賀然，胥輝豪，朱慧媛

（西南大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，重慶 榮昌 402460）

板層角膜移植術(shù)是臨床上常用的角膜移植術(shù)之一，而深板層角膜移植術(shù)（DLK）對(duì)于病灶較深且藥物難以控制的角膜疾病更具有重要意義。DLK是一種完全去除病變角膜基質(zhì)層組織，直至后彈力層暴露，再移植供體角膜組織的手術(shù)方法［1-2］。目前有多種DLK 手術(shù)方法，其中大泡技術(shù)在人醫(yī)臨床中的應(yīng)用最為廣泛。大泡技術(shù)通過(guò)向角膜基質(zhì)內(nèi)注射一定量的無(wú)菌空氣后將后彈力層與基質(zhì)層進(jìn)行鈍性分離，這不但可以最大程度地切削感染和病變的角膜基質(zhì)［3］，而且還有效地解決了傳統(tǒng)DLK 中暴露光滑的后彈力層及其破裂的問(wèn)題，避免了各種風(fēng)險(xiǎn)和排斥反應(yīng)。國(guó)內(nèi)目前尚未有關(guān)于大泡技術(shù)應(yīng)用于犬DLK 的研究及報(bào)道，因此本試驗(yàn)對(duì)該術(shù)式進(jìn)行了初步探討。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 隨機(jī)選擇身體健康、雙眼無(wú)病史的本地試驗(yàn)犬6 只及供體犬3 只，品種、性別不限，體重在10～15 kg 之間。編號(hào)分別為試驗(yàn)犬1、試驗(yàn)犬2、試驗(yàn)犬3、試驗(yàn)犬4、試驗(yàn)犬5、試驗(yàn)犬6，分別置于單獨(dú)的經(jīng)嚴(yán)格消毒的房間飼養(yǎng)，飼喂商品狗糧和飲水，每日兩次，定期驅(qū)蟲(chóng)，保持圈舍干凈和通風(fēng)，1個(gè)月后進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 角膜供體 角膜供體采用同種異體犬的新鮮角膜組織。

1.3 主要器材與設(shè)備 麻醉咽喉鏡、眼科手術(shù)顯微鏡、眼科顯微手術(shù)器材、負(fù)壓環(huán)鉆、動(dòng)物專(zhuān)用眼壓計(jì)、動(dòng)物專(zhuān)用淚液試紙、熒光素鈉眼科檢測(cè)試紙、KOWA手持式裂隙燈、散光盤(pán)等。

1.4 主要藥品與試劑 妥布霉素滴眼液、妥布霉素地塞米松滴眼液、他克莫司滴眼液、熒光素鈉、20%甘露醇注射液、0.9%氯化鈉注射液、痛立定、聚維酮碘等。

1.5 方法

1.5.1 構(gòu)建犬高危角膜堿燒傷模型 試驗(yàn)犬均選擇左眼為術(shù)眼，右眼不做任何處理。按標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室操作配制1 mol/L 的NaOH 溶液，選擇直徑為6.0 mm的角膜環(huán)鉆孔制備濾紙片，浸泡于所制備的NaOH 溶液中備用。試驗(yàn)犬全身麻醉，右側(cè)臥保定，將濾紙片取出置于試驗(yàn)犬左眼的角膜中央處，給予堿燒傷60 s 后立即使用生理鹽水反復(fù)沖洗5 min。

造模后各試驗(yàn)犬皮下注射痛立定，4 mg/kg，佩戴伊麗莎白脖圈，防止其亂抓造成繼發(fā)性損傷，保持術(shù)眼清潔及周?chē)h(huán)境清潔衛(wèi)生，每日觀察術(shù)眼情況。造模后每日測(cè)量試驗(yàn)犬的淚液值1次，每日早、中、晚測(cè)量眼壓值共3次，造模后第1 d、3 d、5 d、7 d、9 d、11 d、13 d、15 d對(duì)試驗(yàn)犬術(shù)眼進(jìn)行熒光染色，觀察術(shù)眼角膜發(fā)展情況，并詳細(xì)記錄數(shù)據(jù)及拍照。當(dāng)角膜出現(xiàn)角膜深層實(shí)質(zhì)性水腫、潰瘍、渾濁呈瓷白色，瞳孔不可見(jiàn)時(shí)，視為造模成功。

1.5.2 術(shù)前準(zhǔn)備 手術(shù)前準(zhǔn)備常規(guī)手術(shù)室與手術(shù)器械，術(shù)前1 d 對(duì)各試驗(yàn)犬進(jìn)行常規(guī)局部抗菌素點(diǎn)眼，使用0.5%左氧氟沙星滴眼液滴眼，3次/d，每次1 滴，防止術(shù)中感染。術(shù)前試驗(yàn)犬禁食禁飲12 h，建立靜脈通道，術(shù)前15 min 對(duì)各試驗(yàn)犬皮下注射硫酸阿托品溶液（0.02 mg/kg），以抑制其呼吸道腺體分泌并穩(wěn)定心率，利于手術(shù)的進(jìn)行；使用丙泊酚注射液（4 mg/kg）靜脈注射誘導(dǎo)麻醉，隨后經(jīng)行氣管插管以建立呼吸通路，術(shù)中采用異氟烷吸入麻醉維持，并隨時(shí)監(jiān)測(cè)試驗(yàn)犬的心率、呼吸頻率、血氧以及血壓等生理指標(biāo)。

1.5.3 大泡技術(shù)輔助下的DLK

1.5.3.1 供體準(zhǔn)備 采用供體犬的新鮮角膜作為角膜供體：將3只健康的供體犬進(jìn)行眼球摘除術(shù)，用PBS 液沖洗供體犬的眼球30 min，隨后在手術(shù)顯微鏡下使用直徑7.25 mm的環(huán)鉆直接在供體犬的眼球上鉆切角膜移植片，鉆切深度約為角膜厚度的3/4，使用角膜板層刀對(duì)植片進(jìn)行剝離，再將剪下的植片內(nèi)皮面朝上置于無(wú)菌的培養(yǎng)皿內(nèi)，注入足量粘彈劑以保持濕潤(rùn)，新鮮備用。共6 份角膜移植片，分別用于6只試驗(yàn)犬左側(cè)術(shù)眼的移植。

1.5.3.2 植床準(zhǔn)備 試驗(yàn)犬右側(cè)臥保定，左側(cè)術(shù)眼朝上，真空負(fù)壓頭枕調(diào)整術(shù)犬頭部位置，5-0縫線固定試驗(yàn)犬術(shù)眼的上下直肌使得角膜水平朝上。定位試驗(yàn)犬眼睛的病變中心，使用7.0 mm負(fù)壓環(huán)鉆對(duì)角膜鉆切約300 μm的深度后，用角膜板層刀小心切除渾濁、潰瘍病變的角膜基質(zhì)層，然后采用30 號(hào)穿刺針，使針頭斜面向下，與角膜的頂點(diǎn)水平面呈10°～35°角度進(jìn)行穿刺，針頭緩慢推入后部角膜基質(zhì)，當(dāng)進(jìn)入后部角膜基質(zhì)后，快速注入無(wú)菌空氣約1 mL，待無(wú)菌空氣彌散，無(wú)菌空氣彌散的力量將角膜后彈力層與基質(zhì)層迅速分離，隨即可見(jiàn)其角膜基質(zhì)迅速變白，彌散后變?yōu)榛野咨?。如若在手術(shù)操作過(guò)程中一次穿刺的深度不足，可進(jìn)行反復(fù)注氣，直至角膜基質(zhì)與后彈力層之間分層并形成明顯的大氣泡。術(shù)者左手持0.12 mm顯微有齒鑷向上輕輕提拉術(shù)眼的角膜基質(zhì)，觀察并確定角膜基質(zhì)的下方有大氣泡的存在之后，右手持一次性45°角膜板層刀繼續(xù)向深層切削，將潰瘍病變的角膜基質(zhì)進(jìn)一步切除，直至角膜基質(zhì)由灰白色變?yōu)榘胪该鳡?，?dāng)完全切透時(shí)，無(wú)菌空氣便會(huì)迅速溢出，而后彈力層會(huì)貼附于后層的基質(zhì)，再緩慢逐層切除，至角膜基質(zhì)層下方的后彈力層暴露，形成一個(gè)光滑的剖切平面，此時(shí)植床制作完成。

1.5.3.3 縫合植片 將備用的供體角膜移植片取出，覆蓋于制作好的植床上并固定，采用10-0 尼龍縫線首先在12、6、3、9 點(diǎn)進(jìn)行縫合，然后在各自象限中均勻間斷縫合，共16 針，縫針全層貫穿整個(gè)植片厚度，縫合完畢后在散光盤(pán)下觀察術(shù)眼的角膜映光環(huán)，并根據(jù)其形狀來(lái)調(diào)整尼龍縫線的松緊程度，直至角膜映光環(huán)呈現(xiàn)出相對(duì)比較規(guī)則的圓形后，再采用顯微平鑷將線結(jié)旋轉(zhuǎn)入角膜植床的側(cè)層間，避免后彈力層被劃破，以減少術(shù)后一系列眼表刺激，并將角膜移植片壓入植床邊緣之下，使植床與角膜移植片對(duì)合相對(duì)緊密，或略低于植床面，這樣有利于角膜上皮的愈合。

1.5.4 術(shù)后觀察與治療 將各試驗(yàn)犬獨(dú)立飼養(yǎng)在安靜的房間內(nèi)，24 h佩戴伊麗莎白圈，觀察術(shù)眼的癥狀及恢復(fù)情況，根據(jù)術(shù)眼的發(fā)展情況調(diào)整使用局部藥物。術(shù)后使用痛立定用于緩解術(shù)后疼痛，局部滴妥布霉素滴眼液（托百士），6次/d，1滴/次；1 周后停用托百士，改滴妥布霉素地塞米松（典必殊），6 次/d，1 滴/次；術(shù)后2 周停用典必殊，改用他克莫司滴眼液，4 次/d，1 滴/次，持續(xù)使用，同時(shí)根據(jù)情況結(jié)合糖皮質(zhì)激素沖擊療法控制排斥反應(yīng)。

術(shù)后每日對(duì)術(shù)眼的分泌物情況進(jìn)行觀察，分別于術(shù)后第3 d、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d、49 d、56 d、63 d 時(shí)，根據(jù)眼表裂隙燈的觀察情況，對(duì)角膜的渾濁度情況、新生血管生長(zhǎng)情況、水腫情況及熒光素鈉染色情況進(jìn)行評(píng)分，并進(jìn)行眼內(nèi)壓測(cè)量和淚液量測(cè)量。

1.5.4.1 裂隙燈顯微鏡檢查 使用開(kāi)瞼器開(kāi)張術(shù)犬上下眼瞼，使術(shù)眼正對(duì)裂隙燈鏡頭，在8倍鏡視野下對(duì)其進(jìn)行觀察并拍照，同時(shí)對(duì)角膜的渾濁度、水腫、新生血管和熒光染色情況進(jìn)行記錄。參照Holland等［4］的方法對(duì)犬角膜新生血管、犬角膜水腫及犬角膜渾濁度進(jìn)行評(píng)分，這三項(xiàng)指標(biāo)的評(píng)分總和為角膜移植反應(yīng)指數(shù)（RI），當(dāng)RI≥5時(shí)，則說(shuō)明發(fā)生了排斥反應(yīng)。另外也可通過(guò)角膜熒光素鈉染色法來(lái)觀察角膜上皮的破損情況，以判斷試驗(yàn)犬角膜的恢復(fù)情況。

（1）犬角膜新生血管情況：根據(jù)表1 進(jìn)行計(jì)分。

表1 角膜新生血管的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

（2）犬角膜水腫情況：根據(jù)表2進(jìn)行計(jì)分。

表2 角膜水腫的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

表3 角膜渾濁度的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

（3）犬角膜渾濁度情況：根據(jù)表3進(jìn)行計(jì)分。

（4）犬角膜上皮缺損情況（熒光素鈉染色）：將各術(shù)犬的術(shù)眼角膜水平均分為上、中、下三個(gè)不同的區(qū)域，將熒光素鈉均勻涂布于角膜進(jìn)行染色，然后在裂隙燈鈷藍(lán)光下觀察這三個(gè)區(qū)域的染色情況，正常角膜不顯色而角膜異常者會(huì)顯色。根據(jù)表4 進(jìn)行記分，將三個(gè)區(qū)的得分相加得到總的染色評(píng)分，分值越高表明角膜生長(zhǎng)愈合情況越不良。

表4 角膜分區(qū)熒光素鈉染色的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.5.4.2 犬眼壓的測(cè)量 術(shù)后3 d、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d、49 d、56 d、63 d測(cè)量各試驗(yàn)犬的眼壓值。測(cè)量步驟如下：保定術(shù)犬的頭部，使其為站立位或坐立位，開(kāi)張上下眼瞼，暴露眼球，測(cè)量人員右手持回彈式眼壓計(jì)，進(jìn)行眼壓測(cè)量，根據(jù)眼壓計(jì)顯示的數(shù)據(jù)直接讀取，每次回彈6 次最終生成一個(gè)數(shù)值，取3 次數(shù)值的平均值為最終眼壓結(jié)果。犬眼壓正常范圍為15～25 mmHg。

1.5.4.3 犬淚液量的測(cè)量 術(shù)后3d、7d、14d、21d、28 d、35 d、42 d、49 d、56 d、63 d測(cè)量各試驗(yàn)犬的淚液值。測(cè)量步驟如下：

在術(shù)犬清醒狀態(tài)下，保定試驗(yàn)犬的頭部，使其為站立位或坐立位，將淚液試紙條放入下眼瞼中部到外側(cè)1/3 處的結(jié)膜囊內(nèi)，然后盡量保持犬頭部固定、可自由眨眼，1 min 后讀取并記錄試紙上被淚液浸染過(guò)的刻度值，即為淚液分泌量。淚液量若低于15 mm/min，視為異常。

2 結(jié)果

2.1 犬高危角膜堿燒傷模型觀察結(jié)果 造模前試驗(yàn)犬角膜正常，透明，虹膜紋理清晰可見(jiàn)，表面光滑；造模后第1 d，角膜可見(jiàn)邊界清晰的瓷白色病灶；造模后第5 d，術(shù)眼淚液量大，分泌物多，角膜開(kāi)始水腫，有潰瘍形成；造模第11 d，角膜渾濁和水腫情況進(jìn)一步加重，潰瘍進(jìn)一步發(fā)展；造模15 d后，角膜中心及邊緣開(kāi)始出現(xiàn)少許新生血管，犬角膜出現(xiàn)完全深層實(shí)質(zhì)水腫，潰瘍更為明顯，渾濁進(jìn)一步加重，瞳孔模糊，虹膜質(zhì)地、紋理不清等。角膜重度堿燒傷模型建立成功。隨后即行大泡技術(shù)輔助的深板層角膜移植術(shù)。

2.2 大泡技術(shù)輔助下的DLK 手術(shù)過(guò)程 如圖1所示：定位試驗(yàn)犬眼睛的病變中心后，采用7.0 mm 負(fù)壓環(huán)鉆對(duì)角膜鉆切，用角膜板層刀將前部病變的角膜基質(zhì)切除（圖1A、B）；然后使用30 號(hào)針頭，使其斜面向下，向角膜基質(zhì)內(nèi)刺入，并迅速注入無(wú)菌空氣，可以看到角膜基質(zhì)迅速?gòu)浬⒆優(yōu)榛野咨▓D1C、D）；然后在顯微有齒鑷的輔助下，用45°角膜板層刀繼續(xù)切除潰瘍病變的基質(zhì)（圖1E），直至變?yōu)橥该鳡?，后彈力層完全暴露，植床建立完成（圖1F）；將備好的供體角膜移植片取出覆蓋于建立好的植床上，使用10-0尼龍線進(jìn)行間斷結(jié)節(jié)縫合共16針（圖1G、H）。

2.3 術(shù)后犬角膜情況 術(shù)后一個(gè)月內(nèi)，犬術(shù)眼水腫，分泌物較多，邊緣模糊，角膜基質(zhì)較水腫，渾濁程度隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸減輕；術(shù)后42 d，角膜移植片稍渾濁，分泌物進(jìn)一步減少；術(shù)后63 d，角膜移植片恢復(fù)透明，并且與植床貼附良好。

2.4 裂隙燈顯微鏡檢查

2.4.1 角膜眼表評(píng)分 對(duì)犬角膜新生血管、犬角膜水腫及犬角膜渾濁度三個(gè)項(xiàng)目進(jìn)行評(píng)分并記錄，取6只試驗(yàn)犬的各項(xiàng)平均值進(jìn)行觀察分析，結(jié)果顯示：試驗(yàn)犬在術(shù)后一周內(nèi)角膜稍渾濁、水腫，一周后有所加重，且開(kāi)始長(zhǎng)出新生血管，發(fā)生了輕微的排斥反應(yīng)；42 d 后，角膜水腫程度、渾濁程度有所減輕，新生血管的生長(zhǎng)逐漸被抑制；此后角膜移植反應(yīng)指數(shù)＜5，說(shuō)明各試驗(yàn)犬角膜生長(zhǎng)愈合情況令人滿(mǎn)意，恢復(fù)良好。

2.4.2 試驗(yàn)犬角膜上皮缺損情況 對(duì)犬角膜進(jìn)行熒光素鈉染色后，對(duì)染色點(diǎn)的數(shù)量進(jìn)行評(píng)分，術(shù)后一個(gè)月內(nèi)，試驗(yàn)犬角膜的染色點(diǎn)較為散在，數(shù)量較多，總分處于較高水平。術(shù)后一個(gè)月后，染色點(diǎn)總體減少，染色總分逐漸降低，維持在較低水平，恢復(fù)較為良好。

6只試驗(yàn)犬角膜上皮缺損評(píng)分的平均值如圖2所示。

2.5 術(shù)后試驗(yàn)犬眼壓測(cè)量結(jié)果 術(shù)后對(duì)試驗(yàn)犬進(jìn)行眼內(nèi)壓測(cè)量，取6 只試驗(yàn)犬的平均值進(jìn)行觀察分析（如圖3）。術(shù)后21 d 內(nèi)，各犬眼壓維持在較低的狀態(tài)，總體呈上升趨勢(shì)；此后眼壓逐漸上升，術(shù)后21 d恢復(fù)到正常范圍內(nèi)。

圖1 大泡技術(shù)輔助下的深板層角膜移植術(shù)過(guò)程

圖2 術(shù)后試驗(yàn)犬角膜上皮缺損評(píng)分

圖3 術(shù)后試驗(yàn)犬眼壓測(cè)量結(jié)果

2.6 術(shù)后犬淚液量測(cè)量結(jié)果 取6 只試驗(yàn)犬的平均值進(jìn)行觀察分析（如圖4）。術(shù)后一周內(nèi)，淚液量持續(xù)降低，淚液量較少但仍在正常范圍內(nèi)。使用滴眼液后，淚液量明顯上升，持續(xù)使用，淚液量維持在較穩(wěn)定的狀態(tài)。

圖4 術(shù)后試驗(yàn)犬淚液量測(cè)量結(jié)果

3 討論

進(jìn)行大泡技術(shù)輔助下的DLK時(shí)應(yīng)注意，供體角膜的直徑應(yīng)比制作的植床的直徑大0.25～0.5 mm，保證覆蓋均勻，植片與植床對(duì)接縫合緊密。鉆切植床時(shí)，環(huán)鉆與角膜面要盡量保持垂直狀態(tài)，以保證鉆取的深度和角度達(dá)到理想要求，有利于術(shù)后愈合。在進(jìn)行無(wú)菌空氣注入形成大氣泡來(lái)分離后彈力層這一手術(shù)步驟時(shí)，術(shù)者應(yīng)掌握好穿刺的力度與角度，將穿刺針頭彎曲后再斜向下注入空氣，若針頭透過(guò)后彈力層進(jìn)入前房則手術(shù)失敗。在向角膜后部基質(zhì)注入無(wú)菌空氣的過(guò)程中，有少許小氣泡進(jìn)入前房，考慮氣體量較少，不影響手術(shù)過(guò)程以及術(shù)后的恢復(fù)，暫可不做處理，由其自行吸收消散。本試驗(yàn)中，6只試驗(yàn)犬都成功接受了大泡技術(shù)輔助下的DLK，術(shù)后犬角膜透明度恢復(fù)正常，證明了該術(shù)式的有效性。

術(shù)后21 d 內(nèi)試驗(yàn)犬的角膜反應(yīng)指數(shù)（RI）逐漸增大，稍微超出正常范圍，35 d 后逐漸下降，發(fā)生了輕微的移植排斥反應(yīng)，主要原因考慮為角膜的血管化使得異體抗原更容易呈遞給受體免疫系統(tǒng)［5］，此外術(shù)后上皮缺損會(huì)產(chǎn)生損傷性的炎癥反應(yīng)。每日對(duì)試驗(yàn)犬進(jìn)行眼壓值和淚液量的測(cè)量，結(jié)果眼壓穩(wěn)定在15～25 mmHg，淚液分泌量穩(wěn)定在18～22 mm/min，均處于正常范圍。這進(jìn)一步驗(yàn)證了大泡技術(shù)輔助下的DLK 對(duì)犬角膜損傷疾病的臨床療效較好。

綜上所述，大泡技術(shù)輔助下的DLK應(yīng)用于犬角膜潰瘍疾病的手術(shù)方法是可行的，且過(guò)程安全有效，臨床效果較佳，但相關(guān)細(xì)節(jié)仍可進(jìn)一步完善。該項(xiàng)技術(shù)可作為犬角膜潰瘍等角膜損傷性疾病的理想治療手段。