趙穎 王楠 陸安祥 馮曉元 郭曉軍 欒云霞

（1. 北京農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究中心 農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風險評估實驗室（北京），北京 100097；2. 錦州醫(yī)科大學，錦州121001）

適配體（Aptamer）是通過指數(shù)富集的配體進化系統(tǒng)（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）獲得的單鏈DNA，具有穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)［1］，典型的結(jié)構(gòu)包括莖、凸環(huán)、發(fā)夾、假結(jié)體，三重體和G-四鏈體結(jié)構(gòu)等［2］。適配體通過構(gòu)象變化折疊成三維結(jié)構(gòu)，與目標物通過形狀互補、芳香化合物間的堆積作用、堿基堆積作用、靜電作用和氫鍵作用等方式穩(wěn)定結(jié)合［3］。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)近300個目標的適配體，包括離子（如Hg2+［4］）、真菌毒素［5］和分子［6］等。目前快速檢測常用的是抗體，由于在生產(chǎn)和純化過程中需嚴格控制，并且受操作環(huán)境、pH、溫度等條件的限制［7-8］，使得其對有著相似結(jié)構(gòu)的小分子快速準確識別也存在局限性。相比之下的適配體易于修飾和標記，靈敏度高，特異性好，成本低，親和力強，在環(huán)境監(jiān)測、醫(yī)學診斷和食品安全等領域中受到了越來越多的關(guān)注。

真菌毒素污染是農(nóng)產(chǎn)品、中藥、食物和飼料中普遍存在的問題［9］，毒素通過抑制蛋白質(zhì)合成、破壞巨噬細胞系統(tǒng)和削弱免疫功能，對人體健康造成危害。例如，黃曲霉毒素B1

［5］（Aflatoxin，AFB1）是目前人類發(fā)現(xiàn)的真菌中毒性最強的毒素，是由黃曲霉和寄生曲霉等產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，易對多種農(nóng)產(chǎn)品，如堅果、花生、玉米、谷物和動物飼料造成污染，被國際癌癥研究機構(gòu)列為一類致癌物［7］。赭曲霉毒素A［1］（Ochratoxin A，OTA）是植物源性食品中廣泛存在的一種由曲霉和青霉菌產(chǎn)生的真菌毒素。在食品、谷物和葡萄酒中有很高的化學穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性，對人體有害，易造成腎毒性、肝毒性以及淋巴和胃腸道損傷。近年來，真菌毒素的快速分析與鑒定、多類真菌毒素的同時檢測已成為研究人員的研究熱點［1，5，9-11］。毒素的定量分析目前已經(jīng)建立的方法包括：薄層色譜［12］（Thinlayer chromatography，TLC）、高效液相色譜［11，13-14］（High performance liquid chromatography，HPLC）、紫外可見［15］（Ultraviolet-visible，UV）、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜 法［16］（Liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）、熒光檢測器法［17-18］（Fluorescence detector，F(xiàn)LD）等實驗室內(nèi)檢測目標物的確證方法。這些分析檢測方法需要復雜的樣品制備過程、大型儀器的配備和專業(yè)的研究人員，因此，不能在現(xiàn)場進行快速檢測。開發(fā)用于現(xiàn)場檢測樣品中目標物的含量的便攜式、靈敏度高、操作簡單的快速檢測技術(shù)迫在眉睫。表1總結(jié)了適配體側(cè)流層析技術(shù)在真菌毒素方面的應用。

表1 適配體側(cè)流層析分析技術(shù)檢測不同的分析物

側(cè)流層析分析技術(shù)響應時間快速、簡單性且低成本使其成為現(xiàn)場檢測（Point-of-care testing，POCT）的理想選擇，已被應用于多種靶標的快速檢測，最常見和最成功的側(cè)流層析分析技術(shù)的產(chǎn)品是檢測尿液中是否存在人絨毛膜促性腺激素的膠體金側(cè)向?qū)游龇治黾夹g(shù)［28］。核酸適配體側(cè)流層析分析技術(shù)具有良好的魯棒性、特異性、靈敏度，能夠?qū)崿F(xiàn)低成本的快速檢測。該技術(shù)以硝酸纖維素膜為載體，樣品溶液滴加在樣品墊上，在毛細管作用下慢慢向吸水墊端滲移，通過適配體與靶標結(jié)合，并利用熒光、量子點等標記物質(zhì)呈現(xiàn)光學反應，可在T線和C線檢測到信號值。目前最廣泛應用的側(cè)流層析技術(shù)主要是基于抗體，但是，抗體的使用也會遇到一些問題，如抗體的生產(chǎn)周期很長，并且穩(wěn)定性較差，存在交叉反應。適配體比抗體小很多，可以在相同的納米金粒子或硝化纖維素膜表面被更好地固定。作為一種新型識別分子，核酸適配體為食品安全快速檢測技術(shù)的開發(fā)提供了新思路。以下綜述了熒光素、量子點、熒光微球、膠體金和酶等不同信號標記適配體，通過光學、比色、表面增強拉曼散射和基于智能手機等不同的檢測方法在側(cè)流層析分析技術(shù)中的應用。

1 適配體側(cè)流層析分析技術(shù)的不同類型：

側(cè)流層析技術(shù)既可以用肉眼進行定性檢測目標物，也可以用簡易的閱讀器進行定量檢測目標物。根據(jù)試紙條的原理不同可以分為夾心型、競爭型兩種類型。

1.1 夾心型

采用夾心型測定時，以標記信號物的適配體為信號探針，靶標的另一條適配體或抗體固定在硝酸纖維素膜上為捕獲探針，要求信號探針和捕獲探針分別以不同的結(jié)合位點與靶標結(jié)合，在目標物存在的情況下與兩個DNA探針形成夾心結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定復合物，隨著靶標濃度的增加，檢測線（T線）的信號強度不斷增強（圖1）。過量的信號探針繼續(xù)滲移到質(zhì)控線（C線）并與其互補鏈結(jié)合。目前，采用夾心法的適配體種類很少，如腺苷［22］和OTA［13］等少量的靶標分子有過相關(guān)報道。Zhu等［29］利用待檢測靶標的兩條識別不同表面結(jié)合位點的適配體，建立了雙適配體夾心型側(cè)流層析分析技術(shù)，實現(xiàn)了對腺苷的有效檢測。

1.2 競爭型

采用競爭型測定時，以標記信號物的適配體為信號探針，在T線處固定的捕獲探針為適配體的互補鏈或靶標的半抗原（如AFB1-BSA［31］），靶標與適配體互補鏈同時競爭適配體，T線處的信號強度與靶標含量成負相關(guān)性（圖2）。目前，研究者傾向于采用競爭型側(cè)流層析技術(shù)的應用，因為其只需一條合適的適配體就可進行實驗研究，降低了實驗的難度。2016年，Zhou等［32］成功研發(fā)了一種基于競爭法在現(xiàn)場快速檢測中藥黃芪中OTA的適配體側(cè)流層析技術(shù)，通過優(yōu)化膠體金-適配體結(jié)合物濃度的稀釋倍數(shù)，緩沖液成分和比例，甲醇的濃度等條件，提高試紙條的靈敏度。該膠體金適配體側(cè)流層析檢測OTA的檢測時間為15 min，檢測限為1 μg/L，表明該方法具有較高的選擇性和靈敏度，結(jié)果準確可靠，可作為一種快速、經(jīng)濟、魯棒的復雜基質(zhì)中微量毒素的現(xiàn)場檢測技術(shù)。

2 基于不同檢測方法的側(cè)流層析分析技術(shù)

2.1 光學檢測的側(cè)流層析生物傳感器

2.1.1 熒光側(cè)流層析分析技術(shù) 基于熒光的適配體側(cè)流層析分析技術(shù)具有選擇性好、靈敏度高、操作方便、快速等優(yōu)點。熒光染料存在一些固有的問題，如使用壽命短、穩(wěn)定性差等，限制了熒光染料在現(xiàn)場分析中的應用。有關(guān)標記熒光的適配體側(cè)流層析分析技術(shù)檢測AFB1的報道中［31］，靶標與檢測線上的適配體互補鏈形成競爭關(guān)系，當存在AFB1時，適配體先與AFB1結(jié)合形成復合物，T線的信號強度與靶標含量呈負相關(guān)性，多余的游離Cy5修飾的DNA探針滲流到C線上，被捕獲探針捕獲，并觀察熒光信號；在沒有靶標的情況下，Cy5-DNA與檢測線上的DNA互補鏈雜交。Zhang等［33］選擇穩(wěn)定性好、熒光強度高和發(fā)射波長范圍廣的熒光素Cy5作為信號標記物，建立了基于熒光測流層析技術(shù)檢測玉米中OTA的方法（圖3）。該方法定量檢測OTA的線性范圍是1 ng/mL-1 000 ng/mL，檢測限為0.4 ng/mL，在玉米樣品中的加標回收率為96.4%-104.7%，相對標準偏差為4.8%-6.4%，說明該方法具有較好的靈敏度、準確度和穩(wěn)定性，為谷物中OTA的檢測提供了新型快速的檢測技術(shù)手段。

圖1 基于夾心型適配體側(cè)流層析分析技術(shù)的反應原理圖［30］

圖2 基于競爭型適配體側(cè)流層析分析技術(shù)的反應原理圖［30］

圖3 基于熒光側(cè)流層析分析技術(shù)檢測OTA的示意圖［33］

2.1.2 分子發(fā)夾/熒光微球的側(cè)流層析分析技術(shù) 基于側(cè)流層析分析技術(shù)的分子發(fā)夾/熒光微球定量檢測，結(jié)合墊上包被熒光微球標記的DNA分子發(fā)夾探針的“環(huán)”，檢測線處包被一段與DNA分子發(fā)夾莖的序列互補的一段堿基序列。一條含AFB1適配體的分子發(fā)夾與熒光微球偶聯(lián)后，形成的標記探針被噴涂在側(cè)流層析的結(jié)合墊上［34］。如圖4所示，當待測樣本中含有AFB1時，AFB1先與結(jié)合墊處標記探針中的AFB1適配體結(jié)合，同時，標記探針中的DNA分子發(fā)夾“莖”的雙鏈被打開，AFB1與標記探針形成的復合物滲移到檢測線時，被檢測線上的核苷酸序列捕獲，出現(xiàn)亮線反應。周子明等［34］利用該原理，通過“OFF-ON”的光信號，構(gòu)建了一種AFB1檢測的測流層析技術(shù)，實現(xiàn)了對AFB1高靈敏的檢測。AFB1在0.1-50 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，呈良好的線性關(guān)系，檢測限（S/N=3）達0.05 μg/L，可實現(xiàn)對實際樣品中AFB1的含量分析，具有較為重要的實際應用和參考價值。肖理文［35］等研制了一種基于時間分辨熒光納米微球的玉米赤霉烯酮快速定量檢測的側(cè)流層析技術(shù)，并在糧食樣品中對其檢測性能進行了研究。該產(chǎn)品的最低檢出限為3.65 μg/kg，且該方法具有簡便快速、準確可靠、重復性好等特點，可用于不同糧食谷物飼料中玉米赤霉烯酮的快速定量檢測分析。熒光微球具有高信號值，線性范圍好，批間重復性好，適合待測物的快速定量檢測。

2.1.3 量子點側(cè)向流動層析技術(shù) 近年來，量子點［36］（Quantum dot，QDs）作為熒光標記有半峰寬窄、熒光壽命長、最大發(fā)射峰可調(diào)控等優(yōu)點。常見的高效熒光染料供體量子點有CdTe和CdSe/ZnS［37-38］。Richarte等［39］采用CdSe/ZnS/QDs作為標記信號，研發(fā)了一種在谷物中同時檢測DON、ZEN和T2三種毒素的側(cè)流層析技術(shù)，該檢測方法具有靈敏度高，經(jīng)濟高效，快速等優(yōu)點。Wang等［40］設計了一種快速檢測OTA的側(cè)流層析分析技術(shù)，采用OTA與固定在檢測線上的DNA探針（DNA1）同時競爭QDs標記的適配體。在沒有OTA的情況下，QDs標記的適配體與DNA1，多余游離的標記適配體與質(zhì)控線上固定的poly T探針（DNA2）結(jié)合；相反，OTA存在時，檢測線的信號值將會減弱，質(zhì)控線的信號值將會增強，LOD達到4.7 nmol/L；與熒光偏振免疫測定方法相一致，但更加節(jié)省時間（圖5）。

圖4 基于分子發(fā)夾/熒光微球的側(cè)流層析分析技術(shù)檢測AFB1的原理示意圖［34］

圖5 基于量子點適配體側(cè)流層析技術(shù)的反應原理示意圖［40］

2.2 比色法檢測的側(cè)流層析生物傳感器

在側(cè)流層析技術(shù)中，膠體金側(cè)流層析技術(shù)是最為常用的，不需要任何儀器便能實現(xiàn)快速現(xiàn)場檢測的技術(shù)。膠體金屬于惰性金屬［41-42］，具有穩(wěn)定好，生物相容性好、低成本等優(yōu)點。納米金粒子呈紅色，因此肉眼可見成為快速檢測的趨勢，更加快了膠體金在檢測領域的研究［43］。經(jīng)巰基修飾的適配體與膠體金通過Au-S鍵形成穩(wěn)定的復合結(jié)構(gòu)，T線上是一段用生物素修飾的與靶標適配體互補的核酸片段，C線上則是一段用生物素修飾的胸腺嘧啶或腺嘌呤的核酸片段，能與靶標適配體結(jié)合。當溶液中無靶標時，遷移到T線時將與適配體互補鏈產(chǎn)生顯色反應，多余的適配體溶液向前遷移與C線核酸片段反應顯紅色；當溶液中含有靶標時，遷移到T線，反應減少或無反應，顯淡紅色或不顯色，多余的游離適配體與C線核酸片段結(jié)合顯紅色［44］。Wu等［45］提出了一種基于適配體識別ZEN膠體金側(cè)流層析技術(shù)。將巰基化的ZEN適配體與膠體金偶聯(lián)，作為側(cè)流層析的信號探針，硝酸纖維素膜表面的檢測線固定適配體的識別序列的互補鏈，質(zhì)控線固定適配體的非識別序列的互補鏈（圖6）。在5-200 ng/mL的檢測范圍內(nèi)線性良好，可視化檢測限為20 ng/mL。但該檢測方法也存在些問題，首先，樣本基質(zhì)效應，即實際樣本中總是含有其他雜質(zhì)分子，在檢測過程中可能會產(chǎn)生非特異性信號。第二，納米金的重現(xiàn)性，復雜的納米結(jié)構(gòu)，形狀和孔隙度很難精準制備。第三，現(xiàn)有免疫檢測試紙只能用于定性或半定量檢測。

納米材料有很多種，如AuNPs、CBNs、MNPs、QDs和UCNPs等（表2）。一種以銀核和金殼（Ag-Au）為標記物的側(cè)流層析分析技術(shù)用于食品中AFB1靈敏、快速的檢測［46］，與金納米顆粒相比，Ag-Au納米顆粒增強了測定的靈敏度，重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。隨著AFB1濃度的增加，檢測線上納米復合材料的顏色強度增加，AFB1的檢測限為0.1 ng/mL。Kolosova等［47］報道了一種膠體金側(cè)流層析分析技術(shù)，用于同時檢測玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON）。目前，比色法側(cè)流層析技術(shù)的優(yōu)點是靈敏、簡單、快速，無需多次標記和分離步驟，但該技術(shù)尚未成熟，報道的文章也不多，在食品安全、藥物研發(fā)和醫(yī)學診斷等領域的現(xiàn)場快速分析檢測方面有著極大的發(fā)展空間。

圖6 基于適配體的側(cè)流層析技術(shù)結(jié)構(gòu)與原理示意圖

表2 用于快速檢測中的各種納米材料的優(yōu)越性和局限性

2.3 表面增強拉曼散射（Surface enhanced Raman

scattering，SERS）側(cè)流層析分析技術(shù)

表面增強拉曼散射是一種增強拉曼散射強度的技術(shù)，具有靈敏度高、可提供指紋圖譜等優(yōu)點［55］，金屬納米材料可以大幅度提高拉曼散射強度，因此基于拉曼散射的NPs技術(shù)一直是研究的熱點［56］，激發(fā)光和散射拉曼信號可以被調(diào)整到近紅外區(qū)域［57］，該技術(shù)能夠在實驗室中進行高靈敏的定量分析。SERS應用于側(cè)流層析技術(shù)的檢測方法是基于拉曼散射附加在納米粒子中，顯著提高了實驗的靈敏度。Li等［58］設計并構(gòu)建了基于適配體識別的磁分離輔助的快速檢測AFB1的SERS傳感器，在羧基化的磁珠上修飾了生物素標記的AFB1適配體，作為檢測探針；合成信號分子（4-MBA）內(nèi)嵌式金銀核殼納米棒并修飾巰基化互補DNA組裝成SERS探針，作為捕獲探針。通過DNA堿基互補，將金銀核殼納米棒和磁珠組裝構(gòu)建為AFB1檢測傳感器（圖7）。當AFB1存在時，AFB1被適配體識別，使磁珠和金銀核殼納米棒分離，SERS的信號將隨之減弱，從而通過SERS強度的變化達到快速檢測AFB1的目的，該傳感器的線性范圍為1 pg/mL-1 000 pg/mL，檢出限為0.4 pg/mL。作為一種新型的鑒定手段［59］，在準確、客觀、直接的快速檢測目標物方面有著巨大的潛力，有望成為鑒定的強大工具。

圖7 基于SERS側(cè)流層析分析技術(shù)的操作流程圖［58］

2.4 基于智能手機的適配體側(cè)流層析分析技術(shù)

基于智能手機的適配體檢測裝置［60］采用轉(zhuǎn)換納米粒子修飾的適配體互補鏈固定在同一側(cè)流層析上的3條檢測線，作為檢測探針，可以同時對多個不同目標物（如OTA、汞離子和沙門氏菌）進行特異性、靈敏性的快速檢測，因此，為多目標檢測提供了經(jīng)濟，高效、快速的檢測手段。在最佳的條件下，汞離子、OTA和沙門氏菌的檢出限分別為5 ng/mL、3 ng/mL和85 CFU/mL［61］。Jin等［62］開發(fā)了一種基于成像的側(cè)流層析分析儀，該分析儀將T線和C線的信號成像采集到一張圖像中，然后用手機軟件對其進行數(shù)據(jù)處理（圖8）。該分析儀已成功用于肌酸激酶-腦［62］（Creatine kinase - brain，CK-MB）的定量分析，LOD值為2 ng/mL，差異性小。手機具有使用方便、便攜性好、無所不在和數(shù)據(jù)傳輸能力強等優(yōu)點，可作為即時檢驗的閱讀器，因此，基于智能手機的適配體側(cè)流層析技術(shù)有望在食品安全、毒素檢測、醫(yī)學診斷和環(huán)境監(jiān)測等快速檢測領域得到廣泛應用。

3 結(jié)論

圖8 用于同時檢測多個目標的LFAs和基于智能手機的便攜式裝置示意圖［61］

側(cè)流層析分析技術(shù)屬于干式化學檢測技術(shù)，可以兼容裸眼檢測或簡單的光學電子閱讀器，具有靈敏度高、簡便快捷、不需要復雜昂貴的儀器設備且價格低廉等特點，在食品安全、生物醫(yī)藥等領域已有應用。核酸適配體側(cè)流層析技術(shù)相比于傳統(tǒng)的抗原抗體免疫層析法有很多優(yōu)勢，成本低，批次穩(wěn)定，保存時間長，應用范圍廣，因此擁有很好的發(fā)展前景；同時，可實現(xiàn)現(xiàn)場實時的快速檢測。基于不同的標記方式的檢測方法具有不同的檢測性能，乳膠層和金納米粒子（gold nanoparticles，AuNPs）可作為可視化定性檢測，而熒光、量子點和磁性納米粒子標記可進行定量分析。目前，適配體側(cè)流層析技術(shù)仍停留在實驗室研制階段，在市場上還沒有低成本和成熟的檢測產(chǎn)品，同時也存在一些問題，例如，樣品仍需較復雜的前處理，樣品必須是液態(tài)均相，基質(zhì)和環(huán)境參數(shù)影響大，穩(wěn)定性差，這些問題將是未來研究的重點。真菌毒素具有種類多、分子結(jié)構(gòu)類似、痕量高等特點，適配體側(cè)流層析技術(shù)在現(xiàn)場快速檢測真菌毒素領域中具有巨大的潛力。相信在不遠的將來，適配體側(cè)流層析技術(shù)必將發(fā)展成為毒素、重金屬、農(nóng)殘和致病微生物等污染物的現(xiàn)場篩查的利器。