滕安國(guó)，李冰馨，趙靜怡，李雪濤，張芹

（天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津300457）

肉的保水性（water-holding capacity，WHC）是評(píng)價(jià)肉制品品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，直接影響著肉的滋味、香氣、多汁性、營(yíng)養(yǎng)成分、嫩度以及顏色等食用品質(zhì)[1]。鹽溶蛋白是影響肉制品品質(zhì)特性的主要肌肉蛋白質(zhì)，鹽溶蛋白擁有特殊的化學(xué)結(jié)構(gòu)，電荷之間的相互作用力可使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)松散，熱誘導(dǎo)凝膠形成穩(wěn)定的三維結(jié)構(gòu)，從而提高肉制品的品質(zhì)，增加保水效果[2]。

磷酸鹽作為水分保持劑[3]，在熟肉制品和預(yù)制肉制品加工時(shí)，常用磷酸鹽有焦磷酸鈉（sodium pyrophosphate，SPP）、三聚磷酸鈉（sodium tripolyphosphate，STP）和六偏磷酸鈉（sodium hexametaphosphate，SHP）[4-7]，磷酸鹽也有一定的酸度調(diào)節(jié)劑作用[8]。磷酸鹽能改變肌原纖維蛋白的熱誘導(dǎo)凝膠流變特性[9]，提高鹽溶蛋白質(zhì)凝膠保持水分和脂肪的能力，減少營(yíng)養(yǎng)成分的損失，從而影響肉制品保水性、成品率[10]。但是，長(zhǎng)期食用過(guò)多含磷酸鹽類食品，會(huì)降低人體對(duì)鈣的吸收，導(dǎo)致機(jī)體鈣磷失衡[11]，甚至?xí)?dǎo)致某些家族遺傳性疾病及慢性腎病患者發(fā)生血管鈣化[12]。近年來(lái)，無(wú)磷保水劑成為研究熱點(diǎn)。張杰等[13]研究檸檬酸三鈉等無(wú)磷保水劑對(duì)牦牛肉糜保水性發(fā)現(xiàn)，添加1.20%檸檬酸三鈉時(shí)蒸煮損失和離心損失最小。檸檬酸鈉（sodium citrate，SC）作為無(wú)磷保水劑作用在海產(chǎn)品上，得出最優(yōu)組合為氯化鈉0.5%、SC 1.8%、海藻糖0.5%，蒸煮損失率從50.06%降至39.11%，WHC從3.70%提高至6.03%[14]。SC作為食品、飲料工業(yè)中的調(diào)味劑、乳化劑、膨脹劑、穩(wěn)定劑等被廣泛應(yīng)用[15-16]。在肉制品加工上，檸檬酸鹽作為酸度調(diào)節(jié)劑可適量使用[8]。

然而，在食品工業(yè)上，完全替代磷酸鹽的保水作用，尚有一定難度。本研究從水分保持劑的實(shí)際應(yīng)用角度出發(fā)，并綜合考慮消費(fèi)者對(duì)食品健康的需求，以檸檬酸鹽逐步替代磷酸鹽為目的。本研究在SPP、STP和SHP 3種水分保持劑的基礎(chǔ)上，加入酸度調(diào)節(jié)劑SC，研究復(fù)合鹽對(duì)牛肉凝膠的保水性，并將鹽溶蛋白液進(jìn)行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），分析凝膠保水性與鹽溶蛋白質(zhì)之間的關(guān)系。檸檬酸鹽協(xié)同磷酸鹽保水作用的研究有著現(xiàn)實(shí)意義，不僅能夠減少磷酸鹽的過(guò)量添加，而且能提高肉的離子強(qiáng)度、提高pH值[17]、螯合金屬離子[18]，從而改善肉品品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛背長(zhǎng)?。菏惺劾漉r肉；SPP、STP、SHP、SC 均為食品級(jí)：天津大學(xué)科威公司。

TQ-5型絞肉機(jī)：廣東恒聯(lián)食品機(jī)械有限公司；XHF-D型高速組織勻漿機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；G10型離心機(jī)：白洋離心機(jī)廠；PB-21型酸度計(jì)、BSA224S-CW型分析天平：德國(guó)Sartorius公司；XMTD-204型恒溫水浴鍋：天津市歐諾儀器儀表有限公司；DFG80-1型電熱鼓風(fēng)干燥箱：湖北黃石市醫(yī)療器械廠；JY-SCZ2型電泳儀：北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；ChemiDocXRS型凝膠成像儀：Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 鹽溶蛋白的制備

牛肉剔除結(jié)締組織置于絞肉機(jī)中打成肉糜，稱取20 g肉糜，加入0.6 mol/L NaCl溶液80 mL，用高速組織勻漿機(jī)進(jìn)行勻漿處理（4℃，8 000 r/min，30 min），勻漿液在4℃條件下靜止放置24 h；雙層紗布過(guò)濾，粗濾液經(jīng)4 000 r/min離心5 min后，所得上清液即為鹽溶蛋白溶液[19-20]。

1.2.2 鹽溶蛋白凝膠的制備及試驗(yàn)設(shè)計(jì)

取鹽溶蛋白溶液稱重，分別按質(zhì)量分?jǐn)?shù)加入SPP、STP、SHP和SC，溶于離心管中充分混勻后加熱，從30℃緩慢升溫到70℃，升溫速率為1℃/min，70℃恒溫保持5 min，形成的凝膠用自來(lái)水冷卻至25℃。

1.2.2.1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在制備蛋白凝膠后添加4組鹽，分別為SPP、STP、SHP和SC，每組按質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%、0.1%、0.15%、0.2%和0.25%梯度添加，每個(gè)梯度重復(fù)3次，進(jìn)行鹽溶蛋白pH值測(cè)定和凝膠保水性測(cè)定。

1.2.2.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

SPP、STP、SHP和SC組成復(fù)合鹽，試驗(yàn)共4個(gè)因素，以單因素試驗(yàn)得到每種鹽最適添加量為基礎(chǔ)，設(shè)3個(gè)水平，通過(guò)L9（34）正交試驗(yàn)表設(shè)計(jì)9組試驗(yàn)（n=3），通過(guò)試驗(yàn)結(jié)果、R和極值，進(jìn)行正交試驗(yàn)綜合分析，得出最優(yōu)組合。

1.2.3 凝膠保水性的測(cè)定

將制備的鹽溶蛋白凝膠3 000 r/min離心5 min后稱量，將已離心樣品中的水分用濾紙吸干，再稱重。每個(gè)處理測(cè)定3個(gè)重復(fù)，4℃條件下保存待測(cè)。牛肉凝膠保水性按照公式（1）計(jì)算。

式中：m、m1、m2分別為離心管質(zhì)量、離心管和離心后凝膠質(zhì)量、離心管和離心前凝膠質(zhì)量，單位均為g。

1.2.4 鹽溶蛋白凝膠的SDS-PAGE分析

將提取的鹽溶蛋白溶液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，試驗(yàn)所采用的濃縮膠和分離膠的濃度分別為3%和10%。將鹽溶蛋白質(zhì)溶液濃度稀釋到1 mg/mL，上樣量為 10 μL[21]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 16.0軟件統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)，使用CompareMeans下One-WayANOVA進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)差分析和顯著性檢驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，每組n=3。

2 結(jié)果與分析

2.1 單一鹽的保水性

按照食品添加劑使用GB2760-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》的用量規(guī)定，復(fù)合磷酸鹽使用時(shí)以磷酸鹽計(jì)，不得超過(guò)5 g/kg。不同磷酸鹽及檸檬酸鹽添加量對(duì)鹽溶蛋白溶液pH值的影響見(jiàn)圖1，單一鹽的不同添加量對(duì)鹽溶蛋白凝膠保水性的影響見(jiàn)圖2。

圖1 磷酸鹽及檸檬酸鹽對(duì)鹽溶蛋白溶液pH值的影響Fig.1 Effect of phosphate on pH value of salt soluble protein solution

肌球蛋白的等電點(diǎn)在5.0左右，從圖1可以看出，加入磷酸鹽和檸檬酸鹽均可以使鹽溶蛋白的pH值升高，且表現(xiàn)為濃度依賴性，但在鹽濃度達(dá)到0.25%時(shí)，添加STP、SHP和SC的鹽溶蛋白的pH值均有所降低。鹽溶蛋白的pH值升高，偏離肌球蛋白等電點(diǎn)，使得凝膠過(guò)程中蛋白質(zhì)的交聯(lián)作用增強(qiáng)，形成致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。通過(guò)試驗(yàn)前期測(cè)得（見(jiàn)表1），1%的SPP水溶液pH值為10.0～10.2；1%的STP水溶液pH值為9.3左右，均為堿性，可以提高鹽溶蛋白凝膠的保水性，并隨著加熱pH值不發(fā)生顯著性變化（P＞0.05）。

圖2 磷酸鹽及檸檬酸鹽對(duì)鹽溶蛋白凝膠保水性的影響Fig.2 Effect of phosphate on water holding capacity of salt soluble protein gel

從圖2可知，在牛肉中添加磷酸鹽可增加鹽溶蛋白凝膠的保水性。SPP在添加量為0.2%時(shí)達(dá)到最大值，而后由于凝膠均一性變差[22]，導(dǎo)致WHC下降；隨著STP添加量的增加，WHC逐漸增加，最適添加量為0.15%；SHP的添加量在0.1%之后隨著百分比的增加WHC小幅度的增加，最適添加量為0.15%。

表1 不同加熱溫度條件下1%磷酸鹽溶液pH值Table 1 pH value of 1%phosphate solution at different heating temperature

SC是目前最重要的檸檬酸鹽，其安全無(wú)毒，作為食品添加劑廣泛使用[23]。SC屬于弱酸強(qiáng)堿鹽，其水溶液顯堿性，具有良好的pH值緩沖性能。SC可以提高肉的pH值，因而能夠阻止因pH值降低而引起的肉保水性問(wèn)題。

由圖2可知，隨著SC添加量的增加，鹽溶蛋白凝膠保水性提高，圖1表明SC可以提高pH值，故可使肌球蛋白pH值偏離等電點(diǎn)，從而使凝膠保水性增強(qiáng)。Kuwahara等[24]的研究結(jié)果與本研究相似，SC可以抑制魷魚(yú)肌肉蛋白質(zhì)的自溶活性，從而改進(jìn)魷魚(yú)的蛋白凝膠性能。同時(shí)，SC在結(jié)構(gòu)上與多聚磷酸鹽類似，具有多個(gè)離子結(jié)合點(diǎn)，能夠增加肉中各種蛋白的電荷，使其蛋白間相斥，產(chǎn)生更多容納水的空間。SC作為品質(zhì)改良劑對(duì)魷魚(yú)外套膜肌肉蛋白凝膠的強(qiáng)度、保水性存在著顯著性關(guān)系[25]。因此，SC可作為一種理想的保水劑。

2.2 檸檬酸鹽與磷酸鹽最佳配比的測(cè)定

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇 SPP（A）、STP（B）、SHP（C）和SC（D）的最適添加量為因素進(jìn)行正交試驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 檸檬酸鹽與磷酸鹽的正交試驗(yàn)因素水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal test for citrate and phosphate

續(xù)表2 檸檬酸鹽與磷酸鹽的正交試驗(yàn)因素水平表Continue table 2 Factors and levels of orthogonal test for citrate and phosphate

由表2可知，第1號(hào)試驗(yàn)的pH值為5.69最大，但是與第6、9號(hào)試驗(yàn)結(jié)果5.68差別不大，通過(guò)極值分析得出pH值較優(yōu)組合為A2B3C3D1。從表2可以看出，第6號(hào)試驗(yàn)的WHC為93.98%，試驗(yàn)結(jié)果較好，其因素組合為A2B3C2D1。根據(jù)R值，影響牛肉鹽溶蛋白凝膠保水性的主次因素為：A＞B＞C＞D，即SPP對(duì)凝膠保水性影響最大，其次是STP、SHP，SC對(duì)凝膠保水性影響相對(duì)較小。從極值分析得出WHC較優(yōu)組合為A2B3C3D1，即SPP、STP、SHP和SC 的質(zhì)量配比為 2∶2∶2∶3，與較好組合不一致。由于較優(yōu)組合不在正交試驗(yàn)的9次試驗(yàn)中，因此需要進(jìn)一步驗(yàn)證試驗(yàn)。李躍文[26]使用復(fù)合磷酸鹽改良鴨肉加工品質(zhì)，SPP∶STP∶SHP最佳配方為5∶4∶4，與本研究所得配方中接近，SC和SPP水溶液都呈堿性，添加SC可以使SPP用量降低。

2.3 最佳配比驗(yàn)證試驗(yàn)

通過(guò)pH值和WHC的極值分析，同時(shí)得到較優(yōu)組合為 SPP∶STP∶SHP∶SC 的質(zhì)量配比為 2∶2∶2∶3，可見(jiàn)pH值與WHC有較強(qiáng)的關(guān)聯(lián)，因此，下文研究只考慮WHC。按比例稱取4種鹽充分混勻成復(fù)合鹽，在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)（n=3），添加0.5%復(fù)合鹽到鹽溶蛋白溶液中，制備凝膠。通過(guò)試驗(yàn)WHC為（94.03±0.32）%，均高于正交試驗(yàn)的9組結(jié)果，表明該較優(yōu)組合為最佳配比。

2.4 復(fù)合鹽最佳添加量的確定

根據(jù)GB 2760-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》的用量規(guī)定，本文對(duì)添加量大于0.5%的情況不做研究。復(fù)合鹽添加量對(duì)牛肉凝膠保水性的影響見(jiàn)表3。

由表3可以看出，隨著復(fù)合鹽添加量的增加，鹽溶蛋白凝膠保水性顯著性增加（P＜0.05），當(dāng)添加量達(dá)到0.4%～0.5%時(shí)，WHC值趨于穩(wěn)定，而低于0.2%，凝膠的保水性相對(duì)較低。

表3 復(fù)合鹽對(duì)鹽溶蛋白凝膠保水性的影響Table 3 The effect of compound salt on water holding capacity of salt soluble protein gel

2.5 鹽溶蛋白凝膠的SDS-PAGE分析

為了研究凝膠保水性與形成凝膠的鹽溶蛋白質(zhì)之間的關(guān)系，選取一組空白、單因素試驗(yàn)中4種鹽最佳添加量，以及4種鹽的最佳配比復(fù)合鹽，共6組樣品，添加到牛肉鹽溶蛋白溶液中，進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 添加不同鹽類鹽溶蛋白凝膠SDS-PAGE圖Fig.3 SDS-PAGE map of salt soluble protein gel

分子量在220 kDa處的是肌球蛋白重鏈[27]，通過(guò)SDS-PAGE圖看出，CP組的肌球蛋白鏈比其他組條帶濃度稍大，STP組在此處條帶濃度較低，說(shuō)明經(jīng)過(guò)不同條件處理的鹽溶蛋白溶液的蛋白質(zhì)組分有一定差異。由圖3可知，在97.4 kDa～31 kDa之間，各組的蛋白條帶位置相似，說(shuō)明蛋白種類無(wú)顯著差別。但各組電泳條帶的濃度有一定差異，說(shuō)明將復(fù)合鹽添加到牛肉鹽溶蛋白中，會(huì)部分改變蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)，影響蛋白質(zhì)的含量，進(jìn)而影響保水性能。王嵬等[28]研究表明用4%草魚(yú)內(nèi)臟水解蛋白液和0.2%復(fù)合磷酸鹽溶液，南美白對(duì)蝦解凍損失和蒸煮損失都較單獨(dú)磷酸鹽組降低，說(shuō)明蛋白質(zhì)含量的改變能有效促進(jìn)產(chǎn)品保水性，與本研究結(jié)果相似。

3 結(jié)論

降低磷酸鹽的使用是當(dāng)前研究熱點(diǎn)，通過(guò)本研究發(fā)現(xiàn)，各種磷酸鹽與檸檬酸鹽對(duì)牛肉鹽溶蛋白凝膠的保水性均有一定的影響，利用各單鹽之間的協(xié)同增效作用，將SPP、STP、SHP與SC復(fù)合，且當(dāng)四者添加量為2∶2∶2∶3（質(zhì)量比），復(fù)合鹽的添加量為0.5%時(shí)，凝膠保水率可達(dá)94.03%。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)pH值對(duì)保水率有一定程度的影響，SC的堿性可以促進(jìn)牛肉肌球蛋白偏離等電點(diǎn)，從而增加保水性。通過(guò)對(duì)不同鹽溶蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析可知，復(fù)合鹽能改變蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)，影響蛋白質(zhì)的含量，從而影響肉的保水性。