王 玲，楊心悅，劉 珂，陳明晰，徐新花

(鄭州師范學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，河南 鄭州 450044)

瑞香素，又稱祖師麻甲素，具有鎮(zhèn)痛、抗菌、抗癌、抗炎及抗氧化等作用[1-2]，是中草藥祖師麻的活性指標(biāo)成分。建立靈敏檢測(cè)瑞香素的方法，不僅可以監(jiān)控中草藥產(chǎn)品質(zhì)量，而且對(duì)于研究其藥理活性具有一定的指導(dǎo)價(jià)值。目前檢測(cè)瑞香素的方法主要有液相色譜法和熒光法[3-5]。與以上分析方法相比，電化學(xué)傳感技術(shù)具有儀器價(jià)格低廉、操作簡(jiǎn)便及靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。目前利用電化學(xué)傳感器對(duì)瑞香素進(jìn)行檢測(cè)的方法較少[6-7]，因此，建立一種靈敏度高、選擇性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便的測(cè)定瑞香素的電化學(xué)傳感新方法仍具有重要意義。

石墨烯自2004年被英國(guó)物理學(xué)家Andre Geim和Konstantin Novoselov發(fā)現(xiàn)后,引起科學(xué)工作者的密切關(guān)注和廣泛的研究興趣，基于石墨烯納米材料構(gòu)筑的電化學(xué)傳感也得到了廣泛應(yīng)用[8]。目前，石墨烯制備仍有需要解決的問(wèn)題，如完整的石墨烯片層之間存在較強(qiáng)的范德華力，易發(fā)生不可逆聚集，導(dǎo)致有效比表面積遠(yuǎn)低于理論比表面積。在電化學(xué)傳感器分析中，石墨烯的優(yōu)異性能只有在單層下才能充分發(fā)揮[9]。另外，還原氧化石墨烯中常用的還原劑水合肼屬于劇毒性物質(zhì)。而三維還原氧化石墨烯(3D-rGO)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)有利于阻止石墨烯片層之間的聚集堆疊，不僅具備二維石墨烯的固有特性，而且具有多孔形貌、高吸附性能、高導(dǎo)電性及更強(qiáng)的可塑性等優(yōu)點(diǎn)[10]。Mohamed等[11]利用腺嘌呤作為功能化試劑，通過(guò)冷凍、干燥氧化石墨烯溶液等步驟制備了腺嘌呤功能化的3D海綿狀石墨烯，實(shí)現(xiàn)了對(duì)可待因的靈敏檢測(cè)。聚苯乙烯磺酸鈉(PSS)是一個(gè)具有大π共軛結(jié)構(gòu)的高聚物分子，可與石墨烯片層發(fā)生π-π相互作用達(dá)到抑制石墨烯聚集的目的。

本研究以PSS為功能化試劑，抗壞血酸為還原劑，通過(guò)冷凍、干燥、高壓反應(yīng)制備了3D海綿狀石墨烯(3D-PSS-rGO)。構(gòu)建了基于3D-PSS-rGO復(fù)合材料修飾電極測(cè)定瑞香素的電化學(xué)傳感，實(shí)現(xiàn)了對(duì)祖師麻粉中瑞香素的靈敏檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

天然石墨粉(200 mesh，Alfa Aesar)；聚苯乙烯磺酸鈉(PSS，阿拉丁試劑有限公司)；瑞香素(98%，上海源葉生物科技有限公司)；抗壞血酸(99%，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)。祖師麻粉(中藥材市場(chǎng))。0.1 mol/L PBS緩沖溶液用0.1 mol/L NaH2PO4-Na2HPO4(含有0.1 mol/L KCl)配制，并用NaOH或H3PO4調(diào)節(jié)pH值。其它試劑均為分析純，使用時(shí)未經(jīng)進(jìn)一步提純。實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水，且所有實(shí)驗(yàn)均在室溫下進(jìn)行。

T6紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司)。FD-1C-50冷凍干燥器(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)。RST5000電化學(xué)工作站(蘇州瑞斯特儀器有限公司)，配備傳統(tǒng)三電極體系：鉑柱為對(duì)電極，甘汞為參比電極，玻碳電極(GCE，直徑3 mm)或修飾電極為工作電極。pHS-3C型精密pH測(cè)定儀(上海雷磁儀器有限公司)。H1650高速臺(tái)式離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)。

1.2 PSS功能化海綿狀石墨烯復(fù)合材料(3D-PSS-rGO)的合成

氧化石墨烯(GO)的合成采用改良的Hummer方法[12]。制備的氧化石墨烯依次用5%鹽酸和H2O2洗滌至中性，在-53 ℃、10 Pa冷凍干燥得海綿狀氧化石墨烯(SGO)。 取50 mg SGO至50 mL H2O中，超聲分散均勻后，加入500 mg PSS；繼續(xù)超聲60 min后，加入250 mg抗壞血酸，然后轉(zhuǎn)移至100 mL高壓反應(yīng)釜中，170 ℃反應(yīng)8 h得黑色懸浮液[11]，反復(fù)離心和洗滌3次得3D-PSS-rGO。

1.3 3D-PSS-rGO修飾電極(3D-PSS-rGO/GCE)的制備

玻碳電極用0.03 μm Al2O3拋光打磨后分別在乙醇和水中超聲清洗干凈。處理好的電極吹干后，將上述制得的10 μL 0.5 mg/mL的3D-PSS-rGO材料滴涂至電極表面，得3D-PSS-rGO/GCE。

1.4 樣品預(yù)處理

稱取1.0 g祖師麻粉，加入20 mL甲醇，超聲3 h后倒出提取液，繼續(xù)將提取液加熱濃縮至2 mL，用修飾電極檢測(cè)提取液中瑞香素成分的含量。重復(fù)上述操作，直至提取液不顯示瑞香素的電化學(xué)響應(yīng)。將上述所有的提取液收集至離心管中，100 00 rpm離心30 min，吸取上清液至10 mL容量瓶中，甲醇定容，待測(cè)。

1.5 測(cè)定方法

三電極體系置于含有一定量瑞香素標(biāo)準(zhǔn)溶液的PBS緩沖溶液中，攪拌富集12 min后，在0.1～0.8 V范圍內(nèi)，以100 mV·s-1的速率進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，研究瑞香素在電極表面的電化學(xué)行為；采用線性掃描伏安法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 3D-PSS-rGO復(fù)合材料的表征

圖2 GCE在10.0 μmol/L瑞香素(a)，3D-PSS-rGO/GCE在空白溶液(b)和10.0 μmol/L瑞香素(c)中的循環(huán)伏安曲線Fig.2 Cyclic voltammograms of GCE in 10.0 μmol/L daphnetin(a),3D-PSS-rGO/GCE in blank solution(b) and 10.0 μmol/L daphnetin(c)

圖3 不同掃速下，3D-PSS-rGO/GCE在 10.0 μmol/L瑞香素溶液中的循環(huán)伏安曲線Fig.3 Cyclic voltammograms of 3D-PSS-rGO/GCE in 10.0 μmol/L daphnetin at different scan ratesscan rate(a→j):0.08,0.1,0.12,0.15,0.2,0.25,0.3 V/s

2.2 瑞香素在3D-PSS-rGO/GCE 上的電化學(xué)行為和反應(yīng)機(jī)理

在pH為2.0的PBS緩沖溶液中，考察了GCE 和3D-PSS-rGO/GCE電極對(duì)10.0 μmol/L瑞香素響應(yīng)的循環(huán)伏安圖，結(jié)果如圖2所示。從圖2可以看出，瑞香素在GCE(圖2a)上有弱電化學(xué)響應(yīng)(Ipa=1.1 μA,Ipc=0.24 μA)。3D-PSS-rGO/GCE在空白溶液(圖2b)中無(wú)明顯伏安響應(yīng)，但在瑞香素溶液(圖2c)中，其峰電流強(qiáng)度明顯增大(Ipa=118 μA，Ipc=78.1 μA)，且3D-PSS-rGO/GCE的電化學(xué)響應(yīng)信號(hào)約為GCE的100倍。3D-PSS-rGO對(duì)瑞香素顯示優(yōu)異的電催化活性可能有兩方面原因：一是3D-PSS-rGO的良好電子傳導(dǎo)性能；二是3D-PSS-rGO的褶皺多孔結(jié)構(gòu)可能對(duì)瑞香素有強(qiáng)富集作用，提高了瑞香素在電極表面的吸附量。

為了考察3D-PSS-rGO/GCE電極對(duì)瑞香素的吸附富集情況，研究了瑞香素的電極反應(yīng)機(jī)理。圖3為不同掃描速率(0.08～0.3 V·s-1)時(shí)，3D-PSS-rGO/GCE對(duì)瑞香素電化學(xué)響應(yīng)的循環(huán)伏安曲線。可觀察到，隨著掃描速率(v)的增大，氧化峰電位(Epa)正移，還原峰電位(Epc)負(fù)移，說(shuō)明瑞香素在該修飾電極上的動(dòng)力學(xué)反應(yīng)是準(zhǔn)可逆過(guò)程。E與lnv的關(guān)系為：Epa(V)=0.60+0.022lnv(V·s-1)(r2=0.988 0)，Epc(V)=0.46-0.024lnv(V·s-1)(r2=0.991 2)。根據(jù)Laviron[17]理論:

(1)

(2)

圖4 3D-PSS-rGO/GCE在空白溶液(a)和在200.0 μmol/L瑞香素溶液(b)中的計(jì)時(shí)電量圖Fig.4 Chronocoulometric response curves obtained at 3D-PSS-rGO/GCE in blank(a) and 200.0 μmol/L daphnetin solution(b)insert:relationship of charge Q vs.t1/2

式中，α為電子轉(zhuǎn)移系數(shù)，n為電子轉(zhuǎn)移數(shù)，F(xiàn)為法拉第常數(shù)，R為8.314 J/(mol·K),T為298 K。計(jì)算得到電子轉(zhuǎn)移數(shù)n≈2。

進(jìn)一步考察了電流強(qiáng)度與掃描速率的關(guān)系。發(fā)現(xiàn)在0.08～0.3 V/s范圍內(nèi)，Ipa及Ipc均隨著掃描速率的增大而逐漸增加：Ipa(μA)=519.7v(V·s-1)+60.3(r2=0.982 6)，Ipc(μA)=394.2v(V·s-1)+25.3(r2=0.986 2)；同時(shí)，Ipa(μA)=436.4v1/2(V·s-1)-26.9(r2=997 8)，Ipc(μA)=326.4v1/2(V·s-1)-38.9(r2=0.973 3)。表明I與v及v1/2均呈線性關(guān)系，判斷瑞香素在3D-PSS-rGO/GCE上是由吸附和擴(kuò)散共同控制的電極反應(yīng)過(guò)程[18-19]。

對(duì)于吸附和擴(kuò)散共同控制的電極反應(yīng)過(guò)程，可采用計(jì)時(shí)電量法獲得瑞香素在3D-PSS-rGO/GCE表面的飽和吸附量。首先作出3D-PSS-rGO/GCE在含1.0 mmol/L K3Fe(CN)6和0.1 mol/L KCl溶液中的計(jì)時(shí)電量曲線。根據(jù)Anson公式[20]求得3D-PSS-rGO/GCE的有效電極面積為0.14 cm2，同樣條件下求得GCE的有效電極面積為0.065 cm2。以上數(shù)據(jù)表明3D-PSS-rGO的加入增大了電極有效面積，有利于吸附富集更多的被測(cè)物分子，從而為提高檢測(cè)靈敏度提供了可能。圖4為3D-PSS-rGO/GCE在空白溶液(曲線a)和瑞香素溶液(曲線b)中的計(jì)時(shí)電量曲線(Q-t)。以Q對(duì)t1/2作圖，對(duì)應(yīng)結(jié)果如圖4插圖，回歸方程分別為：Q(C)=8.98×10-5+2.60×10-5t1/2(r2=0.997 0，斜線a)，Q(C)=2.77×10-4+5.54 ×10-5t1/2(r2=0.998 2，斜線b)。其中，斜線b的斜率為a的2倍，進(jìn)一步證實(shí)了瑞香素在3D-PSS-rGO/GCE上的電極反應(yīng)是由吸附和擴(kuò)散共同控制的過(guò)程[18-19]。

根據(jù)Anson[20]飽和吸附量公式：

(3)

Qdl為雙電層電量；Qads為吸附的瑞香素產(chǎn)生的法拉第電量，即Q-t1/2關(guān)系中a、b兩斜線的截距差(Qads=1.87×10-4C)；n為電子轉(zhuǎn)移數(shù)，F(xiàn)為法拉第常數(shù)，A為電極面積，c為被測(cè)物濃度，D為擴(kuò)散系數(shù)，t為時(shí)間。再根據(jù)Laviron吸附公式Q=nFAΓ*，計(jì)算出瑞香素在3D-PSS-rGO/GCE上的飽和吸附量(Γ*)為6.9×10-9mol/cm2。同樣實(shí)驗(yàn)條件下，瑞香素在裸電極上的飽和吸附量為1.8×10-10mol/cm2。以上數(shù)據(jù)表明3D-PSS-rGO對(duì)瑞香素具有較強(qiáng)吸附富集能力，從而可產(chǎn)生更強(qiáng)的電化學(xué)響應(yīng)信號(hào)。

2.3 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

圖5 不同pH時(shí)，10.0 μmol/L瑞香素在3D-PSS-rGO/GCE上的循環(huán)伏安圖Fig.5 Cyclic voltammograms of 3D-PSS-rGO/GCE in10.0 μmol/L daphnetin at different pH values

2.3.1 介質(zhì)酸度的選擇介質(zhì)酸度是影響電極反應(yīng)的重要因素之一。從圖5可以看出，當(dāng)支持電解質(zhì)的pH值從1.0逐漸增至8.0時(shí)，瑞香素的氧化還原峰電位均逐漸負(fù)向移動(dòng)，說(shuō)明質(zhì)子參與了瑞香素的電極反應(yīng)過(guò)程。氧化還原峰電位與pH關(guān)系為：Epa(V)=0.69-0.058 pH(r2=0.977 5)，Epc(V)=0.62-0.062 pH(r2=0.996 5)。關(guān)系曲線的斜率與理論值0.059 V·pH-1接近，表明瑞香素在3D-PSS-rGO/GCE上的電極反應(yīng)過(guò)程中質(zhì)子數(shù)與電子數(shù)相等，即為2電子2質(zhì)子的電極反應(yīng)過(guò)程。此外，當(dāng)pH值在1.0～3.0范圍時(shí)，瑞香素的氧化還原峰電流較大且較穩(wěn)定，此后，電流強(qiáng)度隨著pH值的增大逐漸降低。這是由于pH值較大，且大于瑞香素pKa時(shí)，瑞香素主要以陰離子形式存在，與負(fù)電性3D-PSS-rGO材料之間存在靜電斥力，抑制了瑞香素在電極表面的吸附富集，因此峰電流較小。反之，瑞香素與修飾材料之間靜電吸引作用有利于增大瑞香素在修飾電極表面的吸附量，提高測(cè)定靈敏度。因此，實(shí)驗(yàn)選擇pH 2.0作為測(cè)定瑞香素的最佳酸度值。

圖6 不同濃度瑞香素在3D-PSS-rGO/GCE上的LSV響應(yīng)曲線Fig.6 LSV curves of different concentrations daphnetin at 3D-PSS-rGO/GCEcdaphnetin(a→k):0.08,0.4,0.6,0.8,1.0,4.0,8.0,10.0,20.0,40.0,60.0 μmol/L;insert:the calibration curve of I vs.c

2.3.2 富集時(shí)間的選擇對(duì)于吸附參與的電極反應(yīng)過(guò)程，預(yù)富集有利于提高測(cè)定的靈敏度。實(shí)驗(yàn)考察了富集時(shí)間對(duì)瑞香素在3D-PSS-rGO/GCE修飾電極表面電化學(xué)響應(yīng)的影響。結(jié)果顯示，隨著富集時(shí)間的增加，電流強(qiáng)度逐漸增大，10 min后趨于平穩(wěn)，表明此時(shí)瑞香素在電極表面已吸附飽和。實(shí)驗(yàn)最終選擇12 min作為最佳富集時(shí)間。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線

在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，利用線性掃描伏安法(LSV)研究了瑞香素氧化峰電流與濃度之間的關(guān)系。由圖6可以看出，隨著瑞香素溶液濃度增大，氧化峰電流逐漸增大。在0.08～10.0 μmol/L和10.0～60.0 μmol/L范圍內(nèi)，峰電流與濃度呈良好線性關(guān)系，回歸方程分別為Ipa(μA)=12.53c(μmol·L-1)+2.900(r2=0.997 7)，Ipa(μA)=1.300c(μmol·L-1)+119.6(r2=0.985 5)，檢出限為0.04 μmol/L。該方法的靈敏度與已報(bào)道的電化學(xué)分析方法相當(dāng)[6-7]，但該方法具有制備過(guò)程簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性好、線性范圍寬的優(yōu)點(diǎn)。

2.5 重現(xiàn)性與選擇性

同樣方法分別構(gòu)筑了5支修飾電極，研究了它們對(duì)50.0 μmol/L瑞香素溶液的響應(yīng)情況，其峰電流響應(yīng)值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為5.4%，表明該修飾電極具有較好的重現(xiàn)性。

2.6 實(shí)際樣品的分析

為了檢驗(yàn)所構(gòu)筑方法的適用性，利用3D-PSS-rGO/GCE測(cè)定祖師麻粉中瑞香素的含量。祖師麻粉樣品的前處理方法參照“1.4”。取0.5 mL祖師麻粉提取液加入4.5 mL PBS緩沖溶液中，富集后進(jìn)行線性掃描伏安測(cè)定，測(cè)得該介質(zhì)中瑞香素濃度為6.1 μmol/L，計(jì)算得祖師麻粉中瑞香素含量為0.11 mg/g。采用標(biāo)準(zhǔn)加入法分別加入1.00、5.00、10.0 μmol/L瑞香素標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)(n=3)，結(jié)果見(jiàn)表1。測(cè)得回收率為90.0%～96.0%；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為4.8%、4.3%、4.5%。進(jìn)一步用高效液相色譜法驗(yàn)證該方法的可行性，測(cè)得回收率為94.0%～98.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于3.1%。3D-PSS-rGO/GCE測(cè)定祖師麻粉中瑞香素含量與高效液相色譜法基本一致。該傳感可以用于祖師麻粉中瑞香素含量的檢測(cè)。

表1 祖師麻粉中瑞香素的測(cè)定Table 1 Determination of daphnetin in girald daphne bark(n=3)

3 結(jié) 論

本研究采用綠色環(huán)保、簡(jiǎn)單易行的方法合成了3D-PSS-rGO?；?D-PSS-rGO優(yōu)異的導(dǎo)電性能及強(qiáng)吸附富集作用，制備的3D-PSS-rGO/GCE對(duì)瑞香素具有明顯的電催化活性。在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，瑞香素濃度在0.08～10.0 μmol/L和10.0～60.0 μmol/L范圍內(nèi)，氧化峰電流與其濃度呈良好線性關(guān)系，檢出限為0.04 μmol/L。本文構(gòu)筑的電化學(xué)傳感法操作簡(jiǎn)便、線性范圍寬、靈敏度高，可實(shí)現(xiàn)對(duì)祖師麻粉中瑞香素的靈敏測(cè)定。