徐林，齊宏順，李培培，葛汝村，馮肖亞，呂涌濤,

腦出血后，除了血腫的直接占位效應(yīng)可導(dǎo)致腦損傷及神經(jīng)功能缺損外，中樞和外周炎癥均可引起腦水腫及繼發(fā)性腦損傷[1-3]。減輕炎癥反應(yīng)是緩解腦出血后繼發(fā)性腦損傷的重要途徑。微創(chuàng)清除顱內(nèi)血腫的有效性已得到臨床研究證實(shí)，它能降低顱內(nèi)壓，改善周圍腦組織的灌注，并減輕血腫相關(guān)的繼發(fā)性損傷[4-6]。二甲雙胍是治療2型糖尿病、尤其是肥胖患者的一線藥物。二甲雙胍在降低血糖的同時具有抗炎、抗氧化及改善記憶障礙等作用[7,8]。我們推測二甲雙胍可能具有減輕腦出血炎癥反應(yīng)的潛在作用。本研究即探討微創(chuàng)清除術(shù)、二甲雙胍及兩者聯(lián)合干預(yù)對腦出血血腫周圍腦組織炎癥反應(yīng)的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物清潔級健康家兔60只，由濟(jì)南西嶺角實(shí)驗(yàn)動物中心提供。體質(zhì)量2.2～2.8 kg，雄性，在光照充足，10℃～30℃環(huán)境飼養(yǎng)。

1.1.2 主要儀器及試劑腦立體定位儀購于瑞沃德生命科技有限公司；臺式高速離心機(jī)Fresco 21購于德國Thermo公司；Infinite M200 Pro酶標(biāo)儀購于澳大利亞Tecan儀器有限公司；BX51光學(xué)顯微鏡購于日本Olympus公司；離子鈣接頭蛋白抗原（Ionized calcium bindingadaptor molecule-1，Iba-1）多克隆抗體購于Abcam公司，腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α單克隆抗體、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β多克隆抗體均購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組60只家兔隨機(jī)分為5組：正常對照組（NC組）、模型對照組（MC組）、二甲雙胍組（MET組），微創(chuàng)手術(shù)組（MIS組），微創(chuàng)手術(shù)聯(lián)合二甲雙胍組（MIS+MET組），各組12只。

1.2.2 模型制備家兔麻醉后固定于腦立體定位儀上。取十字縫與人字縫交叉點(diǎn)為0點(diǎn)，以AP1/L6為穿刺點(diǎn)，深度約12 mm。NC組緩慢注入生理鹽水（normal saline，NS）0.3 mL，其余各組注入家兔耳中央動脈血0.3 mL，術(shù)后肌注青霉素（40萬U）防止感染。造模3 h后進(jìn)行兔腦CT掃描。造模6 h后，MIS組及MIS+MET組家兔在血腫位置注入5 000 U尿激酶（溶于0.5 mL NS中）0.1 mL，進(jìn)行微創(chuàng)清除術(shù)。MC組及MET組模擬MIS過程，注入0.1 mL NS。術(shù)后再次進(jìn)行CT掃描，以驗(yàn)證微創(chuàng)手術(shù)的有效性。MET組、MIS+MET組家兔此后給予二甲雙胍（50 mg/kg）灌胃，NC組、MC組、MIS組給予等量NS灌胃。

1.2.3 指標(biāo)檢測①各組家兔在處死前2 h行Purdy神經(jīng)功能評分。②腦組織含水量的測定。各組家兔分別在實(shí)施相關(guān)處理后第3天和第7天處死。迅速取腦血腫周圍組織（100±10）mg，將腦組織置于稱量杯中稱取濕重，然后放入電熱恒溫箱（105℃）內(nèi)烘烤24 h至恒重，測量干重后計(jì)算腦含水量，腦含水量%=(濕重-干重)／濕重×100%。③免疫組織化學(xué)檢測。各組家兔分別在實(shí)施相關(guān)處理后第3天和第7天處死。之后進(jìn)行心臟灌洗NS及4%多聚甲醛，迅速斷頭取腦，以針道為中心，切取直徑0.5 cm范圍內(nèi)的腦組織，制作石蠟切片，按照試劑盒說明書進(jìn)行TNF-α、IL-1β和Iba-1免疫組織化學(xué)染色，DAB顯色。每張玻片均選5個高倍視野（×400）計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，取計(jì)數(shù)的平均值為該組標(biāo)本的陽性細(xì)胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0軟件處理數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布以及方差齊性的計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腦出血模型制備

當(dāng)血液被注入基底節(jié)后，家兔無法站立或爬行，對側(cè)肢體對有害刺激反應(yīng)較差。腦CT顯示基底神經(jīng)節(jié)呈橢圓形或圓形高密度，提示腦出血模型造模成功，見圖1A。MIS組及MIS+MET組治療后血腫基本清除，見圖1B。

圖1 家兔頭顱CT顯示MIS前后顱內(nèi)血腫變化情況

2.2 各組Purdy評分變化

分組處理后的第3天和第7天，其他4組的評分均高于MC組（P＜0.001），第3天更明顯。處理后第3天，MET組、MIS組和MIS+MET組的評分低于MC組（P＜0.001或P＜0.05）；MIS+MET組的評分低于MET組和MIS組（P＜0.05）。處理后第7天，MET和MIS+MET組的評分低于MC組（P＜0.001或P＜0.05）；見圖2。

圖2 各組家兔神經(jīng)功能評分變化

2.3 不同時間點(diǎn)各組家兔腦含水量比較

處理后第3天和第7天，MC組、MET組和MIS組家兔血腫周圍腦組織含水量均高于NC組（P＜0.05），MIS+MET組僅第3天的含水量高于NC組（P＜0.05）；處理后第3天和第7天，MET組、MIS組和MIS+MET組含水量均低于MC組（P＜0.05）；處理后第3天，MIS+MET組含水量低于MET組（P＜0.05）；處理后第7天，MIS+MET組含水量低于MIS組（P＜0.05），見表1。

表1 各組家兔腦組織含水量比較（%,±s）

表1 各組家兔腦組織含水量比較（%,±s）

注：與NC組比較，①P＜0.05；與MC組比較，②P＜0.05；與MIS+MET組比較，③P＜0.05

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2.4 小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

NC組Iba-1陽性的小膠質(zhì)細(xì)胞，以細(xì)胞質(zhì)染色為主，細(xì)胞體積較小，突起較長，形態(tài)以“分支狀”為主，見圖3A；MC組可見活化的小膠質(zhì)細(xì)胞增多，表現(xiàn)為細(xì)胞體腫脹，體積增大，突起變短、變粗或缺乏突起（圖3B）。在離血腫較近的區(qū)域可見呈球形的“阿米巴樣”細(xì)胞，缺乏突起，含有大量的吞噬液泡（圖3a，白色箭頭）；并可見雙核小膠質(zhì)細(xì)胞（圖3a，黑色箭頭），未觀察到分支狀小膠質(zhì)細(xì)胞。離血腫較遠(yuǎn)區(qū)域可見腫脹的分支細(xì)胞具有較大的胞體，較短的突起（圖3b）。遠(yuǎn)離血腫的區(qū)域可見少量的分支小膠質(zhì)細(xì)胞（圖3c）。

圖3 各組小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)

2.5 腦組織TNF-α、IL-1β及Iba-1的表達(dá)

處理后的第3天和第7天，MC組、MET組、MIS組和MIS+MET組TNF-α、IL-1β及Iba-1的表達(dá)均多于NC組（P＜0.001或P＜0.05），MET組、MIS組和MIS+MET組TNF-α、IL-1β及Iba-1的表達(dá)均少于MC組（P＜0.001或P＜0.01或P＜0.05），MIS+MET組TNF-α、IL-1β及Iba-1的表達(dá)少于MET組和MIS組（P＜0.001或P＜0.01或P＜0.05），見圖4、5。

圖4 各組家兔腦組織TNF-α、IL-1β及Iba-1的表達(dá)（免疫組織化學(xué)染色，×400）

圖5 各組家兔TNF-α、IL-1β及Iba-1表達(dá)情況比較

3 討論

自發(fā)性腦出血的最佳治療方法一直是臨床爭論的熱點(diǎn)之一。最近的研究表明，微創(chuàng)立體定向穿刺治療安全、可行，提高了血腫清除率，改善了患者的預(yù)后[4-6]。Tan等[9,10]的動物實(shí)驗(yàn)表明，微創(chuàng)清除術(shù)可以有效上調(diào)血腦屏障緊密連接蛋白、下調(diào)金屬基質(zhì)蛋白酶等的表達(dá)，改善血腦屏障通透性及腦出血后的腦水腫，改善預(yù)后。臨床前和臨床試驗(yàn)的新興研究表明二甲雙胍具有抗炎作用，它可通過AMPK依賴性和非依賴性途徑抑制NF-κB信號通路來延緩炎癥反應(yīng)[11]，降低炎性因子TNF-α、IL-6和IL-1β的表達(dá)，誘導(dǎo)抗炎細(xì)胞因子IL-4和IL-10的產(chǎn)生[12]。Qi等[13]還發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍可抑制腦出血誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，減輕炎癥反應(yīng)，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，腦出血后第3天，腦組織水腫最嚴(yán)重，Iba-1和炎性因子TNF-α、IL-1β的表達(dá)明顯升高；經(jīng)微創(chuàng)手術(shù)聯(lián)合二甲雙胍干預(yù)后的第3、7天，可見腦組織水腫減輕，TNF-α、IL-1β及Iba-1的表達(dá)明顯降低，神經(jīng)評分改善。

TNF-α和IL-1β是腦出血炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)，可加重血腦屏障的破壞，與腦出血炎癥、腦水腫的形成有關(guān)。大腦TNF-α和IL-1β主要來源于活化的小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元。TNF-α可通過改變細(xì)胞骨架、緊密連接蛋白的表達(dá)和絲氨酸蛋白酶的產(chǎn)生降低血腦屏障的穩(wěn)定性，最終導(dǎo)致腦水腫和炎細(xì)胞浸潤[14]。小膠質(zhì)細(xì)胞是腦內(nèi)巨噬細(xì)胞，是最早對腦出血做出反應(yīng)的膠質(zhì)細(xì)胞，并導(dǎo)致腦出血后的炎性損傷[15,16]。小膠質(zhì)/巨噬細(xì)胞活化過程中可分為促炎型和抗炎型，可動態(tài)改變表型[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，在腦出血后第3天，在用小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物Iba-1標(biāo)記的腦組織中，Iba-1的表達(dá)明顯增加，可見各種形態(tài)的小膠質(zhì)細(xì)胞，這與之前報(bào)道的損傷后變化一致[18]，其形態(tài)學(xué)變化可能反映小膠質(zhì)細(xì)胞功能的變化。雖然Iba-1標(biāo)記物可用來識別小膠質(zhì)細(xì)胞，但它不能區(qū)分小膠質(zhì)細(xì)胞的亞型，也不能區(qū)分小膠質(zhì)細(xì)胞和單核/巨噬細(xì)胞。本課題組正在探索其他標(biāo)記，以區(qū)分不同亞型的小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。

綜上所述，微創(chuàng)清除術(shù)聯(lián)合二甲雙胍能減輕家兔腦出血后的神經(jīng)損傷，減輕腦水腫，可能是通過降低炎癥因子TNF-α、IL-1β的表達(dá)，并調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)及功能，抑制其過度激活完成的。這為臨床治療腦出血患者提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。