柴智 黃瓊 馮進 崔莉 黃午陽 李瑩

摘要：以魚肉理化性質(zhì)、蛋白二級結(jié)構(gòu)相對含量、質(zhì)構(gòu)特性、微觀結(jié)構(gòu)等為指標(biāo)，探討不同凍藏溫度（-20、-30、-40 ℃）對鱖魚貯藏過程中魚肉品質(zhì)變化的影響。結(jié)果表明，在不同凍藏溫度下，鱖魚肌肉的pH值、Ca2+-ATPase活性、總巰基含量均呈下降趨勢，而表面疏水性指數(shù)和揮發(fā)性鹽基氮含量均呈上升趨勢;同時凍藏溫度越低，樣品的硬度、彈性、咀嚼性下降幅度越小;-40 ℃凍藏的鱖魚樣品具有更高的α-螺旋含量，其蛋白變性程度較小，-20 ℃凍藏的樣品蛋白質(zhì)無序程度明顯增加。掃描電鏡結(jié)果表明，不同凍藏條件下魚肌纖維均發(fā)生一定變形，-20 ℃凍藏條件下的肌纖維結(jié)構(gòu)遭到的破壞最嚴重，而-40 ℃凍藏條件下的肌纖維結(jié)構(gòu)保持的相對比較完整。綜合來看，-40 ℃凍藏時鱖魚魚肉品質(zhì)各指標(biāo)明顯優(yōu)于其他凍藏溫度。

關(guān)鍵詞：鱖魚;魚肉;凍藏;溫度;品質(zhì);理化性質(zhì);蛋白二級結(jié)構(gòu);質(zhì)構(gòu)特性;微觀結(jié)構(gòu)

中圖分類號： S984文獻標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2020）13-0228-08

收稿日期：2020-06-11

基金項目：江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金[編號：CX（19）2006]。

作者簡介：柴智（1986—），女，安徽淮南人，博士，助理研究員，主要從事營養(yǎng)與食品加工領(lǐng)域研究。E-mail：sophia_chai@163.com。

通信作者：李瑩，博士，副研究員，主要從事功能食品領(lǐng)域研究。E-mail：hijoly@163.com。鱖魚（Siniperca chuatsi）別稱桂花魚，屬鱸形目魚旨科鱖魚屬，其肉質(zhì)細膩，肌間少刺，營養(yǎng)豐富，是我國名貴的淡水魚類[1]。鱖魚經(jīng)濟價值高，近年來已突破繁養(yǎng)技術(shù)難關(guān)被廣泛養(yǎng)殖，但鱖魚暫養(yǎng)耗氧量大不易存活，這導(dǎo)致了大量鱖魚不能被市場及時消化、積壓于市，一旦失去食用價值將造成極大的經(jīng)濟損失，嚴重時將污染環(huán)境破壞水質(zhì)。隨著人們生活水平的提高，對水產(chǎn)品品質(zhì)的要求也逐步提升，因此亟需采取保鮮措施以減緩鱖魚魚肉品質(zhì)的劣變。尋找合適的貯藏方式，不僅能從原料上解決鱖魚浪費的問題，同時對于保證鱖魚的新鮮口感和質(zhì)量安全也具有重要意義。

水產(chǎn)品常用的保鮮方式有低溫保鮮、氣調(diào)保鮮和高壓靜電場保鮮等技術(shù)，其中低溫保鮮是應(yīng)用最廣泛的保鮮技術(shù)。低溫凍藏保鮮技術(shù)是采用低溫的手段把水產(chǎn)品的中心溫度降至-15 ℃以下，并且在冷凍條件下貯藏和流通的一種保鮮措施[2]。目前已有利用凍藏技術(shù)對鰱魚[3]、秋刀魚[4]、河豚魚[5]等進行保鮮的研究。低溫凍藏可抑制水產(chǎn)品內(nèi)微生物生長和內(nèi)源酶的分解，從而延長產(chǎn)品的貨架期，保持魚肉品質(zhì)。國內(nèi)外研究表明，在凍藏溫度、凍藏時間、凍結(jié)速率等條件影響下，魚肉會在凍藏過程中發(fā)生蛋白質(zhì)變性在內(nèi)的多重理化反應(yīng)，其中凍藏溫度是最為關(guān)鍵的因素。

本研究選取不同凍藏溫度（-20、-30、-40 ℃），以凍藏期內(nèi)鱖魚肌肉的pH值、Ca2+-三磷酸腺苷酶（ATPase） 活性、總巰基含量、表面疏水性指數(shù)、揮發(fā)性鹽基氮含量、總蛋白二級結(jié)構(gòu)相對含量、質(zhì)構(gòu)特性、微觀結(jié)構(gòu)等為指標(biāo)，研究不同凍藏溫度對凍結(jié)鱖魚品質(zhì)的影響，以期為鱖魚的低溫貯藏和保鮮提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。1材料與方法

1.1試驗材料

鮮活鱖魚，購于江蘇省南京市嘉鴻水產(chǎn)商行，質(zhì)量為（500±50） g/尾。將鮮活鱖魚置于含冰的泡沫箱內(nèi)，并在30 min內(nèi)運回實驗室。試驗于2018年4—5月在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所實驗室進行。

三羥甲基氨基甲烷（Tris）、5，5′-二硫代雙-硝基苯甲酸（DTNB）、8-苯胺基-1-萘基磺酸鹽（ANS）（Sigma公司）;二辛可寧酸（BCA）法蛋白定量測試盒、超微量Ca2+-ATP酶測試盒（南京建成生物工程研究所）;磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉、氯化鉀、戊二醛、鹽酸、尿素等（國產(chǎn)分析純）。

1.2試驗方法

1.2.1材料預(yù)處理、凍藏及解凍去除鱖魚的內(nèi)臟、魚皮和魚骨后，用流水洗凈后瀝水10 min，剖片、整形，將魚肉切分成3 cm×3 cm×3 cm大小的魚塊備用。將切好的魚塊隨機分成3組，分別于低溫冰箱中速凍至中心溫度達到-20、-30、-40 ℃，然后分別置于-20、-30、-40 ℃條件下凍存。凍藏過程中定期取適量凍魚塊置于4 ℃冰箱中解凍2 h，解凍后的樣品用于各項指標(biāo)的測定。

1.2.2pH值的測定取鱖魚魚肉5 g，加入9倍體積的去離子水，12 000 r/min勻漿30 s，10 000 g離心10 min后取上清液測定pH值。

1.2.3肌原纖維蛋白的提取及Ca2+-ATPase活性的測定肌原纖維蛋白的提取參照Yang等的方法[6]，取10 g魚肉加入2倍體積的去離子水，充分勻漿后離心20 min（10 000 r/min、4 ℃），棄上清液，沉淀加去離子水重復(fù)上述步驟提取1次。收集沉淀，加入20 mL冷卻的0.05 mol/L磷酸緩沖液（pH值為7.2，含0.6 mol/L NaCl），充分勻漿后，4 ℃、10 000 r/min 離心20 min，保留上清液并重復(fù)提取1次，合并2次上清液。蛋白質(zhì)含量采用BCA試劑盒測定。Ca2+-ATPase活性的測定參照超微量 Ca2+-ATP 酶活性試劑盒操作說明書進行。

1.2.4總巰基含量的測定參照Benjakul等的方法[7]，取0.5 mL肌原纖維蛋白溶液（蛋白濃度為 4 mg/mL），加入4.5 mL Tris-HCl 緩沖液[0.2 mol/L，pH值為6.8，含8 mol/L尿素，10 mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA）和2%十二烷基硫酸鈉（SDS）]。取 1 mL 上述溶液與100 μL 0.1% DTNB混合，于 40 ℃ 保溫25 min后，在412 nm處測定溶液吸光度。以0.6 mol/L KCl溶液（pH值為7.0）代替樣品作為空白對照。按照以下公式計算總疏基含量：

總疏基含量（nmol/mg）=[（D×n）÷（ε×ρ）]×106。

式中：D為412 nm波長處的吸光度;n為稀釋倍數(shù);ε為摩爾吸光系數(shù)，為13 600 L/（mol·cm）;ρ為蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度（mg/mL）。

1.2.5表面疏水性測定采用ANS熒光探針法測定表面疏水性[8]。首先用0.1 mol/L、pH值為7.0的磷酸緩沖液配制8 mmol/L的ANS溶液。然后用 10 mmol/L pH值為6.0的磷酸緩沖液（含 0.6 mol/L NaCl）將肌原纖維蛋白溶液稀釋至0.125、0.250、0.500、1.000 mg/mL。取4 mL各濃度的肌原纖維蛋白溶液與30 μL ANS溶液混合，測定ANS-蛋白結(jié)合體的熒光強度（激發(fā)波長為 374 nm、發(fā)射波長為485 nm），以熒光強度對肌原纖維蛋白溶液質(zhì)量濃度作圖，計算曲線斜率即為蛋白表面疏水性指數(shù)。

1.2.6揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）含量的測定TVB-N 含量的測定采用GB 5009.228—2016《食品安全國家標(biāo)準食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》中半微量定氮法進行。

1.2.7傅里葉紅外光譜的測定取3 g魚肉，加入30 mL 10% SDS溶液充分勻漿后，85 ℃水浴加熱 1 h，10 000 g離心15 min，收集上清液中的總蛋白。取3 mg總蛋白與200 mg溴化鉀混合，烘干，研磨后均勻壓片。傅里葉紅外光譜測定條件：分辨率為4 cm-1，掃描次數(shù)為32次。利用Peakfit軟件對圖譜進行去卷積和曲線擬合分析，根據(jù)各子峰的積分面積及其指認關(guān)系計算蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的相對百分含量。

1.2.8質(zhì)構(gòu)特性的測定采用質(zhì)構(gòu)儀測定魚肉的硬度、彈性和咀嚼性。將魚肉切成20 mm×25 mm×30 mm大小，質(zhì)構(gòu)儀條件：平底柱形探頭P/30（直徑為30 mm），探頭下降速率為3 mm/s，測試速率為 1 mm/s，返回速率為1 mm/s，壓縮程度為50%。

1.2.9掃描電鏡的測定將魚肉切成1 mm3左右，在2.5%的戊二醛溶液中固定2 h以上，用 0.1 mol/L 磷酸緩沖液漂洗3次，每次15 min。然后用30%、50%、70%、80%、90%的乙醇溶液依次脫水15 min，用無水乙醇漂洗2次，每次10 min。將脫水后的樣品放入叔丁醇中浸泡2 h以上后冷凍干燥。最終樣品噴金后通過掃描電鏡進行觀察。

1.3數(shù)據(jù)處理

所有試驗均重復(fù)3次，試驗結(jié)果以平均值±標(biāo)準差來表示，使用SPSS 18.0軟件進行方差分析，試驗數(shù)值間以ANOVA法進行顯著性檢驗，選取P<0.05為顯著水平。

2結(jié)果與分析

2.1凍藏溫度對鱖魚肌肉pH值的影響

由圖1可知，在18周凍藏期內(nèi)，凍藏魚肉的pH值整體呈下降趨勢。前2周內(nèi)，-20、-30 ℃凍藏條件下魚肉pH值快速下降，而-40 ℃凍條件下魚肉pH值下降較緩慢。這表明凍藏溫度會對肌肉組織pH值的變化產(chǎn)生較大影響，較低的凍藏溫度能夠有效抑制微生物的生長和魚體內(nèi)源酶對肌肉中蛋白質(zhì)的分解作用，使得魚肉中產(chǎn)生較少的胺類化合物及其他代謝產(chǎn)物，使得pH值變化較為緩慢[9]。

2.2凍藏溫度對肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活性的影響

由圖2可知，3種凍藏溫度下的鱖魚肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活性隨凍藏時間的延長均呈下降趨勢，尤其是-20、-30 ℃凍藏條件下，前2周內(nèi)Ca2+-ATPase活性急速下降。18周凍藏期結(jié)束后，-20、-30、-40 ℃凍藏下的肌原纖維蛋白的 Ca2+-ATPase活性分別為0.82、0.96、1.01 μmol Pi/（mg·min），比新鮮魚肉肌原纖維蛋白的 Ca2+-ATPase 活性分別降低48.1%、38.9%、36.1%。-20 ℃ 凍藏條件下的樣品Ca2+-ATPase活性下降速率明顯比較大，而-30、-40 ℃凍藏條件下的樣品Ca2+-ATPase活性下降速率相對較小，且凍藏8周后變化趨于平穩(wěn)。

有研究得出了相似的結(jié)論。Xiong 等研究發(fā)現(xiàn)，在-18 ℃凍藏30 d后，草魚肉蛋白的 Ca2+-ATPase 活性隨凍藏時間的延長最終降低了71.4%[10]。在凍藏過程中，肌球蛋白球狀頭部構(gòu)象發(fā)生改變或者相互聚集，是造成肌原纖維蛋白 Ca2+-ATPase 活性下降的主要原因。凍藏溫度對肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活性的下降速率有很大影響，冷凍貯藏溫度越高，Ca2+-ATPase活性下降速率越大。

2.3凍藏溫度對總巰基含量的影響

由圖3可知，凍藏初始時蛋白質(zhì)總巰基含量為124.2 nmol/mg，不同貯藏溫度下鱖魚樣品的總巰基含量均隨凍藏時間的延長而逐漸下降。在18周凍藏期結(jié)束后，-20、-30、-40 ℃凍藏溫度下樣品的總巰基殘留量分別為凍藏初始值的56.5%、68.3%、74.8%。試驗結(jié)果表明，在較低的凍藏溫度下產(chǎn)生的冰晶相對較小，小冰晶對蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的機械破壞力也較小，因而可以更好地保護蛋白質(zhì)中的巰基不被氧化。

2.4貯藏溫度對表面疏水性的影響

由圖4可以看出，3種凍藏溫度下肌原纖維蛋白的表面疏水性均隨凍藏時間的延長而明顯增強，且-20 ℃凍藏溫度下樣品表面疏水性上升趨勢比較明顯。凍藏12周后，不同凍藏溫度下樣品間表面疏水性差異明顯，18周后蛋白質(zhì)表面疏水性指數(shù)分別是初始值的2.69、2.36、2.00倍。

2.5凍藏溫度對揮發(fā)性鹽基氮含量的影響

不同凍藏溫度下鱖魚魚肉貯藏過程中TVB-N含量的變化如圖5所示，3種凍藏溫度下樣品的TVB-N含量均呈現(xiàn)上升趨勢。在初始的4周內(nèi)，魚肉TVB-N含量上升較為緩慢;在凍藏中后期（8～16周），-20 ℃凍藏條件下樣品的TVB-N含量上升速率明顯增大，明顯高于-30、-40 ℃凍藏條件下的樣品。凍藏結(jié)束后，-20 ℃凍藏樣品的TVB-N含量達到24.98 mg/100 g，而-30、-40 ℃凍藏樣品的TVB-N含量上升速率較小，在凍藏結(jié)束后其TVB-N含量分別為16.20、11.53 mg/100 g。

2.6凍藏溫度對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的影響

傅里葉紅外光譜在分析蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)過程中的應(yīng)用較為廣泛，其吸收最強的區(qū)域為酰胺Ⅰ帶（波數(shù)范圍為1 600～1 700 cm-1），這個區(qū)域的變化主要由蛋白質(zhì)分子多肽骨架CO的伸縮振動引起。二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋具有高度的穩(wěn)定性，因此α-螺旋結(jié)構(gòu)的相對含量可以作為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的評判標(biāo)準。β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲則是蛋白質(zhì)分子的無序結(jié)構(gòu)。

不同凍藏溫度下鱖魚樣品中蛋白質(zhì)各二級結(jié)構(gòu)的含量如表1所示。18周凍藏期結(jié)束后，-40 ℃貯藏的鱖魚樣品中α-螺旋含量為17.55%，β-折疊含量為40.00%，無規(guī)卷曲含量為17.62%，β-轉(zhuǎn)角含量為24.83%。-40 ℃貯藏的鱖魚樣品具有更高的α-螺旋含量表明其變性程度較小。-20℃

凍藏的鱖魚樣品α-螺旋含量低于-30、-40 ℃凍藏組，而β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲含量則高于-30、-40 ℃ 凍藏組，說明-20 ℃凍藏時，鱖魚的蛋白質(zhì)發(fā)生了更嚴重的變性，α-螺旋結(jié)構(gòu)逐漸解旋，部分轉(zhuǎn)化為β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲，這與任麗娜等的研究結(jié)論[3，11]基本一致。而凍藏期結(jié)束后，-20 ℃條件下β-折疊含量降低，無規(guī)卷曲含量上升，說明鱖魚肌肉的β-折疊結(jié)構(gòu)進一步被破壞，蛋白質(zhì)的無序程度增加。

2.7凍藏溫度對質(zhì)構(gòu)特性的影響

硬度、彈性、咀嚼性等質(zhì)構(gòu)特性指標(biāo)通常用來評價肌肉的品質(zhì)[12]。硬度表示肉品達到一定程度形變所需要的力，也可以反映出人的觸覺;彈性指外力作用于肉品時致其形變，去除外力后恢復(fù)形變的程度;咀嚼性指肉品咀嚼致可吞咽時所做的功[13]。凍藏過程中肌肉蛋白的變性改變了蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，使蛋白和水分子間的作用力減弱，原本存在于肌細胞間隙中的水分流失，從而將影響肌肉的組織形態(tài)、質(zhì)構(gòu)特性和感官品質(zhì)。

不同凍藏溫度的鱖魚樣品在貯藏過程中，魚肉的硬度隨凍藏時間的延長而逐漸下降（圖6-a），其中-20 ℃凍藏樣品的硬度下降最快，由上述 Ca2+-ATPase 活性、蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)等試驗結(jié)果可知，-20 ℃凍藏樣品中肌球蛋白變性程度最大，硬度也隨之下降最快，而更低溫度下凍藏可以較好地保護蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，使魚肉的硬度下降緩慢。隨凍藏時間的延長，3種凍藏溫度下的魚肉彈性均呈現(xiàn)下降的趨勢，其中-40 ℃凍藏溫度下的樣品彈性下降速度最為緩慢（圖6-b）。魚肉咀嚼性的變化趨勢與彈性和硬度的變化趨勢一致（圖6-c）?？偟膩碚f，凍藏過程中肌肉蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化造成了鱖魚魚肉質(zhì)構(gòu)的松散，而低溫貯藏可以明顯減緩硬度、彈性和咀嚼性的下降速度。

2.8貯藏溫度對組織微觀結(jié)構(gòu)的影響

由圖7可以看出，新鮮鱖魚魚肉樣品在掃描電鏡下的橫切切面顯示肌纖維結(jié)構(gòu)完整，紋理清晰可見，肌肉組織排列整齊，彼此間結(jié)合緊密。不同凍藏溫度處理的鱖魚樣品在凍藏結(jié)束后，肌纖維均有不同程度的形變。-20 ℃凍藏條件下，魚肉橫切肌纖維結(jié)構(gòu)明顯疏松，肌束細胞遭到嚴重破壞，紋理模糊。這可能是由于較高的凍藏溫度會在細胞內(nèi)形成較大、較粗糙的冰晶，這種較大的冰晶會導(dǎo)致肌細胞結(jié)構(gòu)被破壞。-30、-40 ℃凍藏條件下，橫切的鱖魚魚肉組織變化相對不大，肌纖維排列仍較整齊且緊密， 未出現(xiàn)嚴重的撕裂情況。從縱切組織

可以看出， 與新鮮魚片相比， 3種凍藏溫度下，鱖魚魚肉纖維之間均有空隙，組織結(jié)構(gòu)疏松，-40 ℃凍藏的樣品肌纖維結(jié)構(gòu)相對較完整。

3結(jié)論與討論

本研究以凍藏期內(nèi)鱖魚肌肉pH值、Ca2+-ATPase活性、總巰基含量、表面疏水性指數(shù)、TVB-N含量、總蛋白二級結(jié)構(gòu)相對含量、質(zhì)構(gòu)特性、微觀結(jié)構(gòu)等為指標(biāo)，研究了不同凍藏溫度（-20、-30、-40 ℃）對鱖魚魚肉品質(zhì)變化的影響，結(jié)果表明，隨著凍藏時間的延長，在不同凍藏溫度下，鱖魚肌肉的pH值、Ca2+-ATPase活性、總巰基含量均呈下降趨勢，而表面疏水性指數(shù)和TVB-N含量均呈上升趨勢。魚肉pH值變化的快慢對凍藏魚肉的品質(zhì)會產(chǎn)生重要的影響，彭歡歡等研究發(fā)現(xiàn)-40 ℃低溫凍藏下魚肉pH值變化緩慢，有利于品質(zhì)的保證[14]，本研究結(jié)果與之類似。Ca2+-ATPase活性是反映肌球蛋白頭部結(jié)構(gòu)變化較為靈敏的指標(biāo)[15]。凍藏溫度越低，Ca2+-ATPase活性下降速率越小。巰基是肌原纖維蛋白中活性功能基團的重要組成部分[16]。本研究中總巰基含量的變化趨勢與Benjakul等的研究結(jié)果[7]一致。表面疏水性增強的可能原因是凍藏促進魚肉肌原纖維蛋白伸展，使更多的疏水基團外露[17]。TVB-N含量是反映水產(chǎn)品腐敗程度的重要指標(biāo)，較低的凍藏溫度能更好地抑制微生物生長，從而減緩魚肉的腐敗，因此凍藏溫

度越低，其TVB-N含量增幅越小。凍藏后各組樣品的質(zhì)構(gòu)特性均呈下降趨勢，凍藏溫度越低，樣品的硬度、彈性、 咀嚼性下降幅度越小。類似地，張南海研究發(fā)現(xiàn)不同凍結(jié)溫度下，鯽魚肉的硬度、彈性和咀嚼性均下降[18]。-40 ℃ 凍藏的鱖魚魚肉蛋白具有更高的α-螺旋含量，表明其蛋白變性程度較小;掃描電鏡結(jié)果表明，3組凍藏條件下的魚肉肌纖維均發(fā)生一定程度的變形，-20 ℃凍藏的樣品肌纖維結(jié)構(gòu)被破壞的最嚴重，-40 ℃凍藏的樣品肌纖維結(jié)構(gòu)保持的相對比較完整[18]，這與王鳳玉等的研究結(jié)果[4]是一致的。綜合來看，-40 ℃ 凍藏溫度下的鱖魚魚肉樣品各品質(zhì)指標(biāo)變化趨勢均明顯優(yōu)于-20 ℃凍藏組樣品，凍藏溫度越低，品質(zhì)保持效果越明顯。

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