姚祥龍， 楊 帥， 陳芳慧， 盛 樂， 趙 曼， 阮 健， 魯 山， 李 君， 蔡亞非,

(1.安徽師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，分子酶學(xué)與重大疾病機理研究安徽省重點實驗室，安徽 蕪湖 241000；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，江蘇 南京 210095)

2018年全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)報告顯示，在全球新增的210萬例癌癥病例中，乳腺癌以11.6%的發(fā)病率與肺癌并列第一，乳腺癌在女性癌癥中以46.3%的發(fā)生率和13.0%的死亡率成為女性癌癥霸主，嚴(yán)重威脅了現(xiàn)代女性的健康[1]。乳腺癌小鼠模型是乳腺癌疾病發(fā)生機理和藥效學(xué)評價中的重要工具，一般乳腺癌小鼠模型主要分為移植瘤和原發(fā)性瘤[2-3]。原發(fā)性乳腺癌模型保留有正常乳腺組織中的各類細(xì)胞和精細(xì)結(jié)構(gòu)，擁有癌細(xì)胞發(fā)生和生長的微環(huán)境，這種高度的還原性，使原發(fā)性乳腺癌模型無論在組織學(xué)，還是在病理學(xué)方面都擁有比移植瘤更高的擬真性，因此，原發(fā)性的乳腺癌小鼠模型成為乳腺癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移機理的理想模型[4-6]。

PyMT、ERBB2(HER-2)、PyMT、Wnt-1是一類目前研究較為明確的癌基因[7-9]，MMTV-PyMT轉(zhuǎn)基因小鼠就是特定的剝離MMTV病毒這類導(dǎo)致小鼠乳腺腫瘤的重要病毒的組織特異啟動子和增強子，用來介導(dǎo)PyMT癌基因在乳腺中高表達，從而誘發(fā)乳腺上皮細(xì)胞中PyMT基因的表達失控，進而誘發(fā)細(xì)胞的惡性增殖，導(dǎo)致乳腺癌的發(fā)生[10-11]。這種原發(fā)性的乳腺癌小鼠具有癌癥自發(fā)率高，模型構(gòu)建成本低，個體差異小，短時間能獲得大量樣本等優(yōu)點，因此被選為乳腺癌模型中的經(jīng)典模型[12]。MMTV-PyMT轉(zhuǎn)基因小鼠模型擁有腫瘤發(fā)生時間早，生長速度快，發(fā)病進程高度與人體腫瘤病理相似、和實驗易重復(fù)等客觀優(yōu)點常被用來當(dāng)作乳腺癌模型。故本實驗采用MMTV-PyMT乳腺癌轉(zhuǎn)基因小鼠為研究對象，觀察在完整生命周期內(nèi)不同性別、不同周齡下的癌癥發(fā)展過程與病理變化指標(biāo)，以研究該模型的客觀規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及飼養(yǎng)環(huán)境

MMTV-PyMT轉(zhuǎn)基因小鼠購買于南方模式動物中心，飼養(yǎng)在可自由獲取水和食物的鼠籠中，鼠房內(nèi)溫度(23～28℃)和濕度(50%～80%)保持相對恒定，維持12小時的光-暗循環(huán)。

1.2 主要試劑

Taq酶、dNTP Mixture、10×PCR buffer等均購自寶生物工程(大連)有限公司，Tris-Base、EDTA·NA2、SDS、NaCl、蛋白酶K、DNA marker、6×DNA loading buffer、瓊脂糖以及引物合成等購自于生工生物工程(上海)股份有限公司，伊紅染色液和蘇木精染色液購自博士德生物工程有限公司。

1.3 主要儀器

恒溫混勻儀(杭州米歐儀器有限公司)、PCR儀(杭州朗基科學(xué)儀器有限公司)、Tanon電泳系列(上海天能科技有限公司)、電泳Tanon-2500全自動數(shù)碼凝膠圖像分析儀(上海天能科技有限公司)、半自動輪轉(zhuǎn)式切片機Leica RM2245(Leica)，Olympus BX61顯微鏡(奧林巴斯(中國)有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 基因型的鑒定 MMTV-PyMT轉(zhuǎn)基因小鼠的基因組DNA從小鼠尾尖或耳尖提取。小鼠的基因組DNA進行PCR反應(yīng)，引物信息為：5′-CAAATGTTGCTTGTCTGGTG-3′ ∶ 5′-GTCAGTCGAGTGCACAGTTT-3′ ∶ 5′-GGAAGCAAGTACTTCACAAGGg-3′ ∶ 5′-GGAAAGTCACTAGGAGCAGGG-3′。PCR反應(yīng)體系如表1。

表1 PCR反應(yīng)體系

根據(jù)上述的PCR反應(yīng)體系，對PyMT進行PCR擴增反應(yīng)，條件如下：94℃3min，94℃30s，60℃1min，72℃30s，35個循環(huán)，72℃保溫10min，4℃2min。反應(yīng)產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳。PCR產(chǎn)物與6×DNA loading buffer按照5 ∶ 1的比例充分混勻，10μl的混合樣品被添加于1%瓊脂糖凝膠上樣孔中，100V 80mA進行電泳，30min后在凝膠系統(tǒng)成像儀下拍照。

1.4.2 一般形態(tài)學(xué)觀察 記錄小鼠配種，子代出生時間等關(guān)鍵信息。小鼠出生后21天左右對雌雄小鼠進行分籠、編號及基因型的鑒定，以每兩天一次的頻率觀察MMTV-PyMT雌雄小鼠的腫瘤是否發(fā)生，記錄發(fā)生時間，發(fā)生位置等相關(guān)數(shù)據(jù)。密切關(guān)注雌雄小鼠的活動狀態(tài)和死亡情況，做好記錄。

1.4.3 組織病理學(xué)切片及染色 取不同時期的腫瘤組織，放入4%中性甲醛中固定24h，常規(guī)石蠟包埋、切片以及HE染色，顯微鏡下觀察腫瘤組織病理學(xué)變化。

2 結(jié)果

2.1 基因型的鑒定

MMTV-PyMT(+)雄性小鼠與FVB(-)雌性小鼠交配，新生的MMTV-PyMT小鼠在表觀上與野生型小鼠無任何區(qū)別。每只小鼠的基因型均被鑒定，鑒定結(jié)果如圖1B所示，MMTV-PyMT陽性小鼠基因檢測條帶為550bp，結(jié)果中樣本1、2均為MMTV-PyMT陽性小鼠，即基因型為MMTV-PyMT(+)。而樣品3、4、5、6均無明顯條帶，所以樣品3、4、5和6均為MMTV-PyMT陰性小鼠即FVB小鼠。

圖1 MMTV-PyMT轉(zhuǎn)基因小鼠配種模式圖和基因型鑒定圖

2.2 雌性和雄性發(fā)病時間和生存時間的比較

所有MMTV-PyMT陽性小鼠均會自發(fā)性地產(chǎn)生腫瘤。但是，雌性小鼠在發(fā)病時間上遠(yuǎn)早于雄性，雌性MMTV-PyMT小鼠在出生后第8周就會發(fā)生腫瘤，而雄性小鼠則在第19周才會產(chǎn)生腫瘤。雄性小鼠罹患腫瘤后的存活時間為26周，相較于雌性小鼠的12周存活時間更長，如圖2A所示。MMTV-PyMT雌雄小鼠發(fā)生腫瘤后的生存曲線如圖2B、2C所示，MMTV-PyMT雌性小鼠在第15周時開始有個體死亡，至19周時MMTV-PyMT雌性小鼠均已死亡(N=11)。而雄性MMTV-PyMT小鼠最早個體死亡時間在第39周，最長存活時間不超過46周(N=8)。根據(jù)觀察，如圖2D所示，雌性MMTV-PyMT小鼠最先發(fā)生病變的乳區(qū)為第三乳區(qū)。與雄性小鼠相比較，雌性小鼠腫瘤的生長速度更快，存活時間更短。

圖2 MMTV-PyMT小鼠腫瘤發(fā)生特點

2.3 腫瘤不同時期的HE染色

MMTV-PyMT雌性小鼠自發(fā)的腫瘤均為浸潤性導(dǎo)管癌[12]。雌性MMTV-PyMT小鼠第11周時的乳腺組織染色結(jié)果顯示：在第11周時乳腺腫瘤還處于早期的導(dǎo)管浸潤癌階段，但癌細(xì)胞已開始突破乳腺導(dǎo)管上皮的基膜，在乳腺間質(zhì)中已經(jīng)出現(xiàn)散布的癌細(xì)胞巢。在第14周時癌細(xì)胞開始廣泛向乳腺間質(zhì)浸潤，癌組織與乳腺間質(zhì)相互混雜，形成了多變的病理圖像。在第19周時，腫瘤已經(jīng)發(fā)展到末期階段，乳腺組織各個部分已經(jīng)完全無法區(qū)分，癌細(xì)胞呈現(xiàn)巢團狀排列，細(xì)胞核增大，腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)出彌散性分布、細(xì)胞大小不等、質(zhì)實，細(xì)胞間推擠或重疊，細(xì)胞大小形態(tài)不同，并伴隨出血現(xiàn)象。

圖3 正常小鼠乳腺和不同時期MMTV-PyMT雌性小鼠腫瘤組織HE染色

3 討論

Neu酪氨酸激酶的異常活化是引發(fā)小鼠乳腺上皮細(xì)胞有關(guān)腺癌的關(guān)鍵性因素，其中主要因素是由小鼠乳腺癌病毒MMTV轉(zhuǎn)錄調(diào)控和多瘤病毒的T抗原所介導(dǎo)的Neu酪氨酸激酶的特異性表達。將小鼠乳腺癌病毒MMTV基因的啟動子和增強子區(qū)域與癌基因PyMT整合在一起，通過基因重組技術(shù)導(dǎo)入到轉(zhuǎn)基因動物模型的基因組內(nèi)，產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因動物模型就是能自發(fā)產(chǎn)生乳腺癌的MMTV-PyMT乳腺癌小鼠模型。這類MMTV-PyMT小鼠由于在乳腺上皮組織中PyMT致癌基因高表達，誘導(dǎo)正常的上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，最終導(dǎo)致乳腺癌的發(fā)生。

本研究選取MMTV-PyMT轉(zhuǎn)基因小鼠作為研究對象，研究MMTV-PyMT乳腺癌小鼠模型腫瘤發(fā)生的特點。實驗研究發(fā)現(xiàn)雌性MMTV-PyMT 小鼠在出生后第 8 周發(fā)生可觸及的腫瘤，隨著雌性小鼠年齡的增加，其余乳區(qū)也陸續(xù)發(fā)生腫瘤，在第13周時，5對均已發(fā)生腫瘤。雌性轉(zhuǎn)基因小鼠的腫瘤在第13周后生長速度極快[13]，快速生長的腫瘤開始嚴(yán)重影響小鼠的生活質(zhì)量，其活動能力和進食能力出現(xiàn)嚴(yán)重的下滑。MMTV-PyMT雌性小鼠最早死亡時間在15周，至19周時所有雌性小鼠均已死亡。此前，雄性MMTV-PyMT 轉(zhuǎn)基因小鼠尚未表現(xiàn)出任何異常，乳腺區(qū)域也未觸摸到明顯的硬塊，但是第19周雄性MMTV-PyMT小鼠罹患腫瘤，雄性小鼠罹患腫瘤后最早死亡時間在第39周，于第46周時全部死亡，帶腫瘤的生存時間為26周。

MMTV-PyMT乳腺癌模型小鼠雌雄性小鼠均可自發(fā)產(chǎn)生腫瘤，但是發(fā)生時間和存活時間有較大的差異，雌性小鼠發(fā)病早，轉(zhuǎn)移快，存活時間短，雄性小鼠發(fā)病晚，存活時間長。雌性MMTV-PyMT小鼠在腫瘤發(fā)生后大約2～3周時間，原位腫瘤細(xì)胞即開始發(fā)生轉(zhuǎn)移，同時各個乳區(qū)的腫瘤增長極快，小鼠身體負(fù)擔(dān)加重，不久就會死亡[12]。MMTV-PyMT乳腺癌模型小鼠能較為真實的模擬人體乳腺腫瘤發(fā)生的過程，從發(fā)生、轉(zhuǎn)移到擴散都有著較為明確的時間間隔并且其整個過程的組織形態(tài)學(xué)變化與人乳腺癌的發(fā)展過程極其相似，是臨床研究乳腺癌發(fā)病機理和藥物篩選可靠的模型。MMTV-PyMT雄性小鼠晚成瘤和長存活時間的特性，一方面為MMTV-PyMT模型小鼠種群繁衍提供了有利條件，另一方面也表明雌雄個體間差異在腫瘤形成過程中也是重要的影響因素，利用該模型可以更深入地探究這種機制，為臨床乳腺癌的發(fā)病機理研究提供參考。