劉 晨，季 丹，孫立娜，孫雪珊，孟慶彩

保定市第一醫(yī)院檢驗科，河北 保定 071000

肝癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，具有較高的發(fā)病率和死亡率[1-2]，而我國肝癌發(fā)病率和病死率位居前列。目前，由于診斷肝癌的特異性指標靈敏性低，發(fā)現(xiàn)時已處于晚期，治療后出現(xiàn)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和耐藥現(xiàn)象，患者的生存率仍然很低。因此，我們亟需尋找新的肝癌診斷標志物及治療靶點。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞中存在一小部分具有干細胞特性的腫瘤細胞即腫瘤干細胞(cancer stem cells，CSCs)。CSCs具有自我更新能力和多向分化潛能[3-4]，是腫瘤發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)耐藥的根源所在。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一類轉(zhuǎn)錄本長度>200 nt、無蛋白質(zhì)編碼功能、缺少開放閱讀框(open reading frame，ORF)的功能性RNA分子，與CSCs的干性特征、擴增、自我更新及分化有一定的關(guān)系。lncRNA NEAT1在2007年由Hutchinson等[5]首次發(fā)現(xiàn)，其主要位于細胞核內(nèi)，是亞細胞結(jié)構(gòu)核旁斑的重要組成部分，參與形成和維持核旁斑。lncRNA NEAT1表達與細胞的分化程度有關(guān)，在調(diào)控CSCs生物學(xué)功能中發(fā)揮重要作用。肝癌干細胞(liver cancer stem cells，LCSCs)同樣存在于肝癌中，參與了肝癌的發(fā)生發(fā)展和復(fù)發(fā)耐藥[6]。因此，本研究分析lncRNA NEAT1在LCSCs的表達，探討其作為肝癌診斷及預(yù)后判定標志物的可行性；并探究過表達lncRNA NEAT1對LCSCs擴增及自我更新的調(diào)控及其機制；旨在為LCSCs的調(diào)控機制提供新的理論基礎(chǔ)，為肝癌的診療提供新靶標和策略。

1 材料與方法

1.1 試驗材料肝癌細胞培養(yǎng)：人肝癌細胞系HCCLM3細胞購自中國科學(xué)院上海細胞典藏庫，用含質(zhì)量濃度為100 g/L FBS的DMEM完全培養(yǎng)基(Hyclone)，置于37 ℃體積分數(shù)為5% CO2濃度的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。待細胞匯合度為80%左右時，進行傳代培養(yǎng)。

LCSCs獲得：取對數(shù)生長期HCCLM3細胞，以5 000個/孔接種于6孔低黏附培養(yǎng)板中，用不含F(xiàn)BS的DMEM/F12培養(yǎng)，同時輔以B27(1∶50)(Invitrogen)、20 ng/ml EGF(Peprotech)、10 ng/ml bFGF(Invitrogen)和4 mg/ml胰島素(Sigma)，置于37 ℃、體積分數(shù)為5% CO2孵箱中培養(yǎng)7 d，當細胞球直徑為50 μm時，添加質(zhì)量濃度為2.5 g/L的胰酶將細胞球消化，得到LCSCs。

1.2 細胞轉(zhuǎn)染以pCDH-CMV質(zhì)粒為載體，構(gòu)建NEAT1過表達慢病毒質(zhì)粒(pCDH-CMV-NEAT1)及陰性對照質(zhì)粒(pCDH-CMV-NC)，用三質(zhì)粒系統(tǒng)進行NEAT1過表達慢病毒包裝。LCSCs細胞密度調(diào)整為2×105ml-1，接種于6孔板中，DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，用10個感染復(fù)數(shù)病毒感染細胞，建立穩(wěn)定表達NEAT1的肝癌細胞系及對照細胞系，48 h后采用qRT-PCR檢測不同病毒的感染效率。

1.3 總RNA的提取及熒光定量PCR收集細胞，采用Trizol試劑(Life Technologies)提取總RNA，微量分光光度計檢測總RNA純度和濃度。以總RNA為模板，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega)反轉(zhuǎn)錄為cDNA，ABI 7500熒光定量PCR儀上進行qRT-PCR檢測各組細胞lncRNA NEAT1相對表達量。qRT-PCR反應(yīng)體系為：1 μl cDNA，1 μl上游/下游引物混合物(5 μmol/L)，5 μl 2×SYRB Green Master，3 μl Milli Q水，總體積10 μl。lncRNA NEAT1上游引物序列為5′-GGGTGGTCTGAGGAGTGATG-3′，下游引物序列為5′-CCTGGAAAATAAAGCGTTGGT-3′，內(nèi)參照GAPDH上游引物為5′-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3′，下游引物為5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′，經(jīng)生物信息庫查找由Invitrogen公司設(shè)計合成。qRT-PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 min；擴增循環(huán)：95 ℃變性15 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸35 s，進行40個循環(huán)；72 ℃終末延伸10 min。以GAPDH作為內(nèi)參，采用公式2-ΔΔCT定量分析lncRNA NEAT1的相對表達量，△Ct=Ct(目的基因)-Ct(內(nèi)參)，△△Ct =△Ct(處理組)-△Ct(對照)。

1.4 流式細胞儀檢測LCSCs擴增收集細胞，以2×105/孔接種于6孔板中，24 h后用胰蛋白酶消化細胞，以1 000 r/min離心3 min，用PBS重懸后，以1 000 r/min離心3 min，收集細胞沉淀。按1∶50比例用PBS稀釋流式抗體(EpCAM抗體及CD133抗體)(Mitenyi Biotec)及其對照抗體，總體積100 μl加入細胞沉淀中，輕彈混勻，4 ℃孵育30 min，每5 min間隔輕彈混勻；用PBS重懸離心洗2遍后，加入200 μl PBS重懸，用尼龍網(wǎng)過濾至流式檢測管中，流式細胞儀檢測并分析EpCAM+和CD133+細胞亞群比例。

1.5 細胞克隆形成能力的檢測收集細胞，按50個/孔接種于24孔板，用含質(zhì)量濃度為100 g/L FBS的DMEM完全培養(yǎng)基(Hyclone)培養(yǎng)，置于37 ℃，體積分數(shù)為5% CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，每3～4 d更換1次新鮮培養(yǎng)液。根據(jù)不同細胞的生長狀況，7 d后對克隆進行染色。棄去培養(yǎng)基，甲醇(國藥集團化學(xué)試劑有限集團)室溫固定10 min，棄去甲醇，水洗，超凈臺中吹干，質(zhì)量濃度為5 g/L的結(jié)晶紫溶液染色120 min，棄去結(jié)晶紫溶液，水洗，風(fēng)干。拍照記錄細胞克隆情況，計算克隆形成率(以50個細胞以上的群體為1個克隆)，克隆形成率=(平均克隆形成個數(shù)/接種細胞數(shù))×100%。

1.6 細胞成球生長能力的檢測收集細胞，按20個/孔接種于低黏附的96孔板中，用含質(zhì)量濃度為5 g/L FBS的成球培養(yǎng)基DMEM/F12培養(yǎng)，同時輔以B27(1∶50)(Invitrogen)、20 ng/ml EGF(Peprotech)、10 ng/ml bFGF(Invitrogen)和4 μg/ml胰島素(Sigma)，置于37 ℃、體積分數(shù)為5% CO2孵箱中培養(yǎng)，每3～4 d補加1次新鮮培養(yǎng)液。根據(jù)細胞生長狀況，7 d后在顯微鏡下觀察統(tǒng)計細胞成球數(shù)量(直徑>75 μm)和體積，計算細胞成球率，成球率=(平均細胞球數(shù)/接種細胞數(shù))×100%。

1.7 蛋白印跡實驗收集細胞，蛋白裂解液裂解細胞，提取總蛋白，BCA檢測試劑盒(Pierce)測定總蛋白濃度。配制質(zhì)量濃度為100 g/L的分離膠，取20 μg總蛋白進行SDS-PAGE，經(jīng)質(zhì)量濃度為100 g/L的分離膠分離蛋白后，轉(zhuǎn)于PVDF膜上，質(zhì)量濃度為50 g/L的脫脂牛奶室溫封閉1 h，添加一抗孵育，辣根過氧化物酶(HRP)標記抗體，抗體p-LATS1、p-YAP按1∶1 000稀釋，GAPDH抗體按1∶5 000稀釋，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，加入HRP標記的羊抗鼠/兔二抗(1∶5 000)，室溫孵育2 h，TBST洗膜3次。加入ECL顯色，暗室中曝光成像，以GAPDH作為內(nèi)參，使用Gene Tools圖像分析系統(tǒng)對目的蛋白的灰度值進行分析。

2 結(jié)果

2.1 lncRNA NEAT1在LCSCs中高表達利用qRT-PCR檢測從肝癌細胞HCCLM3中富集的LCSCs與肝癌細胞HCCLM3中NEAT1表達差異，結(jié)果顯示，與HCCLM3細胞相比，NEAT1在LCSCs中的表達水平顯著升高(P<0.05，見圖1)，提示NEAT1可能與LCSCs的“干性”有關(guān)。

圖1 LCSCs與肝癌細胞HCCLM3中NEAT1表達情況

2.2 lncRNA NEAT1過表達細胞模型的建立分別用過表達lncRNA NEAT1的慢病毒及對照慢病毒感染LCSCs，建立穩(wěn)定過表達lncRNA NEAT1的LCSCs系及對照細胞系，qRT-PCR檢測慢病毒的感染效率，結(jié)果顯示，感染過表達lncRNA NEAT1慢病毒的LCSCs中l(wèi)ncRNA NEAT1的相對表達量顯著高于對照感染(P<0.001，見圖2)，表明過表達lncRNA NEAT1的慢病毒的感染效率高，可作為穩(wěn)定的過表達細胞模型進行后續(xù)實驗。

圖2 慢病毒過表達lncRNA NEAT1表達水平效率驗證

2.3 過表達lncRNA NEAT1促進LCSCs的擴增流式細胞術(shù)檢測過表達lncRNA NEAT1細胞及其對照細胞中LCSCs的比例變化，結(jié)果顯示，與對照組相比，lncRNA NEAT1過表達組肝癌細胞中EpCAM+和CD133+的LCSCs細胞亞群比例明顯增多(P<0.05，見圖3)，提示過表達lncRNA NEAT1可以促進LCSCs的擴增。

圖3 過表達lncRNA NEAT1對肝癌細胞中LCSCs比例的影響

2.4 過表達lncRNA NEAT1促進LCSCs的自我更新克隆形成實驗和細胞成球?qū)嶒灆z測過表達lncRNA NEAT1對肝癌細胞自我更新能力的影響，細胞成球?qū)嶒灠l(fā)現(xiàn)，與對照組細胞相比，過表達lncRNA NEAT1后，細胞成球率顯著升高(P<0.001，見圖4)，且成球體積增大；克隆形成實驗顯示，過表達lncRNA NEAT1的細胞，其單細胞克隆形成率明顯增強(P<0.05，見圖5)。以上結(jié)果提示，過表達lncRNA NEAT1能夠促進LCSCs的自我更新。

圖4 過表達lncRNA NEAT1對LCSCs成球能力的影響(放大200倍)

圖5 過表達lncRNA NEAT1對LCSCs克隆形成能力的影響(放大200倍)

2.5 過表達lncRNA NEAT1活化Hippo信號通路Western blotting檢測過表達lncRNA NEAT1對Hippo信號通路中關(guān)鍵蛋白LATS1和YAP蛋白磷酸化水平的影響，結(jié)果顯示，與對照細胞相比，過表達lncRNA NEAT1后，YAP及其上游分子LATS1的磷酸化水平明顯減弱(P<0.05，見圖6)。YAP磷酸化后會滯留于細胞質(zhì)中或被降解，去磷酸化后的YAP才能從細胞質(zhì)中轉(zhuǎn)移到細胞核內(nèi)發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，YAP磷酸化水平的減弱表明lncRNA NEAT1的過表達緩解YAP滯留于細胞質(zhì)，促進其核轉(zhuǎn)位活化，活化Hippo信號通路。

圖6 過表達lncRNA NEAT1促進Hippo信號通路活化

3 討論

近年來，越來越多的研究在眾多實體瘤中均發(fā)現(xiàn)了CSCs的存在，其具有干細胞自我更新及分化等特點，且具備更強的侵襲性及耐藥性，是癌癥復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的重要因素之一[7]。目前，傳統(tǒng)的手術(shù)切除、放化療及分子靶向治療是肝癌治療的主要方式，然而這些傳統(tǒng)治療手段往往不能徹底根除LCSCs。LCSCs是肝癌腫瘤細胞中存在的小部分亞群細胞，對肝癌的發(fā)生發(fā)展起至關(guān)重要的作用。因此，探索LCSCs的分子機制，發(fā)現(xiàn)可能的針對性治療靶點對肝癌的治療非常重要。

LCSCs具有更強的侵襲性和耐藥能力，是導(dǎo)致肝癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、根治困難的重要原因之一[8]。Phi等[9]研究發(fā)現(xiàn)，抗腫瘤藥物的施加使腫瘤細胞置于藥物脅迫之下，腫瘤細胞突變從而產(chǎn)生耐藥現(xiàn)象，而這種耐藥突變很可能源于CSCs，且在向成熟腫瘤細胞分化過程中維持耐藥性。越來越多的證據(jù)表明，lncRNAs會根據(jù)細胞不同的分化狀態(tài)及細胞類型特異性表達[10-11]，lncRNAs的異常表達在腫瘤的CSCs生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[12-13]。lncRNA NEAT1由11號染色體轉(zhuǎn)錄而來，是亞細胞結(jié)構(gòu)核旁斑的一個重要組成部分，參與形成及維持核旁斑[14]。研究表明，lncRNA NEAT1的表達與細胞的分化程度有關(guān)，其在胚胎干細胞、肌細胞、神經(jīng)細胞分化過程中隨分化進展逐漸上調(diào)[15]。CSCs往往處于低分化狀態(tài)，向成熟腫瘤細胞狀態(tài)分化，提示NEAT1在CSCs與腫瘤細胞中的表達水平可能存在差異，且可能發(fā)揮不同的作用。本研究通過對HCCLM3細胞低黏附成球培養(yǎng)富集LCSCs，qRT-PCR檢測LCSCs和HCCLM3細胞中l(wèi)ncRNA NEAT1的表達差異，結(jié)果顯示，NEAT1在LCSCs中表達顯著上調(diào)，且LCSCs被認為是肝癌的起源，提示lncRNA NEAT1在肝癌發(fā)生的早期可能發(fā)揮作用，為lncRNA NEAT1作為肝癌早期診斷標志物提供了可能性。

報道指出，lncRNA NEAT1可以調(diào)控干性細胞的相關(guān)生物學(xué)功能，控制腫瘤的起始發(fā)生與進展。Yang等[16]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA NEAT1在CD133+的膠質(zhì)瘤細胞中高表達，敲低lncRNA NEAT1表達抑制CD133+膠質(zhì)瘤細胞的軟瓊脂克隆形成能力。Jiang等[17]發(fā)現(xiàn)，干擾lncRNA NEAT1的表達，非小細胞肺癌形成的干細胞球中干性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達下降。Wang等[18]研究發(fā)現(xiàn)，lnc-DILC在LCSCs中低表達，可以通過結(jié)合于IL-6的啟動子區(qū)，調(diào)控IL-6/STAT3自分泌信號通路來抑制LCSCs的自我更新。本研究通過轉(zhuǎn)染慢病毒建立lncRNA NEAT1過表達細胞模型，通過流式細胞儀檢測、克隆形成實驗和細胞成球?qū)嶒灆z測證實lncRNA NEAT1的過表達可以促進LCSCs的擴增及自我更新功能，表明lncRNA NEAT1在LCSCs中高表達不僅僅是一種生物學(xué)現(xiàn)象，而且對于LCSCs的擴增及自我更新的維持具有重要調(diào)控作用。

Hippo信號通路是近年來備受關(guān)注的一條信號通路，在癌癥環(huán)境中可以調(diào)控干性或前體細胞的命運轉(zhuǎn)化和分化影響癌癥的發(fā)生、發(fā)展[19]。Hippo信號通路中，LATS1蛋白被上游信號激活磷酸化后與MOB1形成復(fù)合物，進而使轉(zhuǎn)錄共激活因子YAP磷酸化，磷酸化后的YAP會被酪氨酸3-加單氧酶/色氨酸5-加單氧酶激活蛋白(14-3-3蛋白)滯留于細胞質(zhì)中，從而發(fā)生泛素化降解，使YAP無法進入細胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用[20-21]。Qu等[22]研究發(fā)現(xiàn)，lncARSR通過與LATS競爭性結(jié)合YAP來促使YAP發(fā)生核轉(zhuǎn)位，促進腎癌CSCs的擴增。本研究利用Western blotting檢測了過表達lncRNA NEAT1對YAP及其上游調(diào)控蛋白LATS1的磷酸化水平的影響，結(jié)果顯示,過表達lncRNA NEAT1后抑制LATS1、YAP的磷酸化，使YAP去磷酸化，促進其核轉(zhuǎn)位活化，進而活化Hippo信號通路。本研究結(jié)果顯示，NEAT1可能通過調(diào)控Hippo信號通路關(guān)鍵蛋白磷酸化來實現(xiàn)對LCSCs的擴增及自我更新功能，為肝癌的診治提供了新的理論依據(jù)。然而LCSCs調(diào)控過程復(fù)雜且包含多種信號通路，Hippo/YAP通路對CSCs特異性的調(diào)控機制尚處于起步階段，且目前有關(guān)LCSCs中l(wèi)ncRNAs調(diào)控Hippo通路的研究較少，因此本研究還需進一步探究證實。此外，lncRNAs較長的核酸長度往往易形成二級結(jié)構(gòu)，通過與多種蛋白質(zhì)、DNA或RNA結(jié)合調(diào)控基因表達[23]。研究[24]表明，NEAT1可通過與多種蛋白質(zhì)結(jié)合參與形成核旁斑。既往相關(guān)研究[18]發(fā)現(xiàn)，lnc-DILC可直接結(jié)合IL-6啟動子，通過抑制IL-6/STAT3自分泌信號通路調(diào)控LCSCs的擴增?；诖宋覀兺茰yNEAT1可能也通過結(jié)合某種特定蛋白調(diào)控Hippo通路。而有研究[25]又表明，蛋白激酶A(PKA)可引起Hippo通路關(guān)鍵蛋白LATS1/2及YAP磷酸化，激活Hippo通路，調(diào)節(jié)細胞增殖、分化。是否又可猜測NEAT1與PKA間可能存在某種必然聯(lián)系調(diào)控Hippo信號通路參與LCSCs的擴增及更新。以上推測此前尚未見有較多研究報道，NEAT1通過怎樣的結(jié)合路徑調(diào)控Hippo通路影響LCSCs的擴增及自我更新功能還需后期繼續(xù)深入探究，也是后期研究的方向及展望。再者近年來既往大量研究已證明CSCs對眾多疾病的進展、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及治療耐藥性存在影響且得到一致認可，并證實部分lncRNAs、miroRNAs及蛋白等通過Wnt/β-catenin、TGF-β、Notch及Hedgehog等信號通路調(diào)控參與LCSCs的擴增及自我更新，促進EMT及干細胞表型的獲得，且已鑒定出多種LCSCs表面標志物?，F(xiàn)有研究仍不能通過獨立的一種分子標志物將LCSCs高純度分離，干細胞多種分子調(diào)控機制尚未完全清楚，關(guān)于LCSCs的研究也大都基于體外實驗獲得，缺乏體內(nèi)微環(huán)境，將所得成果直接用于臨床是否能夠獲得同樣成效目前也尚不得知，預(yù)示肝癌的治療仍需經(jīng)歷漫長的實踐探索路程。

綜上所述，lncRNA NEAT1在LCSCs中顯著高表達，過表達NEAT1促進LCSCs的擴增及自我更新能力，可能通過活化Hippo信號通路來實現(xiàn)，初步闡明了NEAT1對LCSCs擴增及自我更新的調(diào)控作用機制，為肝癌的診斷治療提供了新的理論依據(jù)。