李偉慇

自噬是亞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生動態(tài)變化并經(jīng)溶酶體介導(dǎo)對細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和細(xì)胞器降解的過程。通過平衡細(xì)胞合成和分解代謝,自噬穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)環(huán)境,維持細(xì)胞存活。據(jù)有關(guān)研究,自噬于心肌缺血期和再灌注期起不同作用,缺血初期主要有保護(hù)作用,而再灌注期則做成細(xì)胞損傷而致死亡。40 多年前,就有關(guān)于缺血再灌注后自噬體誘導(dǎo)產(chǎn)生的報(bào)道［1］。模擬狀態(tài)一過性缺血再灌注可引起自噬泡增加。通過增強(qiáng)自噬作用,胎鼠心臟在無糖培養(yǎng)液中可長達(dá)4 h 無損傷。Decker 等［2］發(fā)現(xiàn),離體灌流兔心后再灌注能引起顯著的自噬作用及心功能的恢復(fù),而激起細(xì)胞修復(fù)過程。上述實(shí)驗(yàn)均證明急性心肌缺血過程中存在自噬,且自噬泡產(chǎn)生與之后心肌功能的恢復(fù)是互隨的。但另有研究指出,缺血再灌注過程中的自噬作用,有不利心肌細(xì)胞存活的作用,特別在再灌注過程中。通過3-MA 阻斷饑餓誘導(dǎo)的自噬在H9C2 轉(zhuǎn)化心肌細(xì)胞中,能夠降低細(xì)胞死亡［3］。因此本課題旨在探討自噬作用增強(qiáng)對缺氧引起的H9C2心肌細(xì)胞損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 電子天平為瑞士Mettler Toledo 生產(chǎn)的AL104 電子天平,超凈臺由蘇州凈化生產(chǎn),中型冷凍臺式離心機(jī)Universal 32R Hettich zentrifugen 來自德國Hettich,移液器為德國Eppendorf 制造。MTT：Costar 48孔細(xì)胞培養(yǎng)板采用美國CORNING-COSTAR,日本Sanyo細(xì)胞培養(yǎng)箱,酶標(biāo)儀為Labsystems Dragon 的Wellscan MK3 臺盼藍(lán)染色：Corning 細(xì)胞培養(yǎng)皿為美國Corning生產(chǎn),顯微鏡為日本Olympus CKX41-A32FL/PH 倒置顯微鏡。

1.1.2 藥品與試劑 DMEM 培養(yǎng)基與0.25%胰蛋白酶均為美國gibco 的產(chǎn)品,磷酸緩沖鹽溶液(PBS)為武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn),Rapamycin 購于美國Sigma。MTT：凱基生物生產(chǎn)的MTT 細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒KGA311。臺盼藍(lán)染色：曲利本蘭購自廣州瑞舒生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng) 待H9C2 心肌細(xì)胞密度接近90%進(jìn)行傳代：棄瓶中原液,用PBS 液清洗細(xì)胞表面2 次,加0.25%的胰蛋白酶消化液(含EDTA),令消化液恰好覆蓋細(xì)胞表面,入37℃CO2孵箱中消化1 min 左右,倒置于顯微鏡下見細(xì)胞成片收縮變圓、邊界清楚時(shí),即加入含10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)液終止消化,并反復(fù)輕輕吹打瓶底,使細(xì)胞脫壁,把細(xì)胞懸液移入離心管,1100 r/min 離心10 min,棄上清,加入含有10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。鏡下計(jì)數(shù),以1∶3 左右比例分裝接種于新培養(yǎng)瓶中,靜置于37℃的CO2孵育箱中。24 h 后可見細(xì)胞重新貼壁生長,換新鮮培養(yǎng)基以去除組織塊與死細(xì)胞。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 本次試驗(yàn)用H9C2 轉(zhuǎn)化心肌細(xì)胞來模擬乳鼠心肌細(xì)胞,造模：乳鼠心肌細(xì)胞。分為Con組(正常培養(yǎng)12 h),C-R1組(正常培養(yǎng)12 h+1 mM rapamycin),C-R10組(正常培養(yǎng)12 h+10 mM rapamycin),C-R100組(正常培養(yǎng)12 h+100 mM rapamycin),C-R1000組(正常培養(yǎng)12 h+1000 mM rapamycin),N組(缺氧12 h),N-R1組(缺氧12 h+1 mM rapamycin),N-R10組(缺 氧12 h+10 mM rapamycin),N-R100組(缺氧12 h+100 mM rapamycin),N-R1000組(缺氧12 h+1000 mM rapamycin)。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.3.1 MTT 在96 孔板加入細(xì)胞100 μl/孔(約1×104),置37℃ 5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。然后待細(xì)胞密度適合后將需要缺氧的96 孔板放進(jìn)1% O2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h。將5×MTT 用 Dilution Buffer 稀釋成1×MTT。每孔加100 μl 1× MTT,37℃孵育4 h,令MTT還原為甲臜。吸出上清液,每孔加150 μl DMSO 使甲臜溶解,用平板搖床搖勻后即可用酶標(biāo)儀在560 nm波長處檢測每孔的光密度。然后分析細(xì)胞存活率,具體方法為將各測試孔的光密度(OD)值減去本底OD 值(完全培養(yǎng)基加MTT,無細(xì)胞)或空白藥物孔OD 值(完全培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT,無細(xì)胞),各重復(fù)孔的OD 值取均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差。細(xì)胞的存活率以T/C%表示,T 為加藥細(xì)胞的OD 值,C 為對照細(xì)胞的OD 值。細(xì)胞存活率=(加藥細(xì)胞OD/對照細(xì)胞OD)×100%。

1.2.3.2 臺盼藍(lán)染色 配制4%臺盼藍(lán)母液：稱取4 g臺盼藍(lán),加少量蒸餾水研磨,加雙蒸水至100 ml,用濾紙過濾,4℃保存。使用時(shí),用PBS 稀釋至0.4%。然后胰酶消化貼壁細(xì)胞,制備單細(xì)胞懸液,并作適當(dāng)稀釋。細(xì)胞懸液與0.4%臺盼藍(lán)溶液以9∶1 混合混勻。(終濃度0.04%)在3 min 內(nèi),分別計(jì)數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞。鏡下觀察,死細(xì)胞被染成明顯的藍(lán)色,而活細(xì)胞拒染呈無色透明狀。統(tǒng)計(jì)細(xì)胞活力：活細(xì)胞率=活細(xì)胞總數(shù)/(活細(xì)胞總數(shù)+死細(xì)胞總數(shù))×100%。

1.3 觀察指標(biāo) 分析MTT、臺盼藍(lán)染色細(xì)胞存活率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 5.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理,存活率采用單因素方差分析(ANOVA),組間比較用LSD 法。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT 細(xì)胞存活率分析 正常處理的Con組與C-R10組,C-R100組的存活率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),缺氧處理中N-R100組存活率最高,為0.068%。見表1,圖1,圖2。

圖1 正常處理

圖2 缺氧無糖12 h

2.2 臺盼藍(lán)染色細(xì)胞存活率分析 Con組、C-R1組、C-R10組、C-R100組、C-R1000組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。N組、N-R1組、N-R10組、N-R100組、N-R1000組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),其中N-R100組存活率最高,為0.058%,與MTT 結(jié)果基本吻合。見表2,圖3,圖4。

表2 臺盼藍(lán)染色細(xì)胞存活率分析(%)

圖3 正常處理

圖4 缺氧無糖12 h

3 討論

細(xì)胞在基礎(chǔ)狀態(tài)下自噬水平較低,用于維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)；但是當(dāng)細(xì)胞處于營養(yǎng)或能量不足、結(jié)構(gòu)重建以及清除損壞的細(xì)胞器等狀態(tài)時(shí)自噬被顯著激活。從信號調(diào)控機(jī)制分類自噬的信號途徑分為兩種,其中一種是哺乳類雷帕霉素靶蛋白(mTOR)依賴性途徑,mTOR 是細(xì)胞中ATP 和氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)的感受器,是細(xì)胞自噬的重要調(diào)節(jié)者。mTOR 的活性受細(xì)胞中葡萄糖與氨基酸水平的調(diào)節(jié)。當(dāng)細(xì)胞中營養(yǎng)充足時(shí),胰島素與受體結(jié)合后,通過激活ClassⅠPI3KPI3K-AKT激酶信號通路,繼而活化蛋白激酶mTOR。mTOR 通過抑制自噬相關(guān)蛋白Atg1-Atg13 復(fù)合物的形成來抑制細(xì)胞自噬的發(fā)生；當(dāng)處于饑餓時(shí),mTOR 的活性被抑制,導(dǎo)致Atg 家族成員活化,促進(jìn)自噬泡的形成。而本次實(shí)驗(yàn)用rapamycin 正是通過抑制mTOR 活性而刺激自噬。由結(jié)果可知,通過適量的rapamycin 適度刺激自噬作用發(fā)生對缺氧心肌細(xì)胞有一定的保護(hù)作用。這可能是因?yàn)榧?xì)胞營養(yǎng)不足時(shí),自噬途徑被激活,誘導(dǎo)自噬體形成,并由溶酶體介導(dǎo)降解膜磷脂及胞質(zhì)內(nèi)蛋白質(zhì)等,給細(xì)胞提供能量與維持細(xì)胞的主要合成代謝。因此它可抑制慢性缺氧導(dǎo)致的凋亡,降低缺氧性心肌損傷,是缺氧過程心肌細(xì)胞自我保護(hù)的一種機(jī)制［4-6］。

綜上所述,本實(shí)驗(yàn)利用H9C2 轉(zhuǎn)化心肌細(xì)胞來模擬乳鼠心肌細(xì)胞,采用MTT 與臺盼藍(lán)染色來檢查細(xì)胞活力,研究自噬增強(qiáng)對缺氧引起的心肌細(xì)胞活性的影響。通過本課題的研究可以得出以下結(jié)論：適當(dāng)?shù)淖允稍鰪?qiáng)可保護(hù)缺氧引起的心肌細(xì)胞損傷。