趙健 林軍 周燕

[摘要] 目的 分析研究環(huán)氧合酶-2（COX-2）、人乳頭瘤病毒16型E6蛋白（HPV16-E6）在宮頸癌組織中的表達與病理特征間的關系。 方法 選取2017年11月～2019年11月46例初診宮頸癌患者和46例因婦科良性疾病手術或門診治療的患者作為研究對象，采用S-P法對COX-2、HPV16-E6蛋白在宮頸癌組織中的陽性表達進行檢測，采用陽性細胞百分比和染色強弱對指標進行評分。 結果 病理參數(shù)中年齡、病理類型、組織學分級、臨床分期和腫瘤直徑的COX-2陽性表達差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），肌層浸潤深度、宮旁或脈管浸潤、淋巴結是否轉移的COX-2陽性表達差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;病理參數(shù)中組織學分級、臨床分期、淋巴結是否轉移、腫瘤直徑和肌層浸潤深度的HPV16-E6蛋白陽性表達差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），而年齡、病理類型、宮旁或脈管浸潤高度的HPV16-E6蛋白陽性表達差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;COX-2與HPV16-E6蛋白在宮頸癌組織中表達呈顯著正相關關系，在宮頸慢性炎癥組織中表達呈顯著正相關關系。 結論 COX-2與HPV16-E6蛋白在宮頸癌侵襲、轉移過程中可發(fā)揮協(xié)同作用。

[關鍵詞] 宮頸癌;COX-2;HPV16-E6;表達;病理類型;組織學分級

[中圖分類號] R737.33? ? ? ? ? [文獻標識碼] B? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2020）18-0135-04

Expression and significance of COX-2 and HPV16-E6 proteins in the tissues of cervical cancer

ZHAO Jian1? ?LIN Jun1? ?ZHOU Yan2

1.Department of Pathology， Quzhou People's Hospital in Zhejiang Province， Quzhou? ?324000， China; 2.Department of Gynaecology， Quzhou People's Hospital in Zhejiang Province， Quzhou? ?324000， China

[Abstract] Objective To analyze and study the relationships between the expression of cyclooxygenase-2（COX-2） and human papillomavirus type 16 E6 protein（HPV16-E6） in cervical cancer tissues and their pathological characteristics. Methods From November 2017 to November 2019， 46 patients with newly diagnosed cervical cancer and 46 patients undergoing surgery or outpatient treatment for benign gynecological diseases were selected as the study subjects. The positive expressions of COX-2 and HPV16-E6 proteins in cervical cancer tissues were detected by the S-P method， and the indices were scored using the percentage of positive cells and the intensity of staining. Results There was no statistically significant difference in the positive expression of COX-2 in age， pathological type， histological grade， clinical stage and tumor diameter in pathological parameters（P>0.05），the difference between the positive expression of COX-2 and the depth of muscular invasion， parauterine or vascular invasion， and lymph node metastasis were statistically significant（P<0.05）. There was no statistically significant difference in the positive expression of HPV16-E6 protein in histological grade， clinical stage， lymph node metastasis， tumor diameter， and muscular infiltration depth（P>0.05）. The difference in the positive expression of HPV16-E6 protein of age， pathological type， parauterine or vascular infiltration height was statistically significant（P<0.05）. There was a significant positive correlation between the expressions of COX-2 and HPV16-E6 proteins in cervical cancer tissues， and there was a significant positive correlation in cervical inflammatory tissues. Conclusion COX-2 and HPV16-E6 proteins can play a synergistic role in the invasion and metastasis of cervical cancer.

[Key words] Cervical cancer; COX-2; HPV16-E6; Expression; Pathological types; Histological grade

宮頸癌是一種臨床較為常見的惡性腫瘤，我國女性宮頸癌的發(fā)病率在惡性腫瘤中居首位，也是導致女性死亡的重要原因，對女性的健康產(chǎn)生嚴重威脅[1-2]。女性發(fā)生宮頸病變后，隨著病情發(fā)展會導致上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌，這期間的癌前病變和宮頸癌是可以預防和治療的，但關鍵是早期診斷。有研究指出，人乳頭瘤病毒（HPV），尤其是高危型HPV感染是導致宮頸癌和癌前病變的重要原因，若未受到該病毒感染則不會發(fā)生宮頸鱗癌[3-4]。人乳頭瘤病毒16型E6蛋白（HPV16-E6）失控和過表達在宮頸癌發(fā)病的過程中起到了重要作用[5-6]。但是大多數(shù)HPV感染在2年時間內(nèi)可以被清除，因此，不可忽視其他因子在宮頸癌發(fā)病中的協(xié)同作用。環(huán)氧合酶-2（COX-2）是一種與多種腫瘤發(fā)生和發(fā)展關系密切的酶，主要是通過抑制細胞凋亡、促進細胞黏附和移動、增加腫瘤細胞侵襲轉移能力以及促進生成新生血管等機制發(fā)揮致癌的作用[7-9]?；诖耍疚姆治鲅芯苛薈OX-2、HPV16-E6蛋白在宮頸癌組織中的表達與病理特征間的關系，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年11月～2019年11月在我院接受治療的46例宮頸癌患者，平均年齡（43.26±5.62）歲。其中腺癌、鱗癌、腺鱗癌和透明細胞癌分別為6例、36例、4例，根據(jù)FIGO標準將患者分為Ⅰ期26例、Ⅱ期18例和Ⅲ期2例，根據(jù)組織分化程度將患者分為G1 13例、G2 20例和G3 13例，年齡：45歲以下26例、45歲及以上20例;淋巴結有轉移22例、無轉移24例;腫瘤直徑：4 cm以下33例、4 cm及以上13例;有宮旁或脈管浸潤20例、無宮旁或脈管浸潤26例;淺肌層25例、深肌層21例。46例患者在本院治療前均未接受過放療和化療治療。此外，選擇由于婦科良性疾病在本院接受治療的同期46例患者，其中，宮頸組織正?；颊?2例、宮頸慢性炎癥患者14例、宮頸上皮內(nèi)瘤變患者10例，所有患者的病歷資料完整。

1.2 方法[10]

1.2.1 病理參數(shù)? COX-2和HPV16-E6蛋白相關病理參數(shù)均包括年齡、病理類型、組織學分級、臨床分期、淋巴結是否轉移、腫瘤直徑、宮旁或脈管浸潤、肌層浸潤深度。

1.2.2 實驗試劑? 本實驗所用試劑有：鼠抗人HPV16-E6單克隆抗體、羊抗人COX-2多克隆抗體、DAB顯色試劑盒和S-P試劑盒、即用型羊S-P kate檢測試劑和即用型鼠S-P kate檢測試劑。

1.2.3 檢測方法? 本研究采用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶聯(lián)結免疫組化（S-P）法對COX-2、HPV16-E6蛋白在宮頸癌組織中的陽性表達進行檢測。該檢測方法主要是將生物素標記的第二抗體、鏈霉菌抗生物素蛋白連接的過氧化物酶與基質(zhì)素相混合，利用此混合液測定細胞、組織中抗原。具體步驟為：將組織芯片于室溫放置60 min，再用二甲苯浸泡20 min;無水乙醇水化2 min;PBS沖洗3次，每次5 min;80%甲醇孵育10 min，保證滅活內(nèi)源性過氧化物酶活性;PBS沖洗3次，每次5 min;置0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液中95℃ 20 min，自然冷卻30 min;PBS沖洗3次，每次5 min;低價正常血清封閉液，室溫孵育20 min;滴加50 μL Ⅰ抗，室溫靜置1 h;PBS沖洗3次，每次5 min;滴加40 μL Ⅱ抗，室溫靜置1 h;PBS沖洗3次，每次5 min;滴加SP，室溫孵育30 min;DAB顯色10 min，顯微鏡下掌握染色程度;自來是沖洗10 min終止反應;復染2 min，鹽酸酒精分化;自來是沖洗10 min;常規(guī)脫水、透明、封片和鏡檢。本實驗在操作過程中嚴格按照S-P染色試劑盒相關說明進行。

1.3 免疫組化結果判斷標準[11]

1.3.1 評分標準? 采用陽性細胞百分比和染色強弱對指標進行評分，評分公式為：IHS=a×b。a和b分別代表陽性細胞百分比和陽性細胞染色強弱。當a取值為0時，為無陽性細胞;當a取值為1時，為陽性細胞介于1%～10%;當a為2時，代表陽性細胞介于11%～50%;當a為3時，則陽性細胞介于51%～80%;當a為4時，則陽性細胞超過80%。當b為0時，則為陰性;當b為1時，則為弱陽性;當b為2時，則為中度陽性;當b為3時，則為強陽性。用（-）、（+）、（++）、（+++）分別對應評分結果0分、1～4分、5～8分、9～12分。

1.3.2 陽性判定標準? 胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒即為COX-2陽性細胞，而HPV16-E6蛋白陽性細胞則是根據(jù)細胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒來判定，同時胞漿中也會出現(xiàn)部分。利用IHS評價所有切片，統(tǒng)計得分。以上所有批次的染色同時設立對照，同時一抗選擇PBS液代替，為陰性空白對照。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS18.0統(tǒng)計學軟件對研究涉及數(shù)據(jù)資料進行處理，并采用Spearman等級相關法對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析;計量資料以（x±s）表示，采用t檢驗;計數(shù)資料用[n（%）]表示，采用χ2檢驗;P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 COX-2的陽性率以及與病理參數(shù)關系

參數(shù)中的年齡、病理類型、組織學分級、臨床分期和腫瘤直徑COX-2陽性表達差異無統(tǒng)計學意義，而肌層浸潤深度、宮旁或脈管浸潤和淋巴結是否轉移COX-2陽性表達差異有統(tǒng)計學意義。見表1。

2.2 HPV16-E6蛋白與相關參數(shù)關系

研究表明，病理參數(shù)中組織學分級、臨床分期、淋巴結是否轉移、腫瘤直徑和肌層浸潤深度的HPV16-E6蛋白陽性表達差異無統(tǒng)計學意義，年齡、病理類型、宮旁或脈管浸潤高度的HPV16-E6蛋白陽性表達差異有統(tǒng)計學意義。見表2。

2.3 COX-2與HPV16-E6蛋白的相關性

研究顯示，COX-2與HPV16-E6蛋白有正相關關系。見表3。

2.4 COX-2與HPV16-E6蛋白在宮頸慢性炎癥組織中表達的相關性

研究顯示，COX-2與HPV16-E6蛋白在宮頸慢性炎癥組織中表達呈顯著正相關關系。見表4。

3 討論

人乳頭瘤病毒是無包膜的DNA病毒，屬于乳多空病毒科，其種屬的特異性和嗜上皮性較為嚴格[12]。研究者在1972年首次提出人乳頭瘤病毒感染可引發(fā)宮頸癌。目前，已有眾多研究結果證實人乳頭瘤病毒感染可以誘發(fā)多種惡性腫瘤，這其中就包括宮頸癌[13-14]。本研究結果顯示，病理參數(shù)中組織學分級、臨床分期、淋巴結是否轉移、腫瘤直徑和肌層浸潤深度的HPV16-E6蛋白陽性表達差異無統(tǒng)計學意義，年齡、病理類型、宮旁或脈管浸潤高度的HPV16-E6蛋白陽性表達差異有統(tǒng)計學意義。有研究指出，年齡40歲以上人群是人乳頭瘤病毒高危型的主要感染對象，基本上不可能自然緩解，且與宮頸癌之間具有密切的關系[15-16]。本研究結果與以上研究的結論完全一致。有研究指出，宮頸腺癌主要與HPV18相關，宮頸鱗癌主要是由HPV16感染所致[17-18]，這與本研究結果顯示的HPV16-E6蛋白在鱗癌中的表達較高，而在腺癌、腺鱗癌和透明細胞癌中的表達較低相一致。近年來，有研究者指出，HPV16-E6蛋白發(fā)生變異具有宮頸癌患病的風險[19]。HPV16-E6蛋白可以一定程度上激活端粒酶，也是轉化為宮頸癌的一個非常重要的步驟，隨著宮頸癌病情的進展其陽性表達率會隨著不斷升高，兩者之間呈現(xiàn)出顯著的正相關[20]。還有研究表明，宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展對血管具有明顯的依賴，VEGF-C可以在多種腫瘤細胞中表達，可以誘導生成淋巴管和血管，從而促進腫瘤的侵襲[21]。

COX-2只有在較少的組織中表達，但是當受到炎癥性因子、細胞因子和內(nèi)毒素等刺激時，其表達可快速增加，甚至會超過50倍。有研究者指出，COX-2在口腔黏膜白斑、腸道息肉和宮頸黏膜等癌前病變以及食管癌、胃癌、乳腺癌、皮膚癌等多種惡性腫瘤中的表達明顯增加[4]。COX-2在腫瘤細胞內(nèi)的表達水平與腫瘤組織的血管內(nèi)皮生長因子-C mRNA含量呈顯著正相關。有研究者對COX-2 mRNA相對含量與子宮內(nèi)膜癌的生物學關系進行了研究，結果顯示，COX-2 mRNA在子宮內(nèi)膜癌深肌層浸潤中的含量較為明顯升高，這可以在一定程度上說明COX-2 與腫瘤細胞的浸潤具有一定的關系[5]。本研究結果也顯示，參數(shù)中肌層浸潤深度、宮旁或脈管浸潤和淋巴結是否轉移的COX-2陽性表達差異有統(tǒng)計學意義，這與以上結果相一致。

本研究結果表明，病理參數(shù)中的年齡、病理類型、組織學分級、臨床分期和腫瘤直徑的COX-2陽性表達差異無統(tǒng)計學意義，肌層浸潤深度、宮旁或脈管浸潤、淋巴結是否轉移的COX-2陽性表達差異有統(tǒng)計學意義;病理參數(shù)中的組織學分級、臨床分期、淋巴結是否轉移、腫瘤直徑和肌層浸潤深度的HPV16-E6蛋白陽性表達差異無統(tǒng)計學意義，而年齡、病理類型、宮旁或脈管浸潤高度的HPV16-E6蛋白陽性表達差異有統(tǒng)計學意義;COX-2與HPV16-E6蛋白在宮頸癌組織中表達呈顯著正相關關系，在宮頸慢性炎癥組織中表達呈顯著正相關關系。

綜上所述，COX-2與HPV16-E6蛋白在宮頸癌侵襲、轉移過程中可發(fā)揮協(xié)同作用。

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（收稿日期：2020-04-27）