陳慶鑰 林水森 謝志新

[摘要] 目的 研究欖綠粗葉木總黃酮的最佳提取條件，同時(shí)檢測(cè)其抗氧化活性。 方法 設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化;采用DPPH自由基、超氧陰離子自由基和羥基自由基清除能力評(píng)價(jià)抗氧化活性。 結(jié)果 最佳提取條件為提取時(shí)間60 min、料液比 1∶40 （g/mL）、乙醇濃度40%。欖綠粗葉木總黃酮對(duì)DPPH自由基、超氧陰離子自由基和羥基自由基具有較強(qiáng)的清除能力，在一定范圍內(nèi)清除能力與濃度存在量效關(guān)系。 結(jié)論 欖綠粗葉木總黃酮具有較強(qiáng)的抗氧化活性。

[關(guān)鍵詞] 欖綠粗葉木;總黃酮;提取;抗氧化

[中圖分類號(hào)] R284 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A ? ? ? ? ?[文章編號(hào)] 1673-7210（2020）07（a）-0031-04

[Abstract] Objective To study the optimum extraction condition and the antioxidant activity of total flavonoids from lasianthus lancilimbus. Methods The orthogonal experiment was designed to optimize the extraction process. The antioxidant activity was evaluated by DPPH free radical， superoxide anion radical and hydroxyl free radical scavenging ability. Results The optimum extraction condition was obtained as follows： the extraction time was 60 min， the solid-liquid ratio of 1∶40 （g/mL）， ethanol concentration was 40%. The scavenging abilities for DPPH free radical， superoxide anion radical and hydroxyl free radical were obviously related to the concentrations. Conclusion The total flavonoids from lasianthus lancilimbus have strong antioxidant activities.

[Key words] Lasianthus lancilimbus; Total flavonoids; Extraction; Antioxidant

欖綠粗葉木為茜草科粗葉木屬的一個(gè)變種，具有抑制病菌、保護(hù)肝臟、抗腫瘤等功能[1-4]，目前對(duì)欖綠粗葉木活性成分的研究較少。黃酮作為一類活性物質(zhì)，具有抗病毒、抗氧化、抗衰老、抗腫瘤的作用[5-13]。本研究以欖綠粗葉木為原料，對(duì)黃酮類成分的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并研究其抗氧化能力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

欖綠粗葉木購(gòu)自福建省寧化縣草藥市場(chǎng)，經(jīng)泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校中藥教研室黃秀珍教授鑒定為茜草科粗葉木屬植物欖綠粗葉木（Lasianthus lancilimbus）的干燥莖。

羥自由基測(cè)試盒，南京建成生物工程研究所，批號(hào)20191030;超氧陰離子自由基測(cè)試盒，南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20191026;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：Y16M9S61523，純度≥98%。

1.2 主要儀器

BL10-40AA型超聲波清洗機(jī)，無(wú)錫沃信儀器有限公司;A590型紫外分光光度儀，上海翱藝儀器有限公司。

1.3 提取工藝流程

將欖綠粗葉木粉碎過(guò)60目篩，稱取1 g粉末，加入乙醇溶液，超聲波（25℃，100 W）提取后，抽濾，濾液濃縮至無(wú)醇味后用80%乙醇定容至100 mL容量瓶。

1.4 含量測(cè)定

精密稱取蘆丁10 mg，用80%乙醇定容于100 mL容量瓶中，搖勻。分別移取1、2、3、4、5 mL于10 mL容量瓶中，加80%乙醇至5 mL，加入5%亞硝酸鈉0.6 mL，搖勻，靜置6 min。加入10%硝酸鋁0.6 mL，搖勻，靜置6 min。加入4%氫氧化鈉3 mL，定容至刻度，搖勻，靜置15 min。選擇510 nm為吸收波長(zhǎng)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y = 8.4281X-0.008，R2 = 0.9995。精密吸取2 mL提取液，測(cè)定含量。

1.5 提取工藝的單因素試驗(yàn)

依次改變提取時(shí)間、乙醇濃度和料液比，按照“1.3”項(xiàng)下方法提取，按照“1.4”項(xiàng)下方法測(cè)定含量。

1.6 提取工藝的正交試驗(yàn)

設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)方案見(jiàn)表1。

1.7 抗氧化活性測(cè)定

1.7.1 DPPH自由基清除能力測(cè)定 ?移取2 mL不同濃度的黃酮溶液，加入2 mL 0.25 mmol/L的DPPH乙醇溶液，搖勻，陰暗處放置30 min，在517 nm處測(cè)量吸光度值A(chǔ)1。樣品與乙醇混勻，測(cè)A2;DPPH乙醇溶液與乙醇混勻，測(cè)A3。清除率（%）=[1-（A1-A2）/A3]×100%。

1.7.2 羥自由基清除能力測(cè)定 ?采用Feton法[14-18]，測(cè)定羥自由基清除率。

1.7.3 超氧陰離子自由基清除能力測(cè)定 ?采用鄰苯三酚自氧化法[19-23]，測(cè)定超氧陰離子自由基清除率。

2 結(jié)果

2.1 提取工藝的單因素試驗(yàn)結(jié)果

提取率在乙醇濃度50%時(shí)達(dá)到最大值。見(jiàn)圖1。提取率在料液比1∶40時(shí)達(dá)到最大值。見(jiàn)圖2。提取率在超聲80 min時(shí)達(dá)到最大值。見(jiàn)圖3。

2.2 提取工藝的正交試驗(yàn)結(jié)果

各因素的影響程度為乙醇濃度>料液比>超聲時(shí)間。見(jiàn)表2。3個(gè)因素對(duì)提取率無(wú)顯著影響。見(jiàn)表3。綜合考慮，A2B1C1是黃酮提取的最優(yōu)組合。因此，最佳提取工藝為料液比1∶40，乙醇濃度為40%，超聲時(shí)間60 min。

2.3 最佳工藝驗(yàn)證

按最佳提取工藝提取3次，提取率分別為1.048%、1.051%、1.054%，均值為1.051%。數(shù)值接近，提示該工藝穩(wěn)定可靠。

2.4 抗氧化活性

2.4.1 對(duì)DPPH自由基的清除能力 ?在濃度0.04～0.1 mg/mL范圍內(nèi)，清除率隨著濃度增加而增大，呈線性上升。當(dāng)濃度達(dá)到0.15 mg/mL時(shí)，清除能力是同等濃度下抗壞血酸的92%。經(jīng)二次多項(xiàng)擬合，IC50為0.057 mg/mL。見(jiàn)圖4。

2.4.2 對(duì)羥基自由基的清除能力 ?隨著質(zhì)量濃度的升高，清除率從12.3%上升到71.1%。在濃度為1.0 mg/mL時(shí)，清除率高達(dá)73.5%。經(jīng)二次多項(xiàng)擬合，IC50為0.706 mg/mL。在實(shí)驗(yàn)濃度區(qū)間內(nèi)，總黃酮的清除能力低于抗壞血酸。見(jiàn)圖5。

2.4.3 對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力 ?黃酮濃度在0.1～1.0 mg/mL范圍內(nèi)，清除率從10.2%增加到54.5%。經(jīng)二次多項(xiàng)擬合，IC50為0.434 mg/mL。在相同質(zhì)量濃度下，抗壞血酸表現(xiàn)出更強(qiáng)的清除能力。見(jiàn)圖6。

3 討論

本研究通過(guò)正交試驗(yàn)確定了欖綠粗葉木總黃酮的最佳提取條件為料液比1∶40（g/mL）、提取時(shí)間60 min、乙醇濃度40%。欖綠粗葉木總黃酮對(duì)DPPH自由基、超氧陰離子自由基和羥基自由基具有較強(qiáng)的清除能力，其IC50分別為0.057、0.706、0.434 mg/mL。在一定范圍內(nèi)，清除能力與濃度存在量效關(guān)系。

[參考文獻(xiàn)]

[1] ?溫?fù)P敏，萬(wàn)端靜，謝永華，等.欖綠粗葉木莖甲醇提取物對(duì)人食管癌EC-9706細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制探討[J].山東醫(yī)藥，2015，55（40）：11-13.

[2] ?謝永華，王冠明，吳梅姐，等.欖綠粗葉木水提物體外抗菌效果的初步探討[J].安徽衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào)，2016，15（2）：145-146.

[3] ?梁青龍，郭婷婷，溫?fù)P敏.欖綠粗葉木粗多糖提取工藝及對(duì)H22肝癌細(xì)胞毒性影響[J].系統(tǒng)醫(yī)學(xué)，2016，1（11）：114-117.

[4] ?程晶，溫?fù)P敏，謝永華.欖綠粗葉木莖甲醇提取物對(duì)CCl4致小鼠肝損傷的保護(hù)作用[J].中南藥學(xué)，2016，14（2）：122-125.

[5] ?張迪.響應(yīng)面法優(yōu)化馬鞭草中總黃酮閃式提取工藝及其體外抗氧化活性[J].食品工業(yè)科技，2019，40（3）：173-178，184.

[6] ?武謙虎，徐衛(wèi)東，李偉東，等.空心蓮子草總黃酮對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞HBsAg和HBeAg表達(dá)的影響[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2018，15（1）：34-37.

[7] ?劉正歡，廖邦華，夏超，等.荷葉總黃酮抑制前列腺癌細(xì)胞增殖的研究[J].中國(guó)醫(yī)藥，2018，13（12）：1865-1869.

[8] ?翁騰玉，郭硯.水母雪蓮黃酮對(duì)中波紫外線輻射人永生化角質(zhì)細(xì)胞損傷的影響[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2018，15（1）：14-17.

[9] ?鄔衛(wèi)東，楊來(lái)秀，武俊婷，等.蒙藥材手掌參中總黃酮的提取工藝及抗氧化活性研究[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2017，14（28）：34-37.

[10] ?李燕，趙天明，黃麗榮，等.響應(yīng)面法優(yōu)化響鈴草總黃酮提取工藝及體外抗氧化活性研究[J].食品研究與開(kāi)發(fā)，2019，49（17）：79-84.

[11] ?孫朦，王鴻飛，李艷霞，等.辣木葉總黃酮提取工藝優(yōu)化及抗氧化能力研究[J].核農(nóng)學(xué)報(bào)，2018，32（9）：1772-1880.

[12] ?羅磊，張冰潔，朱文學(xué)，等.響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化超聲輔助提取金銀花葉黃酮工藝及其抗氧化活性[J].食品科學(xué)，2016，37（6）：13-19.

[13] ?刁靜靜，曹榮安，李朝陽(yáng)，等.樹(shù)莓根黃酮類化合物的抗氧化活性及其結(jié)構(gòu)分析[J].中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2019， 32（12）：1350-1356.

[14] ?任秋蓉，王亞男，王玥，等.密花香薷總黃酮體外抗氧化及抗腫瘤活性研究[J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2017，29（1）：14-21.

[15] ?趙靜，李玉琴，王芳喬，等.6種黃酮類化合物清除超氧陰離子自由基能力及其構(gòu)效關(guān)系[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2014， 11（29）：7-10，14.

[16] ?曹培杰，崔晉，馬艷弘.桑葚籽黃酮超聲酶解提取工藝優(yōu)化及其抗菌、抗氧化活性[J].食品工業(yè)科技，2019，40（2）：175-182.

[17] ?閆蕊，趙樺.黃花油點(diǎn)草總黃酮超聲提取工藝的響應(yīng)面優(yōu)化及抗氧化性分析[J].食品工業(yè)科技，2018，39（10）：190-196，203.

[18] ?陳飛，何先元，周卯勤，等.超聲輔助提取四齒四棱草中總黃酮及其抗氧化活性[J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2016， 28（1）：96-101，70.

[19] ?陳琳琳，謝志新，程晶，等.羊棲菜多糖提取物及其潤(rùn)膚霜的保濕和抗氧化活性[J].日用化學(xué)工業(yè)，2018，48（1）：31-36.

[20] ?郭瑩，周穎，畢海丹，等.響應(yīng)面優(yōu)化超聲波-微波協(xié)同提取鳳眼蓮黃酮工藝及其不同部位黃酮抗氧化活性分析[J].食品工業(yè)科技，2019，40（1）：168-174，180.

[21] ?趙炎軍，蔡田恬，錢松，等.金蕎麥總黃酮提取工藝優(yōu)化研究[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生，2018，56（34）：34-37，42.

[22] ?陳琳琳，謝志新，魏東紅，等.泉州灣3種大型海藻不同提取物的抗氧化活性比較[J].食品研究與開(kāi)發(fā)，2017， 38（23）：18-25.

[23] ?謝志新，陳琳琳，張文州，等.八角茴香揮發(fā)油超聲輔助提取及抗氧化性研究[J].中國(guó)調(diào)味品，2018，43（4）：124-128.

（收稿日期：2019-12-24）