)胞密度各10 mL 接種于6 個(gè)10 cm 的培養(yǎng)皿中，饑餓過夜、待細(xì)胞貼壁。 37 ℃培養(yǎng)箱孵育12 h，0.25%胰酶消化，每組收集大約6×105個(gè)細(xì)胞， 室溫下以1 000 r/min的速率離心3 min， 用3 mL 預(yù)冷的PBS 洗滌1 次，在4 ℃下用3 mL 預(yù)冷的70%乙醇溶液固定4 h或過夜。 細(xì)胞再以1 000 r/min 速率離心3 min，用預(yù)冷的PBS 洗滌1 次， 用402.75 μL 冷的PBS 重懸細(xì)胞，加入2.25 μL 的核糖核酸酶A（RNase A）（10 mg/mL）和45 μL 的碘化丙啶（propidium iodide，PI）（1 mg/mL），4 ℃避光孵育30 min。流式細(xì)胞儀分析。 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)[13]HN6 和Leuk1以3×104個(gè)/mL 的細(xì)胞密度接種，2.5 mL/孔，各3 塊6 孔板，過夜待細(xì)胞貼壁。 次日，吸除1 塊6 孔板中的培養(yǎng)液， 加入含有48 h IC50 質(zhì)量濃度的藥物培養(yǎng)液，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育12 h；再去除1 塊6 孔板中的培養(yǎng)液， 加入含有48 h 的IC50 質(zhì)量濃度的藥物培養(yǎng)液，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育6 h；第3 塊6 孔板作為陰性空白對(duì)照。孵育結(jié)束后，按Alexa Fluor ?488 Annexin V/Dead Cell Apoptosis Kit 試劑盒要求收集細(xì)胞，用冷的PBS 洗滌1 次。轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸液至流式管內(nèi)，1 000 r/min 速率離心3 min，重新離心細(xì)胞，棄上清液， 并用1 × 膜聯(lián)蛋白結(jié)合緩沖液100 μL 重懸細(xì)胞。在含有約2.25 × 105個(gè)細(xì)胞的懸液100 μL 中加入5 μL 的Annexin V-FITC （Annexin V-fluorescein isothiocyante）和5 μL 的50 μg/mL PI 工作液；在室溫、避光條件下，共同孵育15 min。在冰上，將400 μL的1 × 膜聯(lián)蛋白結(jié)合緩沖液加入100 μL 的細(xì)胞懸液中并輕柔混合后，用流式細(xì)胞儀和隨機(jī)軟件分析細(xì)胞凋亡結(jié)果。 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

用SPSS 19.0 軟件統(tǒng)計(jì)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)， 用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析。 用GraphPad Prism 6.0 作統(tǒng)計(jì)圖。P＜0.05 判斷為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.1 細(xì)胞定量攝取實(shí)驗(yàn)

HN6 細(xì)胞經(jīng)AND-SLNs 處理后以8、80 μg/mL的質(zhì)量濃度分別孵育2 h 后，吸收AND 的量為24.20、82.84 μg/mL，對(duì)應(yīng)AND 組的吸收量為0.00、9.17 μg/mL。AND-SLNs 組細(xì)胞吸收量均比AND 組多，且隨藥物質(zhì)量濃度的增加細(xì)胞吸收量也增加（圖1A）。

Leuk1 細(xì)胞經(jīng)AND-SLNs 處理后以8、80 μg/mL的質(zhì)量濃度分別孵育2 h 后， 吸收AND 的量為6.28、13.46 μg/mL， 對(duì)應(yīng)AND 組的吸收量為6.06、16.81 μg/mL。 同質(zhì)量濃度AND-SLNs 和AND 的藥物吸收量相差不明顯，但均隨藥物質(zhì)量濃度的增加而增加（圖1B）。

圖1 HPLC 定量檢測(cè)細(xì)胞攝取藥物實(shí)驗(yàn)Figure 1 Cellular uptake in quantitive examination by HPLC

2.2 細(xì)胞生長(zhǎng)增殖抑制試驗(yàn)（MTS 法）

如圖2A 和2B 所示， 藥物作用于HN6 細(xì)胞48 h后，AND-SLNs 和AND 的IC50 分別為6.09、13.75 μg/mL。 藥物作用于Leuk1 細(xì)胞48 h 后，AND-SLNs 和AND 的IC50 分別為0.72、26.14 μg/mL。

圖2 用MTS 方法進(jìn)行細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)Figure 2 Cell viability assay by MTS

2.3 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期阻滯實(shí)驗(yàn)

6.09 μg/mL 的AND-SLNs 和13.75 μg/mL 的AND 作用于HN6 細(xì)胞12 h， 在細(xì)胞G0/G1 期為（55.41±2.00）%對(duì)（30.75±9.33）%，P=0.01；在細(xì)胞增殖期（G2/M+S）為（44.59±2.00）%對(duì)（69.25±9.33）%，P=0.039。 詳見圖3A、3B。

0.72 μg/mL 的AND-SLNs 和26.14 μg/mL 的AND 作用于Leuk1 細(xì)胞12 h， 在細(xì)胞G0/G1 期為（61.65±7.62）%對(duì)（41.49±4.34）%，P=0.016；在細(xì)胞增殖期（G2/M+S）為（38.35±7.62）%對(duì)（58.51±4.34）%，P=0.026。 詳見圖3C、3D。

2.4 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)

6.09 μg/mL 的AND-SLNs 和13.75 μg/mL 的AND 作用于HN6 細(xì)胞6 h 或12 h 后的情況如下。6 h 的早期凋亡率為（5.45±0.36）%對(duì)（3.74±0.04）%，P=0.022；晚期凋亡率為（2.62±0.32）%對(duì)（1.59±0.23）%，P＞0.05；總凋亡率為（8.06±0.68）%對(duì)（5.33%±0.27）%，P=0.034（圖4A、4B）。 12 h 早期凋亡率為（3.24±0.23）%對(duì)（3.38±0.39）%，P＞0.05；晚期凋亡率為（7.04±0.38）%對(duì)（1.46±0.08）%，P=0.002；總凋亡率為（10.28±0.16）%對(duì)（4.84±0.30）%，P=0.002（圖4C、4D）。 部分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與藥物抑制增殖曲線相符。

圖3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期阻滯實(shí)驗(yàn)Figure 3 Cell cycle analysis by flow cytometry

0.72 μg/mL 的AND-SLNs 和26.14 μg/mL 的AND 作用于Leuk1 細(xì)胞6 h 或12 h 后的凋亡率如下。 6 h 早期凋亡率為（0.47±0.17）%對(duì)（0.36±0.02）%，P＞0.05； 晚期凋亡率為 （11.30±0.04）%對(duì) （11.53±0.04）%，P＞0.05； 總 凋 亡 率 為 （11.77±0.13）%對(duì)（11.88±0.01）%，P＞0.05（圖4E、4F）。 12 h 早期凋亡率為（0.30±0.01）%對(duì)（0.43±0.13）%，P＞0.05；晚期凋亡率為（23.73±0.11）%對(duì)（14.27±0.69）%，P=0.003；總的凋亡率為（23.99±0.11）% 對(duì)（14.70±0.81）%，P=0.004（圖4G、4H）。 部分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，與藥物抑制增殖曲線相符。

3 討論

3.1 關(guān)于穿心蓮有效成分通過納米技術(shù)提高生物利用度的思考

納米化學(xué)預(yù)防最早由Mukhtar 團(tuán)隊(duì)提出[14]。 姜黃[15]、染料木黃酮[16]等化學(xué)預(yù)防藥物研究顯示，納米粒子載藥系統(tǒng)能使天然植物藥物減毒。

AND 納米化研究證明， 納米劑型改變的AND可優(yōu)化細(xì)胞表面轉(zhuǎn)運(yùn)方式、 提高生物利用度、 增強(qiáng)AND 生物活性，可作為治療疾病的新劑型[17-18]。為研究植物天然產(chǎn)物AND 應(yīng)用于預(yù)防和治療OSCC 的可能，本課題組與上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所王長(zhǎng)虹教授的團(tuán)隊(duì)合作， 其中關(guān)于AND-SLNs 及AND的制備和特性已發(fā)表[9,19]。 通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，探索具有抗癌活性的AND 納米化后， 被細(xì)胞攝取的情況和抑制OSCC 和白斑細(xì)胞增殖的效果。

圖4 Annexin V-PI 凋亡實(shí)驗(yàn)Figure 4 Annexin V-PI apoptosis assay

3.2 AND 及其固體脂質(zhì)納米?？筄SCC 細(xì)胞和白斑細(xì)胞的有效性和差異性

細(xì)胞定量攝取藥物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，AND-SLNs更能促進(jìn)HN6 細(xì)胞對(duì)AND 的吸收，且具有濃度-時(shí)間依賴性和一定的細(xì)胞特異性。 本實(shí)驗(yàn)說明ANDSLNs 更能促進(jìn)細(xì)胞對(duì)AND 的吸收， 固體脂質(zhì)納米粒作為載體促使AND 進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)達(dá)到較高程度的聚集，從而提高AND 的生物利用度。

細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，AND 納米化后仍具有抑制OSCC 增殖的活性， 同時(shí)兩者也均有抑制白斑細(xì)胞增殖的活性。 這與Wang 等[20]的研究結(jié)果相符。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示AND-SLNs 對(duì)2 個(gè)細(xì)胞系在48 h 的IC50 均小于AND，且具有時(shí)間-濃度依賴性和一定的細(xì)胞特異性， 證明AND-SLNs 抑制OSCC和白斑細(xì)胞增殖的生物活性比單純AND 更強(qiáng)。

細(xì)胞周期阻滯實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，AND-SLNs 比單純的AND 更明顯阻滯HN6 和Leuk1 細(xì)胞增殖周期于G0/G1 期， 其阻滯細(xì)胞增殖周期的活性更強(qiáng)，進(jìn)而能更強(qiáng)地抑制細(xì)胞進(jìn)入生長(zhǎng)增殖期。

細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)證明，AND-SLNs 在作用HN6 和Leuk1 細(xì)胞6 h 和12 h 后，與AND 的作用相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明AND-SLNs 具有更強(qiáng)的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的生物活性， 從而證明AND-SLNs 抗OSCC 和白斑細(xì)胞的活性更強(qiáng)。

3.3 AND 及其固體脂質(zhì)納米?？筄SCC 細(xì)胞和白斑細(xì)胞可能的機(jī)制

Roy[17]、Yang[9]、Yen[18]及楊濤等[19]對(duì)AND 納米化的研究結(jié)果均表明，以相應(yīng)的納米粒作為載體能夠增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)AND 的攝取， 提高AND 的生物利用度，增強(qiáng)AND 的生物活性，加強(qiáng)對(duì)寄生蟲的殺滅，顯著恢復(fù)小鼠受損的肝功能， 更好地穩(wěn)定血壓、更強(qiáng)地抑制癌細(xì)胞增殖和抑制胃腸道炎癥反應(yīng)。

本研究提示可能由于納米載體促進(jìn)了細(xì)胞對(duì)藥物攝取，提高藥物在靶細(xì)胞中的濃度，從而明顯抑制細(xì)胞生長(zhǎng)增殖、阻滯細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗OSCC 細(xì)胞和白斑細(xì)胞活性。 但其具體作用機(jī)制和信號(hào)通路還待進(jìn)一步研究。

3.4 體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究展望

Wang[20]、Manoharan[6]、Hsieh[21]及Yang 等[5]均 通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明了AND 具有防治口腔黏膜癌變的活性。 本次實(shí)驗(yàn)顯示，納米化的AND 抗OSCC 細(xì)胞和白斑細(xì)胞的增殖活性強(qiáng)于單純的AND，因而可考慮進(jìn)一步應(yīng)用合適的動(dòng)物模型，通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)來闡明納米化的AND 在白斑惡性轉(zhuǎn)變過程的作用。 此外， 相關(guān)AND 的靶向配體可靶向連接納米粒到癌細(xì)胞表面過度表達(dá)的特異性受體。 因此，研究AND的靶向配體可為臨床上使用AND 化學(xué)預(yù)防白斑癌變提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

綜上所述， 本文的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)初步證明，納米化的AND 對(duì)OSCC 細(xì)胞和白斑細(xì)胞具有更顯著的抗增殖活性的潛能。 本次實(shí)驗(yàn)表明AND-SLNs 納米劑型有望成為抗癌化學(xué)預(yù)防藥物的第1 步，為下一步的體內(nèi)研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。