岳鵬鵬 郭俊璠 于鴻浩 付燦 王小燕 高進(jìn)濤

（桂林醫(yī)學(xué)院生物技術(shù)學(xué)院，桂林 541000）

近年來，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)發(fā)展迅速，推動了基因工程細(xì)胞模型和動物研究的快速發(fā)展［1-4］。與應(yīng)用較早的基因編輯技術(shù)如鋅指蛋白核 酸 酶（Zinc finger unclease，ZFN）［5］或 轉(zhuǎn) 錄 激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（Transcription activator-like effector nuclelease，TALENs）相比［6］，CRISPR/Cas9系統(tǒng)具有設(shè)計靈活、成本低、操作簡單、準(zhǔn)確性高、可多位點同時打靶等優(yōu)勢。CRISPR/Cas9系統(tǒng)主要由單鏈向?qū)NA（Single guide RNA，sgRNA）和Cas9蛋白（一種核酸內(nèi)切酶）組成［7］。sgRNA的主要功能是識別和結(jié)合到目標(biāo)基因組DNA上，并介導(dǎo)Cas9蛋白切割DNA雙鏈，最終達(dá)到基因編輯的目的。因此，sgRNA能否做到高效靶向識別和結(jié)合目標(biāo)基因是CRISPR-Cas9能否特異性編輯目標(biāo)基因的先決條件，尤其是基因敲除和基因敲入，sgRNA的高效性對基因打靶的影響至關(guān)重要。能夠設(shè)計、制備出高效靶向目標(biāo)基因的sgRNA是基于CRISPR-Cas9系統(tǒng)進(jìn)行基因編輯的關(guān)鍵。

半乳糖血癥（Galactosemia，GAL，OMIM #230 440）是由于半乳糖Leloir代謝途徑中關(guān)鍵酶失活或功能異常所引起的常染色體隱性遺傳代謝病，包括I型、II型和III型［8-9］。I型半乳糖血癥（GAL I）在3種半乳糖血癥中發(fā)病率最高［10］，臨床可引發(fā)一系列的癥狀，如肝大、肝硬化等肝損傷，隨后出現(xiàn)白內(nèi)障及腎小管功能不全等癥狀，嚴(yán)重威脅生命［11］。編碼半乳糖-1磷酸-尿苷轉(zhuǎn)移酶的基因GALT變異是引起GAL I的遺傳病因［12-13］。目前，ARUP數(shù)據(jù)庫（http：//www.arup.utah.edu/database/Galt）收錄了230種GALT變異類型，包括錯義突變、插入突變、缺失突變、無義突變以及拼接位點突變等。GALT的變異特點具有明顯的地域性，如美國和北歐地區(qū)的高頻突變位點為c.563 A＞G（p. Q188R）［10］；東歐人群的高頻位點為c. 855 G＞T（p. K285N）［14］；非洲人群的高頻突變位點為c. 404 C＞T（p. S135L）［15］。我國罕有GAL I的分子遺傳學(xué)相關(guān)報道。楊茹萊等［16］報道了我國GAL I患者的GALT基因c.904 +1G＞T突變?yōu)橹虏⊥蛔儭xAC以及ClinVar 等數(shù)據(jù)庫中也記錄了c. 904+1G＞A和c. 904+1G＞T的突變信息，且明確標(biāo)注為功能失活和致病性突變。

不同GALT突變類型引起的臨床癥狀、臨床表現(xiàn)亦不相同。因此，有必要篩查我國明確的、典型的GALT致病突變位點，并將突變位點定位于小鼠基因組上，然后通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)對該位點進(jìn)行打靶，可以建立小鼠Galt基因突變細(xì)胞模型或動物模型，從而精準(zhǔn)的模擬GAL I，為深入的理解Galt基因的致病機制以及探索可行的治療策略具有重要意義。然而，目前并沒有針對小鼠Galt基因的sgRNA導(dǎo)向序列以及敲除該基因的方法。鑒于此，有必要提供一種可以模擬人類致病突變的特異靶向小鼠Galt基因的sgRNA導(dǎo)向序列及利用其編輯小鼠Galt基因的方法，以解決現(xiàn)有研究的不足。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株、菌株和質(zhì)粒 大腸桿菌感受態(tài)菌株DH5α和pMDTM19-T Vector Cloning Kit購 自 寶 日 醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；小鼠成纖維細(xì)胞3T3、pGL3-U6質(zhì) 粒 和pST1374-NLS-flag-linker-Cas9表 達(dá)質(zhì)粒均由本實驗室保存。

1.1.2 試劑及儀器（DNA提取試劑盒） 去內(nèi)毒素質(zhì)粒中提試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；LipofectamineTM 3000 Transfection Reagent（InvitrogenTM）試劑盒、殺稻瘟霉素、嘌呤霉素、胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基均購自Thermo Fisher Scientific公司；Solution I、dNTP Mixture、TaKaRa Ex Taq和10×Ex Taq Buffer、Premix Taq酶均購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；BsaI購自NEB公司；DNA純化回收試劑盒購自天根生化科技有限公司；TransDirect? Mouse Genotyping Kit購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；引物由上海百力格生物技術(shù)有限公司合成，測序由廣州生工生物工程股份有限公司完成；實驗所需的主要儀器包括CO2培養(yǎng)箱、臺式離心機、PCR儀、低溫冷凍離心機、搖床等。

1.2 方法

1.2.1 sgRNA設(shè)計及sgRNA表達(dá)載體的構(gòu)建 GAL I是由GALT基因突變引起的，首先利用ExAC數(shù)據(jù)庫篩查了人GALT基因的功能失活突變，共篩查到19個突變位點（表1），利用OMIM在線數(shù)據(jù)庫檢索到GALT突變17種（表2）；然后，利用ClinVar數(shù)據(jù)庫檢索拼接位點突變的致病情況（表3）。鑒于人GALT基因突變具有明顯的地域特性，查找相關(guān)文獻(xiàn)，找到在我國出現(xiàn)的、明確的、典型的致病突變（表4）；最終確定了人GALTc.904 +1G為擬突變位點。

由于人和小鼠的物種差異，同一功能基因的基因結(jié)構(gòu)可能不同，因此本研究利用Ensembl數(shù)據(jù)庫查詢了人GALT和小鼠Galt基因的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)人GALTc.904 +1G位點與小鼠Galt基因c.847 +1G位點相對應(yīng)（圖1）。然后從Ensembl數(shù)據(jù)庫中導(dǎo)出小鼠Galt基因序列，利用Vector NTI軟件定位c.847 +1G位點序列，然后在其附近設(shè)計基因打靶位點（圖1），篩選出3條sgRNA導(dǎo)向序列。

表1 ExAC數(shù)據(jù)庫中人GALT基因功能失活突變情況

表2 OMIM數(shù)據(jù)庫中人GALT基因突變情況

在上述的特異靶向小鼠Galt基因的sgRNA導(dǎo)向序列的5'端加上accg合成得到正向寡核苷酸序列。同時合成其對應(yīng)的DNA互補鏈，并且在DNA互補鏈的5'端加上aaac合成得到反向寡核苷酸序列。將正反向寡核苷酸序列退火，形成具有粘性末端的雙鏈DNA片段。退火反應(yīng)體系為：10 μmol/L正向寡核苷酸5 μL；10 μmol/L反向寡核苷酸5 μL；10×T7 Endonuclease I buffer 2 μL；ddH2O 8 μL；反應(yīng)程序為：95℃，5 min；95℃到85℃，-1℃/循環(huán)，共10個循環(huán)；85℃到25℃，-0.1℃/循環(huán)，共600個循環(huán)，退火產(chǎn)物-20℃保存。

表3 ClinVar數(shù)據(jù)庫中人GALT基因拼接位點致病突變情況

表4 中國I型半乳糖血癥患者GALT致病突變情況

圖1 模擬人GALT基因突變的小鼠Galt基因打靶位點示意圖及其序列

利用BsaI限制性內(nèi)切酶酶切載體pGL3-U6-sgRNA，得到酶切產(chǎn)物pGL3-U6-sgRNA-Bsa I，將其和上述具有粘性末端的雙鏈DNA片段連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌（DH5α）并涂布于氨芐抗性的LB培養(yǎng)基上，37℃過夜培養(yǎng)20 h后，挑取單克隆并用通用引物U6測序，鑒定出陽性克隆，于37℃、220 r/min對陽性克隆搖菌，去內(nèi)毒素中提試劑盒提取質(zhì)粒，得到pGL3-U6-Galt-sgRNA質(zhì)粒。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及篩選 小鼠3T3細(xì)胞接種培養(yǎng)于含5%（V/V）胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基中，于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2-3 d更換新鮮培養(yǎng)基，待細(xì)胞匯合度達(dá)到80%-90%后，以0.25%胰蛋白酶消化并傳代，然后分至6孔板中，16 h-18 h后，待細(xì)胞匯合度達(dá)到80%-90%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

采用LipofectamineTM3000 Transfection Reagent（InvitrogenTM）試劑盒共轉(zhuǎn)染pGL3-U6-Galt-sgRNA質(zhì)粒和pST1374-NLS-flag-linker-Cas9表達(dá)質(zhì)粒。每個孔（直徑34.8 mm）轉(zhuǎn)染以上兩種質(zhì)粒各2.5 μg。轉(zhuǎn)染6 h后用PBS清洗，換完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后換培養(yǎng)基，同時加入5 μg/mL的嘌呤霉素和10 μg/mL的殺稻瘟菌素進(jìn)行藥物篩選，得到陽性的sgRNA-Cas9共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

1.2.3 基因組DNA提取及打靶位點DNA的PCR擴增 將藥篩得到的陽性的sgRNA-Cas9共轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行裂解釋放基因組DNA，以細(xì)胞裂解液為模板進(jìn)行打靶位點DNA的PCR擴增反應(yīng)。PCR擴增反應(yīng)的體系為：細(xì)胞裂解液2 μL，上游引物1 μL，下 游 引 物1 μL，dNTP Mixture 2 μL，TaKaRa Ex Taq 1 μL，10×Ex Taq Buffer 2.5 μL，滅菌水補充至25 μL；PCR擴增反應(yīng)的程序為：95℃，5 min；95℃，20 s，57℃，20 s，72℃，25 s，共35個循環(huán)；72℃，5 min，16℃，∞。其中上游引物序列為5'-gtgatggtgagtctcctgggta-3'，下游引物序列為5'-cctttgtcagccttcagtctag-3'。

1.2.4 測序及TA克隆 取打靶位點DNA的PCR擴增產(chǎn)物進(jìn)行Sanger測序，如果打靶位點出現(xiàn)套峰，則初步確認(rèn)發(fā)生了基因編輯。

通過TA克隆測序分析經(jīng)初步確認(rèn)發(fā)生了基因編輯的打靶位點的基因型，并計算編輯效率。將打靶位點的PCR擴增產(chǎn)物進(jìn)行膠回收純化，將純化后的DNA與pMDTM19-T 進(jìn)行連接，連接反應(yīng)的體系為：PCR純化產(chǎn)物40 ng、Solution I 2.5 μL和pMDTM19-T載體0.5 μL，加水補充至5 μL。然后16℃金屬浴1 h，得到連接產(chǎn)物。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌并涂布于氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)基上，37℃過夜培養(yǎng)20 h后，進(jìn)行菌落PCR反應(yīng)驗證，篩選出陽性克隆，并將陽性克隆進(jìn)行Sanger測序。

2 結(jié)果

2.1 sgRNA表達(dá)載體成功構(gòu)建

本研究設(shè)計的sgRNA在Galt基因上的靶序列符合5'-N（21）GG的序列排列規(guī)則，且在Galt基因上的靶序列是唯一的。篩選出的3條sgRNA的核苷酸序列分別為：sgRNA1：5'-agccttaccatgccagccca-3'；sgRNA2：5'-ctccatgggctggcatggta-3'；sgRNA3：5'-ggctggcatggtaaggcttt-3'。按本研究實驗方法構(gòu)建的pGL3-U6-Galt-sgRNA質(zhì)粒電泳圖（圖2），3種質(zhì)粒大小符合預(yù)期。質(zhì)粒的測序峰圖（圖3），陰影部分代表質(zhì)粒中sgRNA編碼序列，與設(shè)計的3條sgRNA相符，表明sgRNA表達(dá)載體初步構(gòu)建成功。

圖2 sgRNA表達(dá)質(zhì)粒電泳圖

圖3 sgRNA表達(dá)質(zhì)粒測序峰圖

2.2 陽性細(xì)胞的獲得及打靶位點DNA的PCR擴增

轉(zhuǎn)染后，利用嘌呤霉素和殺稻瘟菌素組合可以篩選出sgRNA-Cas9的陽性轉(zhuǎn)染細(xì)胞。圖4為加藥48 h后sgRNA1-Cas9、sgRNA2-Cas9和sgRNA3-Cas9轉(zhuǎn)染細(xì)胞圖。將篩選出的細(xì)胞用PBS清洗，加入胰蛋白酶消化并離心收集，裂解細(xì)胞進(jìn)行打靶位點DNA的PCR擴增。打靶位點DNA的PCR擴增電泳圖如圖5所示，擴增條帶清晰，片段大小符合預(yù)期，擴增效果效率較高，可用于后續(xù)測序分析。

圖4 sgRNA1-Cas9、sgRNA2-Cas9、sgRNA3-Cas9轉(zhuǎn)染陽性細(xì)胞

圖5 打靶位點DNA的PCR擴增電泳圖

2.3 測序及打靶效率分析

圖6 sgRNA打靶位點DNA的PCR產(chǎn)物測序峰圖

sgRNA打靶位點DNA的PCR產(chǎn)物測序峰圖見圖6。3種sgRNA靶點序列均出現(xiàn)套峰，且無原序列，初步表明發(fā)生了基因編輯，且編輯效率較高。通過TA克隆可將單條PCR產(chǎn)物連接到載體上，再通過測序分析可獲得打靶位點的基因型。本研究sgRNA1、sgRNA2和sgRNA3三條sgRNA打靶位點的基因型分析見表5、6、7。3種sgRNA導(dǎo)向序列均可以介導(dǎo)Cas9蛋白，高效、特異性的切割靶點DNA，進(jìn)而編輯小鼠Galt基因，效率高達(dá)100%，編輯后基因型以缺失突變?yōu)橹鳌?/p>

表5 sgRNA1靶點基因型分析

3 討論

一個基因的突變有很多種，包括堿基的置換、移碼突變、缺失和插入突變等，且均有可能是致病突變。但在臨床中表現(xiàn)有可能不同，即疾病的臨床癥狀與基因的突變位置及突變類型均有關(guān)系，其機理在很多疾病中均未闡明。這也是文章中首先進(jìn)行檢索和篩查，確定擬突變位點的原因所在。本研究首先篩查ExAC數(shù)據(jù)庫確定了GALT基因功能失活突變可導(dǎo)致GAL I，又通過OMIM在線數(shù)據(jù)庫檢索到GALT的突變種類，再通過ClinVar數(shù)據(jù)庫確認(rèn)具體哪些點突變會致病。但致病突變具有地域性，因此本研究繼續(xù)查找相關(guān)文獻(xiàn)，經(jīng)過層層比對確定了可模擬我國GAl I致病突變的人GALTc.904 +1G為擬突變位點。為了將此位點對應(yīng)于小鼠Galt基因，又查詢比對了人GALT和小鼠Galt基因的結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，小鼠Galt基因c.847 +1G位點與擬突變位點相同，最終創(chuàng)新性設(shè)計了精確模擬我國人GAl I致病突變位點的靶向小鼠Galt基因的sgRNA序列。本研究確定的擬突變位點為GALTc.904 +1G，突變類型為堿基置換（G＞A），由于該位點為基因的拼接位點，在外顯子拼接和內(nèi)含子去除的過程中發(fā)揮作用，堿基置換突變后導(dǎo)致外顯子無法拼接過程發(fā)生異常，進(jìn)而影響蛋白功能，造成疾病的發(fā)生。確實本研究的結(jié)果表明大部分突變?yōu)槿笔蛔?，突變類型與數(shù)據(jù)庫中的報道不同，但突變后同樣可以造成外GALTc.904 +1G位點外現(xiàn)在拼接異常的效應(yīng)，因此推測可以模擬數(shù)據(jù)庫中報道的基因突變效應(yīng)。此外，我們下一步制備基因編輯動物時，會在本研究的基礎(chǔ)上設(shè)計堿基置換的基因編輯方案，如使用堿基編輯器系統(tǒng)或設(shè)計重組同源臂等，力圖使得基因編輯的結(jié)果與數(shù)據(jù)庫報道一致。

表6 sgRNA2靶點基因型分析

表7 sgRNA3靶點基因型分析

本研究建立的CRISPR/cas9系統(tǒng)實現(xiàn)了100%的高編輯效率。除了sgRNA設(shè)計，試驗中還注意了轉(zhuǎn)染前細(xì)胞狀態(tài)、轉(zhuǎn)染試劑盒、藥篩濃度和細(xì)胞DNA提取試劑盒等試驗細(xì)節(jié)的優(yōu)化。例如，預(yù)試驗確定轉(zhuǎn)染前細(xì)胞匯合度在70%-80%時的轉(zhuǎn)染效率較高；轉(zhuǎn)染試劑盒使用的LipofectamineTM3000 Transfection Reagent（InvitrogenTM），其轉(zhuǎn)染效率高于實驗室前期使用的LipofectamineTM2000；藥篩濃度的控制直接決定陽性細(xì)胞獲得率，通過預(yù)試驗優(yōu)化了最佳藥篩濃度。藥篩后陽性細(xì)胞量較少，實驗中未使用普通基因組DNA提取純化試劑盒，改用全式金TransDirect? Mouse Genotyping Kit，其獨特裂解液裂解細(xì)胞后無需純化，裂解物可直接作為模板進(jìn)行后續(xù)擴增，提高了實驗效率。多項細(xì)節(jié)優(yōu)化獲得了100%的編輯效率。

本研究設(shè)計的sgRNA導(dǎo)向序列可以介導(dǎo)Cas9蛋白，高效、特異性地切割靶點DNA，用于編輯小鼠Galt基因，進(jìn)而影響小鼠Galt基因編碼蛋白的功能。利用特異靶向小鼠Galt基因的sgRNA導(dǎo)向序列，構(gòu)建了可模擬人類GALT基因的致病突變的CRISPR/Cas9系統(tǒng)，實現(xiàn)了小鼠3T3細(xì)胞的高效轉(zhuǎn)染，確定了合適的陽性細(xì)胞藥物篩選濃度，并實現(xiàn)了微量細(xì)胞的基因型分析。3T3細(xì)胞是常用的一種小鼠細(xì)胞模型。由于小鼠是實驗動物，且多為近交系品種，因此3T3細(xì)胞的基因組DNA序列與我們將要使用的研究對象C57/B6J小鼠差異很小，且通過數(shù)據(jù)庫比對分析發(fā)現(xiàn)3T3細(xì)胞和C57/B6J小鼠的Galt基因打靶區(qū)域序列并無差異。因此，可以認(rèn)為設(shè)計的sgRNA序列在制備基因編輯動物時發(fā)揮同樣的基因編輯效力?？傊狙芯繛榻⒕珳?zhǔn)模擬I型半乳糖血癥的動物模型奠定了基礎(chǔ)。

GAL I是一種影響肝臟、腎臟、生殖系統(tǒng)及神經(jīng)系統(tǒng)等多器官、多系統(tǒng)的，具有復(fù)雜病理過程的隱性遺傳代謝疾病，嚴(yán)重影響患者健康，甚至威脅生命［17］。目前，GAL I的發(fā)病機制仍未完全闡明［18］，治療手段單一，尚無良好的辦法治療GAL I的慢性并發(fā)癥［19-20］。在本研究構(gòu)建的CRISPR/Cas9系統(tǒng)基礎(chǔ)上，項目組下一步將通過顯微注射受精卵的方式，構(gòu)建精準(zhǔn)模擬GAI I的小鼠模型，用于非醫(yī)療診斷或治療目的，對研究Galt功能、GAL I致病機理以及相關(guān)生物治療方法等具有極其重要的作用。

4 結(jié)論

本研究首先分析了我國I型半乳糖血癥GALT基因的致病突變位點，并將其定位在小鼠Glat基因上，然后根據(jù)小鼠Galt基因擬突變位點區(qū)域的序列設(shè)計了sgRNA導(dǎo)向序列，建立了高效編輯小鼠Galt基因的CRISPR/Cas9系統(tǒng)，編輯效率為100%。