張曉文 鄭思琪

摘要：以2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）為陽性對(duì)照，利用紫外-可見分光光度計(jì)測定不同濃度梯度的蕨菜總黃酮樣品溶液來探究其對(duì)1，1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）、羥基自由基（·OH）、超氧陰離子（O-2·）的清除能力以及總還原力，探究商洛野生蕨菜總黃酮的抗氧化活性。當(dāng)樣品溶液濃度達(dá)到4.0 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子的清除率分別達(dá)到55.34%、71.30%、81.00%，總還原力的吸光度為0.735。試驗(yàn)結(jié)果表明，商洛野生蕨菜總黃酮具有較強(qiáng)的體外抗氧化活性，其抗氧化活性的強(qiáng)弱與其質(zhì)量濃度呈正相關(guān)關(guān)系，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，總黃酮的抗氧化活性低于BHT。

關(guān)鍵詞：蕨菜;總黃酮;抗氧化活性;自由基

中圖分類號(hào)： S647.01;TQ914.1;R284.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2020）13-0225-03

收稿日期：2019-08-14

基金項(xiàng)目：陜西省教育廳專項(xiàng)（編號(hào)：18JK0246）;商洛學(xué)院橫向科研項(xiàng)目（編號(hào)：19HKY003）;陜西省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目（編號(hào)：S201911396025）。

作者簡介：張曉文（1980—），女，陜西商洛人，碩士，副教授，主要從事中藥學(xué)研究。E-mail：510080487@qq.com。蕨菜屬鳳尾蕨科蕨屬多年生草本植物，別稱如意菜、龍頭菜、拳頭菜、商芝等，在我國各地都有分布。蕨菜味道甘甜、性味寒涼，具有清熱、滑腸、降氣、祛風(fēng)、化痰的功效，以治療食隔、氣隔、腸風(fēng)熱毒等癥為主，對(duì)于女子紅崩白帶、男子咳嗽、泄痢腹痛、發(fā)熱不退、濕疹等方面有很好的療效[1]。蕨菜含有多種人體所需的營養(yǎng)成分，例如脂肪、多糖、黃酮、蛋白質(zhì)、碳水化合物和Ca、Fe、Zn等微量元素[2]，尤其是所含有的多糖、黃酮，有很強(qiáng)的抗氧化活性，藥用價(jià)值較高。蕨菜含有的黃酮最主要的藥理作用是降血脂、抗氧化、清除自由基以及抗衰老，除此之外，還具有降血壓、抗突變、保護(hù)肝臟、抗動(dòng)脈粥樣硬化、免疫調(diào)節(jié)、抗血栓、關(guān)節(jié)疼痛、脫肛、痢疾以及預(yù)防麻疹、流感等作用，近年來還發(fā)現(xiàn)蕨菜黃酮具有一定的抗宮頸癌和肝癌腫瘤作用[3]。

陜西省商洛市自古以來就有采食蕨菜的飲食文化[4]，傳說“商山四皓”因采食蕨菜而長壽。近年來商芝更是作為名菜銷往東南亞、日本以及韓國等地。正是由于商洛地區(qū)蕨菜資源豐富，具有良好的發(fā)展前景和藥用及食用價(jià)值，所以主要針對(duì)該地區(qū)蕨菜的抗氧化活性研究，以期為該地蕨菜資源的進(jìn)一步綜合利用提供參考。

1材料與方法

1.1材料與試劑

新鮮商洛蕨菜購于商洛市集，并經(jīng)李筱玲藥師鑒定為鳳尾蕨科蕨屬，除掉雜質(zhì)淋洗，置60 ℃烘箱中干燥，粉碎，過40目篩，貯干燥器中備用。

試劑：無水乙醇（EtOH）、乙二胺四乙酸（EDTA）、磷酸二氫鉀（KH2PO4）、磷酸氫二鉀（K2HPO4）、磷酸二氫鈉（NaH2PO4）、鹽酸（HCl）、碳酸氫鈉（NaHCO3）、氫氧化鈉（NaOH）、亞硝酸鈉（NaNO2）、硝酸鋁[Al（NO3）3]、三氯化鐵（FeCl3）、雙氧水（H2O2）、鐵氰化鉀[K3Fe（CN）6]、三氯乙酸（TCA）、氮藍(lán)四唑（NBT）、1，1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）、還原型輔酶（NADH）、吩嗪甲硫酸鹽（PMS）、二丁基羥基甲苯（BHT）。試劑均為分析純，試驗(yàn)用水為蒸餾水。

1.2主要試驗(yàn)儀器與設(shè)備

HYP-150型粉碎機(jī);SPX-250C型恒溫恒濕培養(yǎng)箱;超聲波提取器;RE-210D型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀;755B型紫外可見分光光度計(jì);電熱恒溫水浴鍋;超速離心機(jī)。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1蕨菜總黃酮的提取準(zhǔn)確稱取蕨菜粉末 20 g，置于小燒杯中，加入120 mL 70%乙醇，溫度為 60 ℃，超聲提取3次，每次30 min[5]，濾去殘?jiān)?，加入活性炭進(jìn)行脫色處理，按體積比為1 ∶1加入石油醚脫脂，棄去石油醚層，減壓濃縮至一定體積，干燥，得到蕨菜總黃酮。

1.3.2DPPH自由基清除能力測定分別取 1 mL 不同質(zhì)量濃度的蕨菜總黃酮樣品（1.2、1.6、2.0、2.4、2.8、3.2、3.6、4.0 mg/mL）放于標(biāo)記好的試管中，然后依次加入3 mL 0.004% DPPH乙醇溶液，充分混勻，避光靜置20 min后[6-7]，以乙醇作空白對(duì)照，在517 nm波長處測吸光度（D1），以蒸餾水代替樣品液作陰性對(duì)照（D2），BHT作陽性對(duì)照。

清除率=（1-D1/D2）×100%。

1.3.3羥自由基清除能力測定利用Fenton體系法[8-10]測定，羥自由基在波長510 nm處有最大吸收峰，如果在反應(yīng)體系中加入有清除·OH能力的物質(zhì)，與水楊酸競爭·OH，使有色物質(zhì)生成量減少。在510 nm波長處測定吸光度。分別取1 mL不同質(zhì)量濃度樣品（1.2、1.6、2.0、2.4、2.8、3.2、3.6、4.0 mg/mL）放于標(biāo)記好的試管中，先后加入 1.50 mL 反應(yīng)液（含0.1 mmol/L EDTA、0.1 mmol/L FeCl3和2.8 mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH值為7.4）、0.35 mL 20 mmol/L H2O2，加入2.00 mL 6 mmol/L 水楊酸，37 ℃恒溫水浴作用40 min后，終止反應(yīng)，于532 nm波長處測定吸光度（D3），以蒸餾水為陰性對(duì)照（D4），BHT作為陽性對(duì)照。

清除率=（1-D3/D4）×100%。

1.3.4總還原力測定法分別取1 mL不同質(zhì)量濃度樣品（1.2、1.6、2.0、2.4、2.8、3.2、3.6、4.0 mg/mL）放于標(biāo)記好的試管中，依次加入2.5 mL PBS（pH值為6.6）、2.5 mL 1% K3[Fe（CN）6]，混勻后于 50 ℃ 水浴中孵育20 min，再加2.5 mL 10% TCA終止反應(yīng)，離心5 min，取上清2.5 mL，依次加入 2.5 mL 無水乙醇和0.5 mL 0.1% FeCl3[6-7，11]，混勻后于700 nm波長處測定吸光度，以蒸餾水為陰性對(duì)照，BHT為陽性對(duì)照。

1.3.5超氧陰離子清除能力測定法分別取1 mL不同質(zhì)量濃度樣品（1.2、1.6、2.0、2.4、2.8、3.2、3.6、4.0 mg/mL）放于標(biāo)記好的試管中，依次加入 2 mL 0.078 mol/L NBT、2 mL 0.468 mmol/L NADH，最后加入0.8 mL 0.060 mol/L PMS溶液，室溫?fù)u勻后，靜置10 min，離心5 min[6-7，12]，于560 nm波長處測定吸光度（D5），調(diào)零孔用不同質(zhì)量濃度樣品液2 mL、0.8 mL蒸餾水代替PMS溶液調(diào)零，用蒸餾水作陰性對(duì)照（D6），BHT作陽性對(duì)照。

清除率=（1-D5/D6）×100%。

2結(jié)果與分析

2.1蕨菜總黃酮對(duì)DPPH自由基的清除作用

由圖1可知，在一定濃度梯度范圍內(nèi)，蕨菜總黃酮和BHT對(duì)DPPH自由基的清除率都呈上升趨勢。在1.2～4.0 mg/mL的濃度范圍內(nèi)，蕨菜總黃酮對(duì)DPPH的清除能力弱于BHT，當(dāng)濃度低于 2.8 mg/mL 時(shí)，蕨菜總黃酮對(duì)DPPH的清除能力迅速增加，但隨著濃度的遞增，BHT對(duì)DPPH的清除能力無明顯變化。當(dāng)蕨菜總黃酮質(zhì)量濃度為 4.0 mg/mL 時(shí)，清除率為55.34%。

2.2蕨菜總黃酮對(duì)羥基自由基的清除能力

由圖2可知，蕨菜總黃酮與BHT相比，在試驗(yàn)測試的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，其對(duì)羥基自由基的清除能力比BHT弱，可是蕨菜總黃酮對(duì)羥基自由基清除能力的增幅卻大于BHT。隨著蕨菜總黃酮濃度的增加，其清除率也同時(shí)增強(qiáng)，當(dāng)蕨菜總黃酮質(zhì)量濃度為4.0 mg/mL時(shí)，清除率為71.30%，表明蕨菜總黃酮對(duì)羥基自由基具有較好的清除能力。

2.3蕨菜總黃酮總還原力的測定

由圖3可知，BHT的還原能力比蕨菜總黃酮的總還原力高。當(dāng)蕨菜總黃酮質(zhì)量濃度達(dá)到 4.0 mg/mL 時(shí)，吸光度為0.735，這說明在試驗(yàn)測試的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，蕨菜總黃酮具有較好的還原能力。

2.4蕨菜總黃酮對(duì)超氧陰離子的清除能力

由圖4可知，蕨菜總黃酮對(duì)超氧陰離子的清除作用與其濃度呈正相關(guān)關(guān)系，在同一質(zhì)量濃度下，蕨菜總黃酮對(duì)超氧陰離子的清除率低于BHT，在低濃度時(shí)，二者清除能力都迅速增加，達(dá)到2.0 mg/mL以后，BHT的超氧陰離子清除能力趨于平穩(wěn)，而蕨菜總黃酮的清除能力仍在增加，在4.0 mg/mL以后，清除力不再增加。這說明在蕨菜總黃酮試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，蕨菜總黃酮具有較強(qiáng)的清除超氧陰離子的作用。

3結(jié)論與討論

通過對(duì)商洛地區(qū)蕨菜總黃酮的研究發(fā)現(xiàn)，商洛蕨菜總黃酮對(duì)DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子都具有較好的清除能力，說明商洛蕨菜總黃酮具有一定的抗氧化、清除自由基、抗衰老作用。

研究中還發(fā)現(xiàn)，在試驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，蕨菜總黃酮樣品溶液質(zhì)量濃度較小時(shí)，其與BHT的清除能力相差較大，但蕨菜總黃酮對(duì)自由基的清除率增幅大于BHT。當(dāng)質(zhì)量濃度為 4.0 mg/mL 時(shí)，蕨菜總黃酮對(duì)DPPH自由基的清除率可達(dá)到55.34%，對(duì)超氧陰離子自由基的清除率達(dá)到81.00%，表明商洛蕨菜總黃酮的部分抗氧化能力趨近于BHT，可以作為一種天然抗氧化劑來利用。

陳燕芹等研究蕨菜總黃酮在4.0 mg/mL時(shí)對(duì)DPPH自由基的清除率為38%[13]，本研究結(jié)果表明，商洛蕨菜總黃酮在2.4 mg/mL時(shí)對(duì)DPPH自由基的清除率就已達(dá)到38%，當(dāng)濃度大于2.8 mg/mL時(shí)，清除率增幅變緩。蔡麗等研究表明，黃酮濃度在0.56 mg/mL時(shí)就已達(dá)到羥基自由基最大清除率，而在1.20 mg/mL之后略有減小[14]，本研究中，總黃酮濃度在1.2 mg/mL時(shí)對(duì)羥基的清除率僅為10%，此后清除率隨濃度增加而增加，當(dāng)達(dá)到 3.2 mg/mL 以后，清除率增幅逐漸減緩，趨于平穩(wěn)。陳乃東等研究的蕨菜總提物和本試驗(yàn)所測蕨菜總黃酮在1.2 mg/mL時(shí)對(duì)超氧陰離子的清除率基本相近;在2.4 mg/mL時(shí)，陳乃東等研究表明清除率已達(dá)到73%[15]。而本研究結(jié)果僅為59%，但在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)清除率一直呈增加趨勢，在 4.0 mg/mL 時(shí)，已達(dá)到81.00%。這可能與不同產(chǎn)地蕨菜中總黃酮含量及分離純化方法不同有關(guān)。

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