簡(jiǎn)詠男 鄭文蘭

[摘要] 目的 探討人輸卵管妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞體外培養(yǎng)的方法與鑒定。 方法 取在貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科住院部住院的早期輸卵管妊娠3例患者的絨毛組織，采用膠原酶-胰酶混合消化法消化細(xì)胞，差速貼壁法純化分離細(xì)胞，最后通過(guò)免疫熒光共聚焦方法對(duì)培養(yǎng)出的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞鑒定。 結(jié)果 免疫熒光雙標(biāo)記染色檢測(cè)到角蛋白與波形蛋白共表達(dá)。 結(jié)論 通過(guò)顯微鏡和免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞外形和骨架，初步判定該細(xì)胞可能為滋養(yǎng)細(xì)胞。

[關(guān)鍵詞] 滋養(yǎng)細(xì)胞;原代培養(yǎng);細(xì)胞鑒定;胎盤(pán)絨毛;胰酶消化

[中圖分類(lèi)號(hào)] R711 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A ? ? ? ? ?[文章編號(hào)] 1673-7210（2020）07（a）-0008-04

[Abstract] Objective To explore the methods and identification of tubal pregnancy trophoblasts in vitro. Methods The villi of 3 patients with early tubal pregnancy admitted to the Department of Gynecology， the First Affiliated Hospital of Guizhou University of Chinese Medicine were taken. Collagenase-trypsin mixed digestion method was used to digest cells， and differential adherence method was used to purify and isolate cells. Finally， the cells were identified by immunofluorescence confocal method. Results Co-expression of keratin and vimentin was detected by immunofluorescence double-labeling staining. Conclusion Microscope and immunofluorescence can detect cell shape and skeleton. It is preliminarily determines that the cell may be a trophoblast cell.

[Key words] Trophoblast cell; Primary culture; Cell identification; Placental villi; Trypsin digestion

近年來(lái)，異位妊娠發(fā)病率呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)，且逐年上升，為保留治療后輸卵管的完整性，提高今后的再次受孕率，中藥治療因其副作用小而備受人們關(guān)注，且在臨床治療中也取得了滿意的效果，但其機(jī)制研究尚處于初級(jí)階段。由于在人體無(wú)法進(jìn)行相關(guān)的在體研究，因此輸卵管妊娠絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞的體外培養(yǎng)便成為進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究的前提。本研究將早期的人輸卵管妊娠患者的絨毛組織進(jìn)行體外培養(yǎng)，為后期輸卵管妊娠疾病的相關(guān)研究提供較好的模型，為推動(dòng)中藥治療異位妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病提供良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 絨毛組織

選取在貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科住院部住院的早期輸卵管妊娠患者3例，妊娠周數(shù)為孕5～8周，平均（6.33±0.58）周;孕婦年齡20～30歲，平均（26.67±2.08）歲;無(wú)其他疾病;未經(jīng)藥物治療;直接手術(shù)的輸卵管妊娠患者的新鮮絨毛組織。患者本人對(duì)本研究知情同意。

1.2 主要試劑及儀器

膠原酶Ⅰ（貨號(hào)：C8140）、DAPI染色液（貨號(hào)：C0065）、5%BSA封閉液（貨號(hào)：SW3015）、曲拉通X-100（貨號(hào)：T8200）：北京索萊寶生物科技有限公司;PBS緩沖液（貨號(hào)：SH30256.01）、胰酶消化液（貨號(hào)：SH30042）、胎牛血清（貨號(hào)：SH30406.02E）：美國(guó)HyClone;異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的鼠抗人角蛋白18（貨號(hào)：bs-2043R）、熒光素（Cy3）標(biāo)記的鼠抗人波形蛋白（貨號(hào)：bs-0756R）：北京博奧森生物技術(shù)有限公司;4%多聚甲醛（貨號(hào)：DF0135）：安徽雷根生物技術(shù)有限公司;倒置顯微鏡（型號(hào)：BX41TF）：日本Olympus;激光共聚焦顯微鏡（型號(hào)：DM4000B）：德國(guó)Leica;高速冷凍離心機(jī)（型號(hào)：Microfuge 20R）：美國(guó)Beckman Coulter。

1.3 滋養(yǎng)細(xì)胞的取材及培養(yǎng)

根據(jù)文獻(xiàn)[1]將輸卵管妊娠的絨毛組織在無(wú)菌條件下置于含雙抗（青霉素、鏈霉素）的PBS中，取樣1 h內(nèi)冰上運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室。于超凈工作臺(tái)內(nèi)，PBS反復(fù)洗滌絨毛組織以去除血污，眼科剪將組織剪碎至1 mm3左右，收集至離心管中，1000 r/min，離心10 min，棄上清，加入0.125%胰酶+0.1%Ⅰ型膠原酶1∶1復(fù)合消化液，37℃水浴中將其消化20 min。消化完畢后加入10%胎牛血清（FBS）終止消化，離心，棄上清。加入含20%FBS的培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，反復(fù)吹打混勻后接種于培養(yǎng)瓶中，放置在37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。24 h首次換液，以后每隔48 h常規(guī)換液 1次。

1.4 差異貼壁法分離滋養(yǎng)細(xì)胞

當(dāng)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至80%～90%時(shí)，吸去培養(yǎng)液，PBS洗后加入0.25%胰酶消化細(xì)胞并置于二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育5 min，加入10%FBS終止消化，1000 r/min，離心5 min，棄上清。鋪入新的培養(yǎng)瓶中，加20%FBS培養(yǎng)液3 mL，輕輕吹打后，于二氧化碳培養(yǎng)箱中靜置20 min，采用差速貼壁法將其進(jìn)行分離純化，在顯微鏡下觀察到最先貼壁的為成纖維細(xì)胞，滋養(yǎng)細(xì)胞大多為懸浮細(xì)胞，將其懸浮的培養(yǎng)液收集于另一培養(yǎng)瓶中，重復(fù)5次后鋪瓶，放置于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.5 倒置顯微鏡觀察

觀察細(xì)胞貼壁時(shí)間、細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)、原代生長(zhǎng)周期。待細(xì)胞長(zhǎng)到80%～90%時(shí)，用胰酶消化傳代。

1.6 人輸卵管妊娠絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞的鑒定

將第4次傳代的滋養(yǎng)細(xì)胞，計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，以2×106個(gè)/mL的濃度接種于激光共聚焦皿中，24 h后，用PBS清洗，加入4%多聚甲醛，室溫下固定15 min。PBS洗3次后，用0.1%曲拉通X-100增加細(xì)胞膜通透性，PBS洗滌細(xì)胞3次，加入5%牛血清白蛋白（BSA）室溫封閉1 h;去血清后滴加1∶1混合的異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記抗人細(xì)胞角蛋白18（CK18）、熒光素（CY3）標(biāo)記抗人波形蛋白各25 μL，4℃孵育過(guò)夜。次日取出后復(fù)溫，用PBS重復(fù)洗滌細(xì)胞3次后滴加DAPI染核，避光室溫下染色后加入PBS沖洗3次，激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)該體外培養(yǎng)的細(xì)胞角蛋白和波形蛋白的表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 滋養(yǎng)細(xì)胞一般形態(tài)

原代培養(yǎng)滋養(yǎng)細(xì)胞接種后于倒置顯微鏡下可見(jiàn)大量圓形細(xì)胞懸浮存在，1 h后細(xì)胞開(kāi)始慢慢貼壁，有個(gè)別細(xì)胞開(kāi)始伸展，24 h后可明顯見(jiàn)大部分細(xì)胞已經(jīng)貼壁，48 h后大部分細(xì)胞伸展，到第9、10天細(xì)胞的數(shù)量明顯變多，可見(jiàn)細(xì)胞呈扁平不規(guī)則的三角形或多邊形，片狀平鋪生長(zhǎng)，核較圓，胞質(zhì)豐富，部分細(xì)胞連接成片，少量細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形。見(jiàn)圖1。14 d長(zhǎng)到80%～90%可傳代，傳代后3～4 d為1代。

2.2 人輸卵管妊娠絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞的鑒定

免疫熒光雙標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果顯示：在細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)角蛋白和波形蛋白共表達(dá)的黃色部位。見(jiàn)圖2（封四）。

3 討論

目前，細(xì)胞體外培養(yǎng)的技術(shù)已成為研究滋養(yǎng)細(xì)胞相關(guān)疾病的重要手段，其關(guān)鍵步驟在于人滋養(yǎng)細(xì)胞體外分離的培養(yǎng)成功。妊娠期滋養(yǎng)細(xì)胞體外培養(yǎng)分為原代培養(yǎng)、分離純化、傳代培養(yǎng)和細(xì)胞鑒定4個(gè)階段[2]。

本研究選取20～30歲女性，5～8周內(nèi)早期輸卵管妊娠患者。為提取活力較強(qiáng)的滋養(yǎng)細(xì)胞，應(yīng)盡可能地選擇青年女性[3]，以便提高滋養(yǎng)細(xì)胞體外培養(yǎng)的成功率。

取回胎盤(pán)組織后，用PBS緩沖液認(rèn)真清洗，清除明顯的血塊及筋膜組織后，剪取絨毛，使其絨毛組織完全剪碎至糊狀后進(jìn)行消化分離。目前原代培養(yǎng)的分離方法主要分為組織塊法和酶消化法2種[4]。組織貼塊法操作簡(jiǎn)單，但原代細(xì)胞生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)，需20 d左右，細(xì)胞純度低且容易污染[5]，因此，該方法不建議用于滋養(yǎng)細(xì)胞的體外培養(yǎng)。胰蛋白酶消化法包括單一胰蛋白酶消化法和復(fù)合酶消化法，一般的酶消化法雖然能夠快速地得到大量的細(xì)胞，但容易混入成纖維細(xì)胞且在反復(fù)消化細(xì)胞的同時(shí)對(duì)細(xì)胞的損傷比較大[6]，而膠原酶比較溫和，還可以幫助分解間質(zhì)細(xì)胞，但對(duì)上皮細(xì)胞影響不大[7]。故本研究選用膠原酶-胰酶混合消化法來(lái)消化細(xì)胞。

滋養(yǎng)層細(xì)胞的分離無(wú)論是采用組織塊法或是酶消化法，細(xì)胞懸液里面都會(huì)含有血管內(nèi)皮細(xì)胞、Hofbauer細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及血細(xì)胞等[8]，故排除其他雜質(zhì)細(xì)胞的污染是純化滋養(yǎng)細(xì)胞的關(guān)鍵。因血管內(nèi)皮細(xì)胞、Hofbauer細(xì)胞及血細(xì)胞等不屬于貼壁細(xì)胞，多次換液中就可以去除。而成纖維細(xì)胞的貼壁能力較滋養(yǎng)細(xì)胞強(qiáng)，其具有先貼壁的特性，為提高其純化度及分離細(xì)胞的簡(jiǎn)便，本研究采用差速貼壁法。也有很多研究者采用的是Percoll密度梯度分離法，其中，最為成熟的是Kliman等[9]發(fā)現(xiàn)的Percoll密度梯度分離法。Percoll本質(zhì)上是一種經(jīng)聚乙烯吡喀烷酮化學(xué)加工的硅膠顆粒，雖然其具有密度高、不穿透細(xì)胞、無(wú)毒害等特點(diǎn)[10]，但該方法操作繁瑣、試劑消耗成本大，在普通實(shí)驗(yàn)室難以推廣。

最后，所獲得的細(xì)胞是不是滋養(yǎng)細(xì)胞還需要做細(xì)胞鑒定。本研究發(fā)現(xiàn)，該細(xì)胞在顯微鏡下呈不規(guī)則三角形或多邊形，平鋪整個(gè)視野，其生長(zhǎng)形態(tài)與滋養(yǎng)細(xì)胞相吻合。但顯微鏡下細(xì)胞的一般形態(tài)描述不能用于細(xì)胞定性，細(xì)胞鑒定還需檢測(cè)細(xì)胞骨架。目前滋養(yǎng)細(xì)胞的鑒定沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，細(xì)胞角蛋白與波形蛋白的分析比較，是界內(nèi)較為認(rèn)可的鑒別方法[11]。波形蛋白是間質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志蛋白[12]，而細(xì)胞角蛋白，因其獨(dú)特的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，是構(gòu)成上皮細(xì)胞骨架的特有蛋白[13]。徐娟等[14]研究發(fā)現(xiàn)，滋養(yǎng)細(xì)胞只特異性表達(dá)細(xì)胞角蛋白。故可借此來(lái)辨別滋養(yǎng)細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞等其他細(xì)胞。

本研究采用了直接免疫熒光雙標(biāo)記染色法檢測(cè)細(xì)胞中角蛋白和波形蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，在細(xì)胞質(zhì)中，存在CK18和波形蛋白共表達(dá)部位。近年來(lái)文獻(xiàn)報(bào)道[15]顯示，上皮細(xì)胞也可以表達(dá)波形蛋白，因此，波形蛋白表達(dá)陽(yáng)性并不能否認(rèn)該體外培養(yǎng)的細(xì)胞不是滋養(yǎng)細(xì)胞，有可能該細(xì)胞在體外培養(yǎng)的過(guò)程中，細(xì)胞性狀發(fā)生了改變，向間質(zhì)細(xì)胞方向轉(zhuǎn)化了。近些年也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在一些滋養(yǎng)細(xì)胞中，也存在波形蛋白表達(dá)陽(yáng)性[16-17]。但因文獻(xiàn)時(shí)間較久，故此體外培養(yǎng)的滋養(yǎng)細(xì)胞未用于后期的實(shí)驗(yàn)研究。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[18]體外培養(yǎng)所得的原代細(xì)胞產(chǎn)量高，生長(zhǎng)周期短，7 d左右可生長(zhǎng)成片，本研究結(jié)果顯示原代細(xì)胞經(jīng)過(guò)14 d培養(yǎng)后才可進(jìn)行初次傳代，與文獻(xiàn)報(bào)道略有出入。筆者分析其細(xì)胞活力、胰酶濃度、消化時(shí)間、實(shí)驗(yàn)室環(huán)境及操作人員均可能成為影響細(xì)胞生長(zhǎng)的因素，均可能影響其研究結(jié)果，每一步驟掌控不好都有可能造成活細(xì)胞的變性。在分離純化的過(guò)程中，有些組織和細(xì)胞耐受性較差，也會(huì)損害細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，從而影響細(xì)胞的生長(zhǎng)時(shí)間或貼壁細(xì)胞變性[19-22]。因此在研究中需注意的一些問(wèn)題：①取材患者的年齡越小，組織越新鮮，更容易增加培養(yǎng)成功率，獲得數(shù)量更多更純的滋養(yǎng)細(xì)胞[23]。②獲取組織時(shí)，絨毛分支稠且送往實(shí)驗(yàn)室時(shí)間短，則培養(yǎng)時(shí)更易得到數(shù)量更多活力更好的細(xì)胞。③使用胰蛋白酶消化傳代時(shí)，應(yīng)注意胰酶的用量，而且消化時(shí)間不能太長(zhǎng)，以免喪失部分細(xì)胞;其次，細(xì)胞傳代應(yīng)保持同等時(shí)間間隔。④胰蛋白酶應(yīng)時(shí)用時(shí)配，新鮮胰蛋白酶消化細(xì)胞的能力強(qiáng)于配制時(shí)間長(zhǎng)的胰蛋白酶。⑤滋養(yǎng)細(xì)胞貼壁時(shí)間較長(zhǎng)，首次換液時(shí)間一般為16～24 h，以后常規(guī)換液時(shí)間最好不超過(guò)2 d，以免培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分耗盡造成細(xì)胞死亡。⑥絨毛組織越碎，細(xì)胞消化就會(huì)更加充分。

綜上，結(jié)合顯微鏡和免疫熒光的結(jié)果，初步判定此體外培養(yǎng)的細(xì)胞可能為滋養(yǎng)細(xì)胞。如何獲得數(shù)量豐富且純度較高的滋養(yǎng)細(xì)胞仍是目前研究的熱點(diǎn)，如能進(jìn)一步研究出該細(xì)胞更多的生長(zhǎng)特性和其他標(biāo)志性的指標(biāo)，將為各種滋養(yǎng)細(xì)胞相關(guān)疾病提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為廣大患者帶來(lái)福音。

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（收稿日期：2020-01-08）