楊美玲　李琦　陳佳琦　張曉明

摘要 RNA沉默技術(shù)由于其簡便、高效及高特異性在各種模式和非模式生物系統(tǒng)中得到了廣泛的應(yīng)用。植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)是將植物、動物或微生物中分離到的目的基因，通過各種手段整合到植物基因組上，使其穩(wěn)定遺傳并賦予植物新的優(yōu)良性狀的生物技術(shù)。RNA沉默在植物轉(zhuǎn)基因工程領(lǐng)域的研究十分廣泛，目前已經(jīng)成功研究培育出許多抗病毒、抗蟲轉(zhuǎn)基因植物，為農(nóng)業(yè)病蟲害的防控提供了新的思路和方法。本文重點綜述了近年來植物轉(zhuǎn)基因介導(dǎo)RNA沉默在抗蟲與抗病毒研究方面的進展，加深人們對轉(zhuǎn)基因植物抗蟲與抗病毒研究的認識。

關(guān)鍵詞 RNA沉默; 轉(zhuǎn)基因技術(shù); 植物抗蟲; 植物抗病毒

中圖分類號： S 43， Q 943.2

文獻標(biāo)識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019234

The plant resistances to viruses and pests mediated by transgenic RNA silencing technology

YANG Meiling， LI Qi， CHEN Jiaqi， ZHANG Xiaoming*

（State Key Laboratory of Integrated Management of Pest Insects and Rodents， Institute of Zoology，

Chinese Academy of Sciences， Beijing 100101， China）

Abstract

RNA silencing， a powerful technique that permits tissue-specific， simple and efficient gene knockdown， has been widely applied in model and non-model organisms. With transgenic technology， recombinant DNA fragments from plants， animals， or microbes are transformed into plants to generate transgenic plants with better characteristics. RNA silencing has been widely used to create transgenic plants that show higher resistance to viruses or pests relative to non-transformed ones. In this paper， we reviewed the recent advancements in the functions of transgenic RNA silencing in plant resistances to viruses and pests. It will improve our understanding of the function of transgenic technology in plant resistances to viruses and pests.

Key words

RNA silencing; transgenic technology; plant resistance to pests; plant resistance to viruses

中國是一個農(nóng)業(yè)生物災(zāi)害頻發(fā)、生態(tài)環(huán)境脆弱的農(nóng)業(yè)大國。毀滅性的農(nóng)作物病蟲害頻繁暴發(fā)，導(dǎo)致農(nóng)業(yè)經(jīng)濟損失與環(huán)境破壞。因此，安全有效地防治農(nóng)作物病蟲害是提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)安全、保障農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量、減少環(huán)境污染、保護人類健康和促進農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要組成部分。

RNA沉默（RNA silencing）是真核生物內(nèi)廣泛存在的調(diào)控機制，小分子RNA（small RNA，sRNA）通過與靶標(biāo)基因的配對在轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達。體外合成一段與內(nèi)源基因同源的雙鏈RNA（double-strand RNA， dsRNA）或sRNA，將其導(dǎo)入生物體內(nèi)，可以使內(nèi)源基因中同源mRNA降解，從而達到抑制基因表達的目的，這種現(xiàn)象是RNA沉默現(xiàn)象的一種，被稱為共抑制（co-suppression）[1]。利用相似的機制克隆昆蟲或者病毒靶標(biāo)片段，構(gòu)建dsRNA轉(zhuǎn)入植物，也可以沉默昆蟲或病毒基因，這種方法是防治植物病蟲害的有效途徑之一。采用轉(zhuǎn)基因RNA沉默技術(shù)進行病蟲害控制是植物保護領(lǐng)域的一種新型策略，該技術(shù)具有如下特點：1）對靶標(biāo)生物具有專一性，對非靶標(biāo)生物無殺傷作用;2）RNA在自然界易降解，殘留低;3）對環(huán)境無毒無害，相對安全。人們將基于RNA沉默的害蟲控制稱為“第四代殺蟲劑”[2-3]。目前，這種技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于多種動植物的功能基因組研究和代謝途徑分析，并且在植物的抗病蟲育種中表現(xiàn)出了巨大的優(yōu)勢，成為植物抗病蟲基因工程的熱點。

1 RNA沉默的發(fā)生機制

1998 年 Fire 等首次發(fā)現(xiàn)dsRNA是RNA沉默現(xiàn)象的誘發(fā)因子，并將抑制序列同源性基因表達的現(xiàn)象定義為RNA干擾[4]。RNA干擾（RNA interference，RNAi）是指在動物系統(tǒng)內(nèi)將dsRNA導(dǎo)入細胞，在細胞內(nèi)特異性地誘導(dǎo)與之同源互補的mRNA的降解或者抑制其蛋白質(zhì)翻譯，使相應(yīng)基因不能表達的現(xiàn)象[5]。植物體內(nèi)的這類相似現(xiàn)象被稱為共抑制或者基因沉默（gene silencing），根據(jù)其作用方式的差異又可分為轉(zhuǎn)錄水平基因沉默（transcriptional gene silencing， TGS）和轉(zhuǎn)錄后水平基因沉默（post-transcriptional gene silencing，PTGS）。現(xiàn)在研究人員將真核生物的這一類現(xiàn)象統(tǒng)稱為RNA沉默。

RNA沉默是非常保守的基因表達調(diào)控機制，該機制由dsRNA誘導(dǎo)發(fā)生，外源或內(nèi)源dsRNA在一種RNase Ⅲ類似核酸酶Dicer/DCL的酶切作用下，剪切生成長度為21～24 nt的雙鏈小RNA。然后雙鏈sRNA與以Argonaute（AGO）蛋白為主體的蛋白復(fù)合體結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RNA induced silencing complex， RISC）[6-7]。RISC中的一條sRNA通過堿基配對可以與mRNA結(jié)合，引導(dǎo)AGO識別mRNA通過降解或者抑制翻譯的方式抑制基因表達，造成轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默;RISC復(fù)合體中的sRNA也可以通過堿基配對的方式與相應(yīng)DNA結(jié)合，通過 DNA 甲基化的方式抑制基因轉(zhuǎn)錄，造成轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默[8]。RNA沉默的作用表現(xiàn)在抵御病毒、轉(zhuǎn)座子等外來核酸入侵，識別并抑制外源基因表達，維持生物體基因組完整性等方面[9-11]。在植物轉(zhuǎn)基因過程中，轉(zhuǎn)入基因與內(nèi)源基因具有很高同源性，更重要的是轉(zhuǎn)基因過程中經(jīng)常會有多拷貝基因轉(zhuǎn)入，這兩種現(xiàn)象都會高效引發(fā)基因沉默，這種現(xiàn)象被稱為轉(zhuǎn)基因沉默。

對于RNAi介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因抗性植物而言，RNA沉默靶標(biāo)基因的選擇不僅要篩選對病蟲害發(fā)育有重要影響的基因，而且還要保證這些基因不會對天敵、哺乳動物和人等非靶標(biāo)生物產(chǎn)生不良影響。只有通過上述研究才能利用RNAi在大田應(yīng)用。如果想同時研究同一家族幾個基因的功能，則在這些基因的保守域設(shè)計dsRNA即可同時沉默多個基因以達到研究目的[12]。

為了降低RNA沉默的脫靶效應(yīng)，siRNA序列的選擇有一定標(biāo)準，siRNA序列有21個核苷酸，其中19個核苷酸形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，同時在3′端有2個突出的堿基形成懸垂結(jié)構(gòu)，例如AA或UU;通常siRNA的GC含量在30%～70%之間;而且目標(biāo)siRNA序列不能距離起始密碼子太近等[13]。目前一些設(shè)計siRNA的軟件和一些生物公司提供的在線設(shè)計siRNA的程序也基本考慮了上述標(biāo)準。有研究人員發(fā)現(xiàn)對同一個靶基因的不同位點設(shè)計4條不同的siRNA，將這4條siRNA按照特定比例混合可高效沉默靶標(biāo)基因，分析發(fā)現(xiàn)混合的siRNA與單一轉(zhuǎn)染的siRNA相比可顯著降低脫靶效應(yīng)[14]。

2 植物RNA沉默轉(zhuǎn)基因技術(shù)在害蟲控制中的應(yīng)用

將RNA沉默轉(zhuǎn)基因植物飼喂昆蟲可以有效沉默靶基因的表達[15]。利用植物轉(zhuǎn)基因表達dsRNA進行害蟲防治已成為新型的植物保護策略[16-17]。Pitino等在擬南芥內(nèi)轉(zhuǎn)化表達桃蚜Myzus persicae MpC002和Rack-1基因的dsRNA，采用Northern雜交技術(shù)檢測轉(zhuǎn)基因擬南芥中目標(biāo)sRNA的表達，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因植物中有大量目標(biāo)基因MpC002和Rack-1的sRNA積累[18]，隨后發(fā)現(xiàn)桃蚜取食轉(zhuǎn)基因擬南芥和煙草后，沉默了昆蟲體內(nèi)的MpC002和MpPIntO2基因，使其在轉(zhuǎn)基因植物上繁殖的后代顯著減少[19-20]。Mao等在煙草中轉(zhuǎn)化表達gap gene hunchback（hb）的dsRNA，增強了煙草對桃蚜的耐受性[21]。Kumar等構(gòu)建了表達煙草天蛾Manduca sexta細胞色素P450基因CYP6B46 dsRNA的病毒載體，轉(zhuǎn)化煙草進行Northern雜交分析，侵染煙草內(nèi)有大量CYP6B46 sRNA積累[22]。隨后研究發(fā)現(xiàn)CYP6B46 RNA沉默轉(zhuǎn)基因煙草確實能夠有效沉默鱗翅目昆蟲內(nèi)相關(guān)基因[23-24]。但是這些研究大多在模式植物擬南芥和煙草中完成[18，25-26]。

有研究表明在玉米、水稻和棉花等農(nóng)作物中表達dsRNA，也可以很好地提高作物對害蟲的抗性[27-29]。2007年，陳曉亞課題組在棉花中成功轉(zhuǎn)化表達棉鈴蟲P450基因CYP6AE14的dsRNA，高效沉默取食植物的棉鈴蟲Helicoverpa armigera體內(nèi)的靶基因，保護棉花免受棉鈴蟲危害[25，29]。美國孟山都公司在玉米內(nèi)轉(zhuǎn)化表達V-ATPase A的dsRNA，能夠有效抵抗玉米根螢葉甲Diabrotica virgifera virgifera的危害[27]，隨后又在提高RNA干擾效率方面做了大量研究工作[30]，并嘗試采用田間噴灑和各種載體表達dsRNA的方法進行害蟲控制。Zha等構(gòu)建獲得了表達褐飛虱Nilaparvata lugens中腸基因NlHT1、Nlcar和Nltry的dsRNA的轉(zhuǎn)基因水稻，Northern雜交檢測轉(zhuǎn)基因水稻中dsRNA的表達情況，結(jié)果表明所獲得的轉(zhuǎn)基因水稻葉片和韌皮部汁液中，靶基因RNA部分以dsRNA形式存在，部分以sRNA形式存在，褐飛虱取食該轉(zhuǎn)基因水稻后，中腸中的NlHT1、Nlcar和Nltry基因表達被高效抑制，但是褐飛虱無致死表型出現(xiàn)[28]。

轉(zhuǎn)基因RNAi技術(shù)有諸多優(yōu)點，不需要對靶標(biāo)全長基因進行克隆，只需要幾十至幾百個堿基片段，大大簡化了基因克隆步驟，有利于利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)進行害蟲控制。盡管關(guān)于運用轉(zhuǎn)基因RNAi進行害蟲防治已經(jīng)有20 多年的研究，但相關(guān)的應(yīng)用與研究還處于初級階段，仍有很多關(guān)鍵問題亟待解決和突破。例如，實驗室取得的防治效果能不能應(yīng)用于田間實際操作中？如何提高dsRNA 的沉默效果？如何使用特定的RNAi 來保護植物免受害蟲的為害，但又不傷害以這些植物為食的其他物種？利用轉(zhuǎn)基因植物表達的dsRNA 是否會對寄主植物本身產(chǎn)生影響，且能在多少個子代中穩(wěn)定地遺傳？如何推遲害蟲對RNAi 的適應(yīng)性等。這一系列基礎(chǔ)性和技術(shù)性的問題都需進一步深入研究。

3 植物RNA沉默轉(zhuǎn)基因技術(shù)在植物病害控制中的應(yīng)用

RNA沉默參與植物的抗病原菌反應(yīng)，從感病棉花中分離的大麗輪枝菌Verticillium dahliae中，檢測到很多來源于棉花的內(nèi)源小RNA（miRNAs），并調(diào)控真菌靶基因的下調(diào)，證明棉花能夠傳輸siRNA 到真菌細胞中誘導(dǎo)目標(biāo)基因的沉默[31]。AGO2可以通過結(jié)合miR393b*來抑制MEMB12基因的翻譯。MEMB12基因的表達受到抑制引起PR1（pathogenesis-related protein 1）基因表達的上調(diào)，最終提高了植物對細菌的抗性[7]。寄主植物的miRNAs的表達也受到很多病原菌的誘導(dǎo)或抑制，比如灰霉病菌Botrytis cinerea[32]、白粉菌Erysiphe graminis[33]、鐮刀菌Fusarium virguliforme[34]以及稻瘟病菌Magnaporthe oryzae[35]等。這些結(jié)果表明，RNA沉默在植物對病原菌的抗病調(diào)控中扮演著重要角色。

RNA沉默也是植物內(nèi)重要的抗病毒機制[36-39]。將某種病毒的某一序列片段設(shè)計成雙鏈結(jié)構(gòu)，導(dǎo)入植物體內(nèi)，使之表達可誘發(fā)RNA沉默的dsRNA，通過誘發(fā)的RNA沉默強化植物體內(nèi)天然的RNA沉默抗病毒機制，就可獲得具有很高抗病毒特性的轉(zhuǎn)基因植物[40-42]。這種RNA沉默轉(zhuǎn)基因技術(shù)已成為植物抗病毒基因工程的重要策略。同時由于病毒侵染的過程中會積累大量的dsRNA，導(dǎo)致RNA沉默的高效發(fā)生，研究人員利用這種機制將寄主植物的相應(yīng)基因片段克隆到病毒載體上，利用病毒的侵染高效沉默宿主基因，研究目標(biāo)基因的功能，人們稱這種技術(shù)為病毒誘導(dǎo)的基因沉默（virus-induced gene silencing，VIGS）[43-45]。

將單個病毒的特定基因片段構(gòu)建dsRNA載體，轉(zhuǎn)基因后可獲得對這一病毒具有抗性的植物。Waterhouse等以HC-Pro為目的基因，利用自行折回形成dsRNA的載體獲得轉(zhuǎn)基因煙草，有效地應(yīng)對馬鈴薯Y病毒Potato virus Y （PVY）的入侵[46]。2011年，人們又在煙草內(nèi)分別轉(zhuǎn)入黃瓜花葉病毒 Cucumber mosaic virus（CMV）復(fù)制酶基因和煙草花葉病毒Tobacco mosaic virus（TMV）運動蛋白基因的反向重復(fù)序列，檢測到CMV復(fù)制酶基因和TMV 運動蛋白基因sRNA的積累，并獲得了抗 CMV 和 TMV病毒的轉(zhuǎn)基因煙草[47]。Wang 等將大麥黃矮病毒Barley yellow dwarf virus（BYDV）的復(fù)制酶基因片段構(gòu)建到可產(chǎn)生發(fā)夾結(jié)構(gòu)的載體，轉(zhuǎn)化大麥獲得了可穩(wěn)定遺傳的抗病毒轉(zhuǎn)化系[48]。

同樣利用RNA沉默機制還可以培育廣譜抗性的轉(zhuǎn)基因作物。番茄斑萎病毒Tomato spotted wilt virus（TSWV）、番茄褪綠斑病毒Tomato chlorosis spot virus（TCSV）、花生環(huán)斑病毒Groundnut ring spot virus（GRSV）和西瓜銀色斑駁病毒W(wǎng)atermelon silver mottle virus（WSMoV）為番茄斑萎病毒屬中的4種病毒，Bucher等構(gòu)建了同時含有這4種病毒的N 基因序列的反向重復(fù)片段，轉(zhuǎn)化本氏煙后能特異性的檢測到4種病毒的sRNA，獲得了能同時抵御這4種病毒的轉(zhuǎn)基因植株，這說明轉(zhuǎn)基因煙草同時對這4種病毒發(fā)生了 RNA沉默[49]。

類病毒是一種只有246～401 nt的單鏈環(huán)狀RNA病原物，類病毒基因組不編碼蛋白，但對植物的侵染與病毒類似[50-51]。通過機械接種或介體傳播，類病毒在植物細胞內(nèi)自主復(fù)制，系統(tǒng)擴散發(fā)病。RNA沉默轉(zhuǎn)基因?qū)χ参锏钟惒《厩秩就瑯佑行Аchwind等構(gòu)建了馬鈴薯紡錘塊莖類病毒Potato spindle tuber viroid（PSTVd）的反向重復(fù)結(jié)構(gòu)并轉(zhuǎn)化番茄，獲得了抗性番茄[52]。有趣的是，DNA病毒也同樣能成為RNA沉默的靶標(biāo)。Zrachya等構(gòu)建番茄黃化曲葉病毒Tomato yellow leaf curl virus（TYLCV）外殼蛋白基因的反向重復(fù)結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)化番茄后，抗病性測定表明侵染7周后轉(zhuǎn)基因植株仍無癥狀表現(xiàn)，對該病毒表現(xiàn)出明顯抗性，同時轉(zhuǎn)基因不影響植物繁育，植株可以正常開花結(jié)果[53]。

人工miRNAs（artificial miRNA，amiRNA）介導(dǎo)的抗性轉(zhuǎn)化是目前較熱門的一個抗病品種獲得方式。研究者們利用amiRNA在抗病毒植物方面進行了大量的研究。人們利用miR159a前體合成兩種amiRNA：amiR-HC-Pro和amiR-P69。其中amiR-HC-Pro與蕪菁花葉病毒Turnip mosaic virus（TuMV）基因組HC-Pro基因的部分序列互補配對，amiR-P69與蕪菁黃花葉病毒Turnip yellow mosaic virus（TYMV）基因組P69基因的部分序列互補配對。轉(zhuǎn)化植株后，獲得了抗TuMV和TYMV的植株[54]。更多地了解內(nèi)源miRNA在植物體內(nèi)的作用過程，將有助于我們完善amiRNA方法，從而能更好地利用這一技術(shù)。

dsRNA介導(dǎo)的植物抗性途徑具有特異性強，較易獲得高抗甚至免疫的轉(zhuǎn)基因植株，且獲得的抗病性可以高效穩(wěn)定遺傳等特點，因此成為植物抗病毒基因工程研究中的一種高效抗性手段[46]。另一方面，通過RNA沉默介導(dǎo)的病毒抗性與傳統(tǒng)工程抗病相比，不但成功率高、特異性強，而且病毒基因進入植物體后，轉(zhuǎn)錄形成的dsRNA結(jié)構(gòu)會被植物體內(nèi)的DCL酶特異識別降解成21～24 nt的小片段，避免了病毒蛋白的翻譯，安全性更高。因此，RNA沉默為植物抗病遺傳育種提供了一條高效、特異的獲得抗性植物的途徑。

4 展望

植物RNA沉默轉(zhuǎn)基因技術(shù)的開發(fā)展示了其控制昆蟲和病毒危害的潛力。表達外源dsRNA的轉(zhuǎn)基因植物可以成功地觸發(fā)病毒和害蟲中基因的沉默，表明轉(zhuǎn)基因植物dsRNA產(chǎn)生的sRNA不僅能降解植物中病毒的基因組序列，而且能夠轉(zhuǎn)移sRNAs跨界沉默害蟲的關(guān)鍵基因，因此植物RNA沉默轉(zhuǎn)基因技術(shù)在病蟲害控制中展示出廣闊的應(yīng)用前景。目前，利用植物RNA沉默轉(zhuǎn)基因技術(shù)防治害蟲大都處于試驗階段，雖有部分產(chǎn)品即將投放市場，但要成為主流的害蟲防治技術(shù)仍需時間。利用RNA沉默的轉(zhuǎn)基因抗病蟲植物的安全問題也應(yīng)引起重視。RNAi轉(zhuǎn)基因作物的潛在風(fēng)險包括：1）靶外結(jié)合：小RNA分子和非靶標(biāo)mRNA序列相似并進行互作時，會產(chǎn)生脫靶效應(yīng);2）靶標(biāo)基因抗性：利用RNA復(fù)制過程中的高突變性，RNA病毒可逃避RNAi效應(yīng)，作物抗病性可能減弱甚至喪失;3）RNAi水平漂移：小RNA分子可能因基因漂移誘導(dǎo)非靶標(biāo)生物的基因沉默。隨著RNA沉默技術(shù)的深入研究，以及與其他技術(shù)的結(jié)合使用，相信在不久的將來，植物RNA沉默轉(zhuǎn)基因技術(shù)在害蟲防治、益蟲保護和新型農(nóng)藥的開發(fā)等方面將會發(fā)揮越來越重要的作用。

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（責(zé)任編輯：田 喆）