賈冰晨,王 宇,張東亮,吳筱林,尹海波,陳世華,郭善利

(煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山東 煙臺(tái) 264005)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative Real-Time PCR,qRT-PCR)是一種能夠高效、定量分析基因表達(dá)量的技術(shù)手段,具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好以及反應(yīng)速度快等特點(diǎn)[1]．但是有許多因素會(huì)對(duì)定量分析結(jié)果的準(zhǔn)確性造成影響,如RNA提取的質(zhì)量與產(chǎn)量、RNA反轉(zhuǎn)錄效率、qRT-PCR反應(yīng)體系初始模板量、酶促反應(yīng)效率等[2]．因此,為了排除基因表達(dá)的時(shí)空間差異、減少試驗(yàn)材料間的樣本差異、減小實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的系統(tǒng)誤差,獲得精確度高、科學(xué)合理的數(shù)據(jù),通常需要引入一個(gè)或多個(gè)表達(dá)較為穩(wěn)定的基因作為內(nèi)參基因,通過(guò)穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因?qū)z測(cè)基因的表達(dá)進(jìn)行校正及標(biāo)準(zhǔn)化分析[3]．篩選特定物種、或者在特定處理中穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因是進(jìn)行熒光定量實(shí)驗(yàn)的前提[4-5],目前基于常用的geNorm、NormFinder和Bestkeeper3種分析方法,可以篩選出特定實(shí)驗(yàn)條件下表達(dá)穩(wěn)定的內(nèi)參基因[6-7]．

藜麥(Chenopodiumquinoawilld)是莧科、藜亞科、藜屬的一年生自花授粉雙子葉植物,具有耐寒、耐旱、耐瘠薄、耐鹽堿等特性[8],其種植、推廣和不斷增長(zhǎng)的消費(fèi)需求也使得其遺傳育種等基礎(chǔ)生物學(xué)研究受到了科研工作者越來(lái)越多的關(guān)注．本研究利用篩選出的最佳內(nèi)參基因?qū)见滬}脅迫下小分子滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)合成相關(guān)基因脯氨酸合成酶基因(P5CS1)以及甜菜堿合成相關(guān)基因膽堿單加氧酶基因(CMO)的基因表達(dá)進(jìn)行了分析[9]．

1 材料與方法

1.1 材料與處理

用500 mmol NaCl溶液澆灌處理8片真葉期藜麥苗2 d,樣品做3個(gè)生物學(xué)重復(fù),剪取地上部分為試驗(yàn)材料．

1.2 RNA提取與反轉(zhuǎn)錄

使用Vazyme公司生產(chǎn)的Fast Pure Plant Total RNA Isolation Kit試劑盒提取處理后藜麥苗地上部分組織材料RNA,然后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性,并且使用GE Healthcare公司生產(chǎn)的Nano VueTM紫外/可見(jiàn)光分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度和純度．隨后使用Vazyme公司生產(chǎn)的HiScript?Ⅱ Q Select RT SuperMix for qPCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈．

1.3 候選內(nèi)參基因特異性引物設(shè)計(jì)

根據(jù)NCBI網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)發(fā)布的藜麥全基因組序列和在其他物種中常用的候選內(nèi)參基因,選取了(以NCBI網(wǎng)站發(fā)布的Gene ID為準(zhǔn))LOC110715281 (ACT-1),LOC110686159 (TUB-1),LOC110711758 (TUB-6),LOC110711181 (eIF3),LOC110710371 (EF1-α),LOC110711214 (GAPDH)共6個(gè)基因作為候選內(nèi)參基因,以及鹽脅迫相關(guān)基因LOC110722294 (P5CS1)和LOC110710124 (CMO)．使用BeaconDesign8軟件設(shè)計(jì)特異性引物(表1)并且在Primer-BLAST網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)上限定物種為藜麥對(duì)特異性引物進(jìn)行檢測(cè),并送至北京六合華大基因科技有限公司合成引物．

1.4 候選內(nèi)參基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR分析

qRT-PCR在QIAGEN?公司生產(chǎn)的Rotor-Gene Q實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中進(jìn)行．使用Vazyme公司生產(chǎn)的Cham QTMUniversal SYBR?qPCR Master Mix試劑進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)．實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系總體積為20 μL:2×Cham Q Universal SYBR qPCR Master Mix,10 μL;Forward Primer (10 μmol·L-1),0.4 μL;Reverse Primer (10 μmol·L-1),0.4 μL;10倍稀釋cDNA模板,1 μL;ddH2O,8.2 μL．反應(yīng)程序?yàn)?95 ℃,3 min;95 ℃,10 s,58 ℃,30 s,72 ℃,30 s,40個(gè)循環(huán)．進(jìn)行72～95 ℃熔解曲線分析．

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)處理使用geNorm、NormFinder和BestKeeper 3個(gè)軟件進(jìn)行分析,并利用Excel 2016作圖．

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA檢測(cè)

將提取的藜麥地上部分樣品RNA用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)．結(jié)果(圖1)顯示, 28S和18S RNA條帶清晰,表明RNA樣品沒(méi)有降解．使用Nano VueTM紫外/可見(jiàn)光分光光度計(jì)檢測(cè)的結(jié)果顯示,各樣品A260/A280在1.9～2.0之間,A260/A230在2.0～2.3之間,表明RNA的純度高,能滿足反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)的要求．

2.2 候選內(nèi)參基因引物特異性PCR檢測(cè)

使用反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA作為模板,通過(guò)普通PCR驗(yàn)證內(nèi)參引物擴(kuò)增特異性(圖2)．結(jié)果顯示,引物特異性較好,沒(méi)有非特異性擴(kuò)增及引物二聚體出現(xiàn),并且確定6對(duì)候選內(nèi)參基因引物Tm值為57 ℃．

2.3 候選內(nèi)參基因表達(dá)豐度

對(duì)6個(gè)候選內(nèi)參基因的循環(huán)閾值(Ct)進(jìn)行整理分析,評(píng)估這些基因的平均表達(dá)豐度(圖3)[10]．結(jié)果顯示,這6個(gè)候選內(nèi)參基因的Ct值位于17～28之間,其中4個(gè)候選內(nèi)參基因Ct值集中在20～26之間,說(shuō)明表達(dá)豐度適中．其中GAPDH的Ct值最低,范圍位于17～19之間,說(shuō)明其表達(dá)豐度最高;而EF1-α的Ct值最高,范圍位于于25～28之間,說(shuō)明其表達(dá)豐度最低．

2.4 geNorm程序分析候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性

geNorm通過(guò)計(jì)算每個(gè)候選內(nèi)參基因在特定實(shí)驗(yàn)條件下、特定組織材料中表達(dá)穩(wěn)定值(M)來(lái)判定其表達(dá)穩(wěn)定性[11]．該程序以M=1.5為閾值,當(dāng)候選內(nèi)參基因的M值大于1.5則不適于作為候選內(nèi)參基因．因此M值越小,候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性越高,越適合特定條件下作為候選內(nèi)參基因．由程序分析結(jié)果可知(圖4(a)),6個(gè)候選內(nèi)參基因的M值均小于1.5,其中ACT-1最小,為0.255;GAPDH最大,為0.378,表明這些基因都可作為候選內(nèi)參基因,按照M值由低到高排序依次為:ACT-1

2.5 NormFinder程序分析候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性

NormFinder與geNorm類似, 通過(guò)計(jì)算候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定值M來(lái)判定表達(dá)穩(wěn)定性的大小[11]．M值越小,越適合作為候選內(nèi)參基因;反之,則不適合．由程序分析結(jié)果可知(圖5), 6個(gè)候選內(nèi)參基因M值從低到高排列為ACT-1

2.6 Bestkeeper程序分析候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性

BestKeeper程序根據(jù)不同候選內(nèi)參基因在樣品中平均Ct值分別計(jì)算相關(guān)系數(shù)(coefficient of correlation,r)、標(biāo)準(zhǔn)差(standard deviation,SD)和變異系數(shù)(coefficient of variation,CV)來(lái)判定候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性[11]．判定原則是相關(guān)系數(shù)越大,標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)越小,內(nèi)標(biāo)基因表達(dá)穩(wěn)定性越好．由程序分析結(jié)果可知(表2),6個(gè)候選內(nèi)參基因SD值均小于1,說(shuō)明這些基因都適合作為內(nèi)參基因．其中,ACT-1和TUB-6相關(guān)系數(shù)較大,并且標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)比較小,故二者適合作為內(nèi)參基因．這與geNorm和NormFinder程序分析結(jié)果相似．

表2 Bestkeeper分析候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性

2.7 內(nèi)參基因熔解曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線分析

綜合上述3種程序分析顯示,在鹽脅迫下藜麥ACT-1與TUB-6作為熒光定量PCR內(nèi)參基因最為穩(wěn)定．故對(duì)2條內(nèi)參基因引物的熔解曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行分析[12],結(jié)果如圖6、表3所示,ACT-1和TUB-6熔解曲線(n=3)出現(xiàn)明顯單一峰,說(shuō)明引物特異性較好,并且Tm值分別為80.5 ℃和83.5 ℃．

表3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR中2條內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)

2.8 鹽脅迫相關(guān)基因P5CS1和CMO基因表達(dá)分析

在鹽脅迫下,由于外界滲透勢(shì)較低,植物細(xì)胞會(huì)發(fā)生水分虧缺現(xiàn)象,即滲透脅迫．多數(shù)植物能夠通過(guò)積累大量的代謝物質(zhì)如糖類(果糖、蔗糖、海藻糖等)、氨基酸(脯氨酸)等來(lái)調(diào)節(jié)植物細(xì)胞內(nèi)滲透壓與外界平衡,降低體細(xì)胞水勢(shì),保持膨壓．維持植物體內(nèi)生理代謝平衡,保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)．植物的脯氨酸和甜菜堿是公認(rèn)的小分子滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)[13-14],兩種物質(zhì)的合成與積累是植物應(yīng)答滲透脅迫、離子脅迫以及次生氧化脅迫的手段．分別使用篩選出的ACT-1和TUB-6作為內(nèi)參基因通過(guò)qRT-PCR對(duì)脯氨酸合成相關(guān)基因P5CS1和甜菜堿合成相關(guān)基因CMO基因表達(dá)分析．結(jié)果顯示(圖7),P5CS1和CMO基因在以ACT-1和TUB-6為內(nèi)參基因時(shí),表達(dá)情況一致,由此可見(jiàn)ACT-1和TUB-6可作為藜麥鹽脅迫時(shí)qRT-PCR分析時(shí)合適的內(nèi)參基因．并且在鹽脅迫下,藜麥P5CS1基因上調(diào)6倍左右,CMO基因上調(diào)30～40倍．

3 討 論

本研究分別使用geNorm、NormFinder和Bestkeeper內(nèi)參基因分析程序?qū)见溤贜aCl脅迫下6個(gè)候選內(nèi)參基因進(jìn)行篩選,并利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)藜麥鹽脅迫相關(guān)基因P5CS1和CMO基因相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析．綜合上述3種程序的分析結(jié)果,在NaCl脅迫下藜麥實(shí)時(shí)熒光定量PCR內(nèi)參基因最佳選擇數(shù)目為2,最佳內(nèi)參基因分別是ACT-1和TUB-6,并且2個(gè)內(nèi)參基因表達(dá)豐度處于22～24之間,基因表達(dá)豐度適中,能夠滿足實(shí)驗(yàn)需求．利用篩選出的ACT-1和TUB-6作為內(nèi)參基因,檢測(cè)到在NaCl脅迫下,藜麥P5CS1基因表達(dá)上調(diào)6倍左右,CMO基因表達(dá)上調(diào)30～40倍．由于基因表達(dá)存在時(shí)空間差異,經(jīng)驗(yàn)式的認(rèn)為管家基因都可以作為內(nèi)參基因是片面的[15],所以篩選特定物種、特定處理下實(shí)時(shí)熒光定量PCR內(nèi)參基因是有必要的．在不同物種,在同一物種不同組織、不同生長(zhǎng)階段、不同脅迫條件下內(nèi)參基因表達(dá)的穩(wěn)定性不盡相同[16],所以篩選特定物種中、特定處理下表達(dá)穩(wěn)定的內(nèi)參基因變得尤為重要．隨著藜麥在基因表達(dá)、抗逆分子生物學(xué)領(lǐng)域研究的深入,篩選出穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因成為研究的前提．此實(shí)驗(yàn)結(jié)果為NaCl脅迫下藜麥實(shí)時(shí)熒光定量PCR篩選出了可靠、穩(wěn)定的內(nèi)參基因,并從基因表達(dá)角度驗(yàn)證了甜菜堿的積累是藜麥應(yīng)答NaCl脅迫、調(diào)節(jié)滲透平衡的主要方式,這與其他藜科、莧科植物鹽脅迫下物質(zhì)積累相關(guān)報(bào)道一致[17-18]．