王曉麗 劉永華 江錦紅

[摘要] 目的 探討IDH1-R123與Notch1雙突變對兒童急性T淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）的作用及機制。 方法 選擇2016年5月～2017年12月麗水市人民醫(yī)院兒童ALL患者58例作為對象，所有患者入院后均完成IDH1-R123與Notch1雙突變基因測序，確定IDH1-R123與Notch1雙突變在兒童急性T淋巴細(xì)胞白血病中的突變率及突變特征，入組患者均給予誘導(dǎo)、鞏固及維持治療，兩組治療后均完成24個月隨訪，比較突變兒童與非突變兒童生化指標(biāo)、臨床特征及預(yù)后。 結(jié)果 58例兒童ALL患者中33例IDH1-R123與Notch1雙突變，突變率為56.90%;突變兒童血WBC計數(shù)、平均血紅蛋白高于非突變兒童（P<0.05）;突變兒童平均血小板數(shù)低于非突變兒童（P<0.05）;ALL IDH1-R123突變25例，占43.10%，突變位于WD40區(qū)域，且均為點突變;Notch1突變8例，占13.79%，突變位點主要位于HD區(qū)域和PEST結(jié)構(gòu)域。其中，HD突變5例，占62.50%，均為氨基酸位點為233;PEST結(jié)構(gòu)域3例，占37.50%;突變兒童與非突變兒童6個月、12個月生存率無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;突變兒童18個月、24個月生存率低于非突變兒童（P<0.05）。 結(jié)論 IDH1-R123與Notch1雙突變在兒童急性T淋巴細(xì)胞白血病中突變率較高，且與患者不良預(yù)后有關(guān)，有助于指導(dǎo)臨床診療。

[關(guān)鍵詞] IDH1-R123突變;Notch1突變;兒童急性T淋巴細(xì)胞白血病;臨床特征

[中圖分類號] R733.71 R730.7 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-9701（2020）18-0015-04

Mechanism of IDH1-R123 and Notch1 mutations in pediatric acute T lymphocytic leukemia

WANG Xiaoli ? LIU Yonghua ? JIANG Jinhong

Department of Hematology， Lishui People's Hospital in Zhejiang Province， Lishui ? 323000， China

[Abstract] Objective To investigate the effect and mechanism of IDH1-R123 and Notch1 double mutations on pediatric acute T lymphocytic leukemia（ALL）. Methods From May 2016 to December 2017， 58 children with ALL in Lishui People's Hospital were selected as subjects. All patients completed IDH1-R123 and Notch1 double mutation genes sequencing after admission， so as to determine the mutation rate and mutation characteristics of IDH1-R123 and Notch1 double mutations in pediatric acute T lymphocytic leukemia. All patients were given induction， consolidation and maintenance for treatments. The two groups were followed up for 24 months after treatment. The biochemical indicators， clinical characteristics， and prognosis of children with mutation and non-mutation were compared. Results Among the 58 children with ALL， there were 33 cases with IDH1-R123 and Notch1 double mutations， and the mutation rate was 56.90%. The blood WBC count and average hemoglobin in the children with mutation were higher than those of children without mutation（P<0.05）. The average platelet count of children with mutation was lower than that of children without mutation（P<0.05）. There were 25 cases of ALL IDH1-R123 mutations， accounting for 43.10%. The mutations were located in the WD40 region and were all point mutations. There were 8 cases of notch1 mutation， accounting for 13.79%. The mutation sites were mainly located in the HD region and the PEST domain. Among them， there were 5 cases of HD mutations， accounting for 62.50%， which were all at the amino acid site of 233; there were 3 cases in PEST domain， accounting for 37.50%. The differences in the 6-month and 12-month survival rates of children with mutation and without mutation were not statistically significant（P>0.05）. The survival rate of children with mutation at 18 and 24 months was lower than that of children without mutation（P<0.05）. Conclusion IDH1-R123 and Notch1 double mutations have a higher mutation rate in children with acute T lymphocytic leukemia， and are associated with poor prognosis of patients， which can help guide clinical diagnosis and treatment.

[Key words] IDH1-R123 mutations; Notch1 mutation; Pediatric acute T lymphocytic leukemia; Clinical characteristics

急性T淋巴細(xì)胞白血?。ˋcute T lymphocytic leukemia，ALL）是一種起源于淋巴細(xì)胞的B系、T系細(xì)胞在骨髓內(nèi)異常增生的惡性腫瘤[1]。異常增生的原始細(xì)胞能在骨髓聚集并抑制正常造血功能，嚴(yán)重者可侵及骨髓外組織，影響患者健康、生活[2]。數(shù)據(jù)報道顯示[3]：ALL好發(fā)于0～9歲兒童，占兒童白血病的70.0%以上，且臨床上根據(jù)ALL不同生物學(xué)特征制定相應(yīng)的治療方案能獲得良好的效果，80.0%兒童及30.0%成人能獲得長期無病生存，亦具有治愈可能。Notch1信號通路異常在ALL中發(fā)生率為50.0%以上，多發(fā)生在HD區(qū)（異二聚體結(jié)構(gòu)域）和PEST結(jié)構(gòu)域[富含脯氨酸（Proline-rich，P）及谷氨酰胺（Glutamine，E）中[4]]。臨床研究表明[5]：Notch1信號通路異常激活的另一個重要機制為IDH1-R123發(fā)生突變，導(dǎo)致Notch1信號泛素連接酶介導(dǎo)的降解受到抑制。而IDH1-R123突變主要發(fā)生在WD40結(jié)構(gòu)域。IDH1-R123與Notch1信號通路突變可能對ALL兒童預(yù)后產(chǎn)生影響，但是具體機制尚未明確[6]。因此，本研究以兒童ALL患者作為對象，探討IDH1-R123與Notch1雙突變在兒童ALL中的作用及機制，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2016年5月～2017年12月麗水市人民醫(yī)院兒童ALL患者58例作為對象，男32例，女26例，年齡0～12歲，平均（6.39±1.57）歲;病程1～6個月，平均（3.23±0.59）個月。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）均符合兒童ALL診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]，均經(jīng)生化指標(biāo)、影像檢查最終確診者;（2）均能遵醫(yī)完成IDH1-R123與Notch1雙突變檢測，且患兒均可耐受;（3）給予誘導(dǎo)、鞏固及維持治療者。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并精神異常、自身免疫系統(tǒng)疾病或伴有器質(zhì)性疾病者;（2）合并精神異常、認(rèn)知功能障礙或伴有其他部位惡性腫瘤者[8]。本研究得到醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患兒家屬均簽署同意書。

1.2 儀器與設(shè)備

高速離心機（Thmorgan公司）、EDTAK2抗凝管（美國Becton Dickinson公司）、細(xì)胞計數(shù)器（美國Beckman coulter公司）、IDH1-R123;Notch1基因DNA試劑盒（美國GenElute公司）、生理鹽水（陜西濟(jì)生制藥有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 IDH1-R123與Notch1雙突變基因檢測 ?所有患者入院后均完成IDH1-R123與Notch1雙突變基因測序，確定IDH1-R123與Notch1雙突變在兒童急性T淋巴細(xì)胞白血病中的突變率及突變特征[9]。①標(biāo)本采集。入組兒童入院后次日早晨取骨髓標(biāo)本，完成單個核細(xì)胞的收集，并完成總DNA的提取。在無菌條件下，將兒童的骨髓放置在EDTAK2抗凝管中，采用生理鹽水進(jìn)行稀釋，并滴加到淋巴分離液中，20 min離心，速度7500 rpm，取中間白膜層即為單個核細(xì)胞[10];②檢測方法。取上述收集的單個核細(xì)胞并完成計數(shù)后，采用IDH1-R123;Notch1基因DNA試劑盒完成上述細(xì)胞總DNA的提取，并放置在-20℃冰箱中保存，完成IDH1-R123與Notch1雙突變基因測序，確定IDH1-R123與Notch1雙突變在兒童急性T淋巴細(xì)胞白血病中的突變率及突變特征[11]。

1.3.2 治療方法 ?入組患者均給予誘導(dǎo)、鞏固及維持治療。①誘導(dǎo)治療。所有兒童均采用VDCLP方案進(jìn)行誘導(dǎo)治療，具體治療方案如下：注射用硫酸長春地辛 （杭州民生藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H20057028，規(guī)格：1 mg）（第1、8、15及22天）3 mg/m2、柔紅霉素（山東新時代藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H20083726，規(guī)格：20 mg）（第1～3天、15～16天）40 mg/m2、環(huán)磷酰胺（山西普德藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H14023686，規(guī)格：0.2 g）（第1、15天）750 mg/m2、左旋門冬酰胺酶（北京雙鷺?biāo)帢I(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H20057369，規(guī)格5000 U）（第11、14、17、20、23及26天）6000 U/m2、潑尼松（浙江仙琚制藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H33021207，規(guī)格：5 mg）（第1～14天，15～28天藥物逐漸減停）;②鞏固強化治療。29例選擇CAM方案強化治療。環(huán)磷酰胺（山西普德藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H14023686，規(guī)格：0.2 g）（第1、8天）750 mg/m2，阿糖胞苷（國藥一心制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20055127，規(guī)格：100 mg）（第1～3天、8～11天）100 mg/m2、6-巰基嘌呤（陜西興邦藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H61021058，規(guī)格50 mg）（第1～7天）60 mg/m2;29例患者采用甲氨蝶呤+左旋門冬酰胺酶方案進(jìn)行治療。甲氨蝶呤（上海上藥信誼藥廠有限公司，國藥準(zhǔn)字H31020644，規(guī)格：2.5 mg）3 g/m2，維持靜滴24 h;左旋門冬酰胺酶（北京雙鷺?biāo)帢I(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H20057369，規(guī)格：5000U）（第3～4天）6000 U/m2;維持治療：所有兒童均給予6-巰基嘌呤+甲氨蝶呤治療。取6-巰基嘌呤（第1～7天）60 mg/m2;甲氨蝶呤（第1～8天）20 mg/m2，每30天為1個療程，6個月重復(fù)強化治療[12]。

1.4 觀察指標(biāo)

（1）生化指標(biāo)。兩組入院后取外周空腹靜脈血3 mL，35 min離心，離心速度3000 rpm，血清分離后采用全自動生化分析儀測定患兒WBC計數(shù)、平均血紅蛋白、平均血小板數(shù)[13];（2）兒童ALL IDH1-R123與Notch1雙突變特征。記錄ALL患兒IDH1-R123與Notch1雙突變特征。（3）ALL 兒童IDH1-R123、Notch1雙突變與預(yù)后關(guān)系。患兒治療后均完成24個月隨訪，記錄患兒6、12、18、24個月生存率。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS18.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行處理，計數(shù)資料用[n（%）]表示，采用χ2檢驗，計量資料用（x±s）表示，采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同突變患者生化指標(biāo)比較

58例兒童ALL患者中33例IDH1-R123與Notch1雙突變，突變率為56.90%;突變兒童血WBC計數(shù)、平均血紅蛋白高于非突變兒童（P<0.05）;突變兒童平均血小板數(shù)低于非突變兒童（P<0.05）。見表1。

2.2 ALL兒童IDH1-R123與Notch1雙突變特征

58例兒童ALL患者中IDH1-R123突變25例，占43.10%，突變位于WD40區(qū)域，且均為點突變;Notch1突變8例，占13.79%，突變位點主要位于HD區(qū)域和PEST結(jié)構(gòu)域。其中，HD突變5例，占62.50%，均為氨基酸位點為233;PEST結(jié)構(gòu)域3例，占37.50%。見圖1、2。

2.3 ALL兒童IDH1-R123、Notch1雙突變與預(yù)后的關(guān)系

突變兒童與非突變兒童6個月、12個月生存率無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;突變兒童18個月、24個月生存率低于非突變兒童（P<0.05）。見表2。

3 討論

ALL好發(fā)于兒童中，是指前體B、T或成熟B淋巴細(xì)胞發(fā)生克隆性異常增殖引起的惡性疾病[14-15]。ALL病因復(fù)雜，普遍認(rèn)為與遺傳、環(huán)境、病毒感染，免疫缺陷等因素有關(guān)，且不同因素能相互作用相互影響，導(dǎo)致患兒治療預(yù)后較差[16-17]。目前，臨床上對于ALL缺乏有效的治療方法，常用方法多以誘導(dǎo)、鞏固及維持治療為主，雖然能提高患者生存期，但是患兒預(yù)后受到的影響因素較多，不同因素能相互作用、相互影響[18]。目前，臨床上對于ALL的研究主要根據(jù)細(xì)胞遺傳學(xué)、分子遺傳學(xué)及表觀遺傳學(xué)對患者危險度進(jìn)行評估。細(xì)胞遺傳學(xué)指標(biāo)是指常規(guī)的染色體核型，能作為白血病的獨立預(yù)后因素[19-20]。近年來，隨著醫(yī)療技術(shù)及分子遺傳學(xué)的不斷發(fā)展，基因突變等指標(biāo)對染色體核型分組得到進(jìn)一步細(xì)化[21-22]。本研究中，58例兒童ALL患者中33例IDH1-R123與Notch1雙突變，突變率為56.90%;突變兒童血WBC計數(shù)、平均血紅蛋白高于非突變兒童（P<0.05）;突變兒童平均血小板數(shù)低于非突變兒童（P<0.05）;ALL IDH1-R123突變25例，占43.10%，突變位于WD40區(qū)域，且均為點突變;Notch1突變8例，占13.79%，突變位點主要位于HD區(qū)域和PEST結(jié)構(gòu)域。其中，HD突變5例，占62.50%，均為氨基酸位點為233;PEST結(jié)構(gòu)域3例，占37.50%，說明兒童ALL常伴有IDH1-R123與Notch1雙突變，能直接參與疾病的發(fā)生、發(fā)展，亦可對患兒預(yù)后產(chǎn)生影響。國外學(xué)者研究表明[23]：IDH1-R123與Notch1雙突變能預(yù)測患者預(yù)后，且雙突變患兒預(yù)后較差。國內(nèi)學(xué)者[24-25]以ALL患兒87例患者作為對象，結(jié)果表明：IDH1-R123與Notch1雙突變尚不能作為患兒不良預(yù)后的指標(biāo)，但是上述研究并未進(jìn)行對比單基因突變與雙基因突變對預(yù)后的影響。Notch1基因最初是在伴有t（7：9）（q34;q34.3）的ALL患者中發(fā)現(xiàn)，但是突變率較低。臨床研究表明：Notch1基因易位使TCRβ基因坐插入到Notch1基因中，引起Notch1大部分胞外區(qū)缺失，從而產(chǎn)生截斷的Notch1蛋白。IDH1-R123則具有組成性不依賴配基結(jié)合的活性，當(dāng)機體內(nèi)伴有IDH1-R123基因突變時，能為ALL的發(fā)生提供直接證據(jù)[26-27]。為了進(jìn)一步分析IDH1-R123與Notch1雙突變在兒童急性T淋巴細(xì)胞白血病中的作用機制，本研究中對入組的ALL兒童進(jìn)行24個月隨訪，結(jié)果表明：突變兒童與非突變兒童6個月、12個月生存率無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;突變兒童18個月、24個月生存率低于非突變兒童（P<0.05），說明ALL兒童IDH1-R123與Notch1雙突變遠(yuǎn)期預(yù)后較差，死亡率較高。因此，加強兒童ALL IDH1-R123與Notch1雙突變檢測能評估患兒的預(yù)后，指導(dǎo)臨床治療[28];同時，患兒治療過程中可加強其基因突變的測定，善于根據(jù)測定結(jié)果調(diào)整治療方案，使得患兒的臨床治療更具科學(xué)性[28，29]。

綜上所述，IDH1-R123與Notch1雙突變在兒童急性T淋巴細(xì)胞白血病中突變率較高，且與患者不良預(yù)后有關(guān)，有助于指導(dǎo)臨床診療。

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（收稿日期：2020-01-15）