高雅鑫，倪楠，許斌，范海茹，張蒙冉，盧聰，張娜娜，范蓓，王鳳忠，李淑英

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京，100193)

納豆激酶是枯草芽孢桿菌發(fā)酵大豆制備納豆過程中產(chǎn)生的一種絲氨酸蛋白酶[1]，因其具有多種溶栓功效[2]而備受關(guān)注，但是納豆的特有不良風(fēng)味一直是其產(chǎn)業(yè)推廣的瓶頸。納豆風(fēng)味改良主要通過菌種選育、工藝優(yōu)化、輔料添加等[3-5]措施以適度降低或掩蓋其特有不良風(fēng)味，但要從根本上解決風(fēng)味問題還需明確其主要揮發(fā)性成分。不同學(xué)者對納豆風(fēng)味物質(zhì)的解析鑒定因大豆品種、發(fā)酵條件和檢測方法的不同而有所差異：TANAKA等[6]研究表明，丙酮、異丁酸甲酯、氨、2,5-二甲基吡嗪(2,5-dimethylpyrazine，2,5-DMP)、2-甲基丁酸是納豆的主要風(fēng)味物質(zhì)。LIU等[7]和黃璇等[8]研究表明，2,5-DMP、2,3,5-三甲基吡嗪(2,3,5- trimethylpyrazine，2,3,5-TMP)和川芎嗪等物質(zhì)對納豆風(fēng)味有很大貢獻(xiàn)。劉野等[9]認(rèn)為酸類及以2,5-DMP為主的吡嗪類物質(zhì)含量高低對整體風(fēng)味的影響很大。KEITAROU等[10]研究表明，異戊酸、三甲基吡嗪、1-辛烯-3-醇和1-己醇等是枯草芽孢桿菌發(fā)酵食品中主要特征風(fēng)味物質(zhì)。然而，對于枯草芽孢桿菌發(fā)酵豆制品風(fēng)味物質(zhì)的變化規(guī)律和產(chǎn)生機(jī)制尚不明確，有待開展深入的研究。

前期研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌BSNK-5通過液體深層發(fā)酵豆乳富集的納豆激酶活性顯著高于固體發(fā)酵[11]，更適合納豆激酶類產(chǎn)品的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，然而，該過程產(chǎn)生的不良風(fēng)味也更為突出。因此，本研究對BSNK-5發(fā)酵豆乳的感官和風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行了跟蹤鑒定，同時(shí)通過生化方法對其產(chǎn)生機(jī)制進(jìn)行初步探索。具體為電子鼻監(jiān)測發(fā)酵過程中的風(fēng)味變化，氣相色譜-質(zhì)譜(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)檢測不同時(shí)間點(diǎn)揮發(fā)性成分，理化方法研究發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)的代謝變化規(guī)律。本研究將為發(fā)酵豆乳及納豆的風(fēng)味改良奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆，市售；菌種：納豆枯草芽孢桿菌BSNK-5，實(shí)驗(yàn)室篩選保存[12]；KH2PO4、乙醇、NaOH等試劑均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

電子鼻(PEN3)，德國Airsense公司；氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(GCMS-QP2010 Plus)，日本島津公司；酶標(biāo)儀(spectra MAX190)，美谷分子儀器(上海)有限公司；凱氏定氮儀(YQ205-09)，意大利VELP公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵豆乳的制備

1.2.1.1 種子液制備

-80 ℃保存的納豆枯草芽孢菌BSNK-5經(jīng)LB固體培養(yǎng)基過夜活化后，取單菌落至20 mL LB液體培養(yǎng)基中,200 r/min過夜培養(yǎng)，取1 mL菌液轉(zhuǎn)接至100 mL LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)6～8 h后作為種子液備用。培養(yǎng)溫度均為37 ℃。

1.2.1.2 工藝流程

大豆清洗→浸泡(40 ℃水浴6 h)→瀝干→煮制豆乳(豆水比1∶8(g∶mL))→加400 mL豆乳于2 L搖瓶中(裝液量20%)→接菌量1%→發(fā)酵(同種子液培養(yǎng)條件)

分別于24、48、84 h取樣，以未發(fā)酵豆乳為對照(CK)。

1.2.2 發(fā)酵豆乳揮發(fā)性成分檢測

1.2.2.1 電子鼻感官分析

樣品預(yù)處理：取1 mL樣品于20 mL頂空瓶中，瓶蓋上用聚四氟乙烯隔墊密封。每個(gè)樣品平行3次。

檢測條件：采用頂空抽樣的方法，傳感器(種類詳見表1)清洗時(shí)間為180 s，檢測時(shí)間為60 s，自動(dòng)調(diào)零時(shí)間為10 s，內(nèi)部流量為300 mL/min，進(jìn)樣流量為300 mL/min。

表1 電子鼻傳感器信息Table 1 Sensor information of electronic nose

1.2.2.2 GC-MS分析

樣品預(yù)處理：參考黃璇等[8]的方法。取1 mL樣品于15 mL頂空瓶中，在磁力攪拌器上60 ℃加熱平衡后，通過隔墊插入已活化好的固相微萃取(solid-phase microextraction,SPME)萃取裝置(270 ℃活化30 min)，頂空吸附40 min 后，插入GC進(jìn)樣口解析5 min。每個(gè)樣品平行6次。

色譜(GC)條件：柱型采用DB-5 ms毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；升溫程序：柱溫40 ℃保持3 min，以5 ℃/min升至150 ℃，接著以10 ℃/min 升至250 ℃，保持10 min，再以20 ℃/min升至270 ℃，保持1 min；進(jìn)樣口溫度為250 ℃，采用不分流方式，載氣(He)流量為1.0 mL/min。

質(zhì)譜(MS)條件：離子源溫度200 ℃，電離方式EI，電子能量70 eV，燈絲電流150 μA，掃描質(zhì)量范圍m/z33～500。

1.3 理化分析

1.3.1 蛋白質(zhì)含量的測定

參考GB 5009.5—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》第一法凱氏定氮法進(jìn)行測定。

1.3.2 氨基酸態(tài)氮含量的測定

參考GB 5009.235—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸態(tài)氮的測定》比色法進(jìn)行測定。

1.3.3 游離氨基酸含量的測定

參考GB/T 8314—2013《茶游離氨基酸總量的測定》進(jìn)行測定。

1.3.4 揮發(fā)性鹽基氮含量的測定

參考GB 5009.228—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》第二法自動(dòng)凱氏定氮儀法進(jìn)行測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

電子鼻：48～52 s數(shù)據(jù)較穩(wěn)定，可進(jìn)行分析。將所測得的數(shù)據(jù)使用其自帶的Winmuster 軟件進(jìn)行主成分分析(principal component analysis,PCA)。

理化指標(biāo)：采用GraphPad Prism 7 進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 BSNK-5發(fā)酵豆乳揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

前期研究證實(shí)BSNK-5通過液體發(fā)酵豆乳大量富集納豆激酶的同時(shí)，其感官風(fēng)味也發(fā)生了嚴(yán)重劣變[11]。如圖1所示，12～36 h，發(fā)酵豆乳呈乳白色，風(fēng)味口感優(yōu)良；36～60 h，其顏色逐漸變黃，口感略苦，不良風(fēng)味逐漸增加；60～96 h，其顏色由黃變棕，口感苦澀味加重，風(fēng)味極差。

圖1 不同發(fā)酵時(shí)間的BSNK-5發(fā)酵豆乳Fig.1 BSNK-5-fermented soymilk at different fermentation time

根據(jù)BSNK-5發(fā)酵豆乳的風(fēng)味變化規(guī)律，本研究以未發(fā)酵豆乳為參照，選取3個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣，采用電子鼻分析風(fēng)味變化規(guī)律，GC-MS鑒定不同時(shí)間點(diǎn)的風(fēng)味物質(zhì)。3個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)為：24、48、84 h，結(jié)果表明，發(fā)酵豆乳24 h無不良風(fēng)味、48 h不良風(fēng)味較輕、84 h不良風(fēng)味較重。

2.1.1 電子鼻分析BSNK-5發(fā)酵豆乳的風(fēng)味變化規(guī)律

采取PCA對電子鼻檢測不同時(shí)間點(diǎn)發(fā)酵豆乳氣味信號(hào)進(jìn)行分析，結(jié)果如圖2-a所示，主成分1(PC1)和主成分2(PC2)的累積方差為99.60%(>85%)，說明可以很好地代表傳感器的主要信息特征，并準(zhǔn)確反映樣品信息。由圖2-a可知，沿著PC1軸，未發(fā)酵豆乳(CK)及24、48和84 h發(fā)酵豆乳樣品信息之間互不重疊，且從右到左呈現(xiàn)一定的變化趨勢。結(jié)果表明BSNK-5發(fā)酵豆乳隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，在嗅覺上呈現(xiàn)一定的變化規(guī)律，這與實(shí)驗(yàn)過程中嗅覺聞到不良風(fēng)味越來越濃郁的感官變化相一致。同時(shí)，由圖2-b可知，與氣味變化最密切的是氮氧化合物，整個(gè)發(fā)酵過程中其含量明顯降低，其次是無機(jī)硫化物含量輕微降低，而其他類別化合物含量并無明顯變化。

a-PCA圖;b-傳感信號(hào)三維圖圖2 電子鼻數(shù)據(jù)分析Fig.2 Analysis of electronic nose

2.1.2 GC-MS鑒定BSNK-5發(fā)酵豆乳揮發(fā)性物質(zhì)

以上電子鼻感官分析結(jié)果表明，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，BSNK-5發(fā)酵豆乳在風(fēng)味上呈現(xiàn)一定的變化趨勢。為了進(jìn)一步探明其呈味特征，本研究采用GC-MS對上述時(shí)間點(diǎn)樣品的揮發(fā)性化合物進(jìn)行鑒定。結(jié)果如表2和圖3所示，GC-MS共檢測到60種風(fēng)味物質(zhì)，主要包括烷烴類(6種)、醇類(7種)、醛類(5種)、酮類(8種)、有機(jī)酸酯類(18種)、雜環(huán)類(10種)及未做歸屬的其他類化合物(6種)。未發(fā)酵豆乳及24、48和84 h樣品中分別檢測到26、41、54和49種揮發(fā)性化合物，分別占揮發(fā)性總成分的71.18%、83.61%、97.46%、95.72%。由此可見，發(fā)酵可以顯著增加揮發(fā)性成分的種類。

表2 不同時(shí)間發(fā)酵豆乳揮發(fā)性成分Table 2 Volatile components in fermented soy milk at different times

續(xù)表2

a-餅圖;b-熱圖圖3 不同發(fā)酵時(shí)間豆乳發(fā)揮性成分含量比較Fig.3 Comparison of active components in soy milk at different fermentation times

就整體變化趨勢而言，揮發(fā)性化合物相對含量變化“從高到低”的化合物有烷烴類、醇類；“從高到低，再到高”的化合物為醛類；“從低到高，再到低” 的化合物為有機(jī)酸酯類，且在發(fā)酵24 h時(shí)達(dá)到峰點(diǎn)；“從低到高”的化合物為酮類、雜環(huán)類，除2-正戊基呋喃外，均從未發(fā)酵豆乳中“無”到發(fā)酵豆乳中合成。酮類化合物在3個(gè)發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)幾乎保持不變。雜環(huán)類化合物中2-正戊基呋喃為豆腥味物質(zhì)[13]，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，其含量有所降低，說明BSNK-5有助于降解豆腥味物質(zhì)；吡嗪類化合物含量在整個(gè)發(fā)酵過程中顯著增加，84 h時(shí)在總揮發(fā)性成分中占比達(dá)到60.70%，其中以2,5-DMP和2,3,5-TMP為主，二者在總揮發(fā)性成分中占比分別為46.53%和9.71%，在雜環(huán)化合物中占比分別為76.65%和16.00%，說明吡嗪類化合物為BSNK-5發(fā)酵豆乳的主要呈味物質(zhì)，側(cè)面解釋了電子鼻感官分析結(jié)果中氮氧化合物含量明顯減少的現(xiàn)象，極可能轉(zhuǎn)為只含氮原子的吡嗪類化合物。

2.2 理化方法分析BSNK-5發(fā)酵豆乳的蛋白質(zhì)代謝變化

多數(shù)納豆的風(fēng)味研究表明2,5-DMP是引起納豆特有風(fēng)味的主要成分。吡嗪是由美拉德反應(yīng)或微生物發(fā)酵產(chǎn)生，均與蛋白質(zhì)代謝有關(guān)[14-15]。因此，本研究進(jìn)一步分析了豆乳中蛋白質(zhì)的代謝變化，具體測定了不同時(shí)間點(diǎn)發(fā)酵豆乳中蛋白質(zhì)、氨基酸態(tài)氮、游離氨基酸和揮發(fā)性鹽基氮的含量變化，氨基酸態(tài)氮可側(cè)面反映小分子肽和游離氨基酸的變化，揮發(fā)性鹽基氮也可表明氨基酸代謝的發(fā)生。由圖4可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，蛋白質(zhì)含量下降；氨基酸態(tài)氮、游離氨基酸和揮發(fā)性鹽基氮的含量均呈上升趨勢。48與84 h相比，除揮發(fā)性鹽基氮的含量明顯增加外，其他指標(biāo)含量差異較小，說明2個(gè)時(shí)間點(diǎn)的樣品在蛋白質(zhì)、肽和氨基酸等營養(yǎng)品質(zhì)上差異不大，但在風(fēng)味上發(fā)生了顯著變化。

a-蛋白質(zhì)含量變化;b-氨基酸態(tài)氮含量變化;c-游離氨基酸含量變化;d-揮發(fā)性鹽基氮含量變化圖4 不同時(shí)間發(fā)酵豆乳蛋白質(zhì)變化規(guī)律Fig.4 Changes of protein in fermented soy milk at different times注：**表示差異極顯著(P<0.01)；***表示差異高度顯著(P<0.001)

3 討論

本研究旨在明確BSNK-5發(fā)酵豆乳中特有風(fēng)味物質(zhì)，通過對不同時(shí)間點(diǎn)發(fā)酵豆乳的風(fēng)味分析和理化檢測以反映整個(gè)發(fā)酵過程中感官和揮發(fā)性成分的動(dòng)態(tài)變化及其產(chǎn)生機(jī)制，研究發(fā)現(xiàn)主要是以2,5-DMP和2,3,5-TMP為主的吡嗪類化合物貢獻(xiàn)了其特有風(fēng)味，與黃璇等[8]的研究一致，同時(shí)也與本研究電子鼻感官分析結(jié)果中氮氧化合物含量的改變、蛋白質(zhì)代謝中游離氨基酸等指標(biāo)的顯著變化相呼應(yīng)，進(jìn)一步加深了“吡嗪類物質(zhì)與枯草芽孢桿菌發(fā)酵豆制品特有風(fēng)味相關(guān)”的猜測。

吡嗪類化合物是BSNK-5發(fā)酵豆乳新增化合物，在不良風(fēng)味出現(xiàn)時(shí)，其含量顯著增加。吡嗪類化合物的閾值較低，天然發(fā)酵食品中因其含量較低多呈現(xiàn)優(yōu)良風(fēng)味，氣相色譜-聞香器(gas chromatography-dfactometry,GC-O)技術(shù)分析中對2,5-DMP的風(fēng)味描述為“焙烤味、堅(jiān)果味、霉味和泥土味”[16]，因此，在納豆或本研究的發(fā)酵豆乳中可能因其合成量過多而引起不愉快的氣味。有研究表明，枯草芽孢桿菌可代謝產(chǎn)生2,5-DMP和四甲基吡嗪(tetramethylpyrazine，TTMP)等吡嗪類物質(zhì)[17]，已知2,5-DMP的前體物質(zhì)為蘇氨酸，在酶催化下產(chǎn)生氨基丙酮，進(jìn)而通過非酶促反應(yīng)合成2,5-DMP[18]。但是培養(yǎng)基在不添加任何前體物質(zhì)(蘇氨酸、乙酰丙酮)的前提下，主要存在2,5-DMP和2,3,5-TMP，幾乎沒有TTMP[19]，這與本研究中GC-MS 結(jié)果一致。而TTMP是白酒中主要香氣成分，其代謝途徑為糖酵解產(chǎn)生丙酮酸，以其為原料合成α-乙酰乳酸，再脫羧產(chǎn)生乙偶姻，進(jìn)而分泌到胞外聯(lián)合氨基酸代謝產(chǎn)生的游離氨合成TTMP[20]，因此，推測2,5-DMP代謝干擾了TTMP的前體物質(zhì)乙偶姻的合成，或者乙偶姻的競爭合成物質(zhì)乙酸過量合成使TTMP合成受阻[21]。同時(shí)，BSNK-5發(fā)酵豆乳相對納豆固體發(fā)酵氧氣利用率高，也可引起吡嗪類化合物的過量合成[19]。然而，2-甲基丁酸、異戊酸等短鏈脂肪酸[22]作為大豆發(fā)酵制品中不良風(fēng)味物質(zhì)在整個(gè)發(fā)酵過程中卻呈現(xiàn)出降低的趨勢，可能由于發(fā)酵而轉(zhuǎn)為“酯”，但是在一定程度上也為2,5-DMP的合成提供堿性環(huán)境[19]。蛋白質(zhì)代謝的理化分析表明大豆中優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)降解為小分子肽及游離氨基酸，而揮發(fā)性鹽基氮作為氨基酸進(jìn)一步的代謝產(chǎn)物，可參與下游吡嗪等特有風(fēng)味物質(zhì)的合成，且BSNK-5產(chǎn)生蛋白酶系復(fù)雜，可能加速了“蛋白質(zhì)→肽→氨基酸→游離氨→揮發(fā)性鹽基氮”或“蘇氨酸→2,5-DMP”等代謝過程。

本研究中未能明確特有風(fēng)味物質(zhì)的主要來源和合成機(jī)制，需要進(jìn)一步對BSNK-5發(fā)酵豆乳中2,5-DMP、2,3,5-TMP等特有風(fēng)味物質(zhì)展開定量分析，并通過代謝組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)聯(lián)合分析，在全面闡釋發(fā)酵豆乳代謝產(chǎn)物譜的基礎(chǔ)上，明確BSNK-5發(fā)酵豆乳過程中的基因表達(dá)變化，進(jìn)而明確其產(chǎn)生機(jī)制。

4 結(jié)論

本研究以未發(fā)酵豆乳為對照，對 24、48和84 h的BSNK-5發(fā)酵豆乳開展了電子鼻和GC-MS的感官及風(fēng)味分析，并結(jié)合理化指標(biāo)初步研究其特有風(fēng)味物質(zhì)的合成機(jī)理。結(jié)果表明，發(fā)酵豆乳的風(fēng)味體系因時(shí)間點(diǎn)不同而有顯著差異，其中雜環(huán)類化合物中的吡嗪類物質(zhì)是主要呈味組分，并推測2,5-DMP為發(fā)酵豆乳的特征風(fēng)味物質(zhì)，而引起發(fā)酵豆乳風(fēng)味劣變的主要原因可能是蛋白質(zhì)的分解代謝促成了2,5-DMP的大量合成，引起發(fā)酵豆乳整體的風(fēng)味變化。本研究將為枯草芽孢桿菌發(fā)酵豆制品的風(fēng)味改良和產(chǎn)業(yè)化推廣奠定理論基礎(chǔ)。