張宇豪 ，金 昊 ，張秀峰 ，梁勝祥 ，柳維林 ，陶 靜 ，2，陳立典 ，2，3，4*

1 福建中醫(yī)藥大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院，福建 福州 350122；2 福建省康復(fù)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，福建 福州350122；3 康復(fù)醫(yī)療技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，福建 福州350122；4 國(guó)家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)康復(fù)研究中心，福建 福州350122

阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）作為癡呆類疾病中發(fā)病率最高的疾?。?-2］，其臨床表現(xiàn)主要為學(xué)習(xí)記憶功能逐漸受損以及一般認(rèn)知損傷癥狀，病理變化特征包括大腦體積萎縮、β-淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）沉積、神經(jīng)纖維纏結(jié)以及神經(jīng)元凋亡等［3］。 據(jù)統(tǒng)計(jì)，2015年全球癡呆癥患者約4 680 萬(wàn)，每年新增 1 000 萬(wàn)病例，2017 年僅美國(guó)就有 550 萬(wàn)成年人患有 AD［4］。 因此，探究 AD 的發(fā)病機(jī)制，將有可能為臨床防治AD 提供可靠的理論依據(jù)。

大腦皮層灰質(zhì)是人類思維活動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，是大腦神經(jīng)元聚集部位，調(diào)控機(jī)體各種活動(dòng)的最高中樞。 有研究指出，內(nèi)嗅皮質(zhì)（entorhinal cortex，EC）和海馬（hippocampus，HP）是大腦參與學(xué)習(xí)記憶的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)［5-6］。 AD 患者大腦核磁共振成像結(jié)果顯示，其灰質(zhì)體積只有正常受試者的70%～80%，萎縮明顯［7］。 AD 患者大腦內(nèi) Aβ 的產(chǎn)生會(huì)導(dǎo)致老年斑的形成、神經(jīng)纖維的纏繞及神經(jīng)元的死亡，并隨著時(shí)間的推移導(dǎo)致癡呆［8］。 APP ／PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠動(dòng)物模型是探究AD 病變機(jī)制常用的雙轉(zhuǎn)基因模型之一，目前關(guān)于APP／PS1 灰質(zhì)體積變化與學(xué)習(xí)記憶功能的下降以及其Aβ 沉積的關(guān)系仍缺少較為完善的證據(jù)，因此本研究通過(guò)小動(dòng)物磁共振掃描觀察APP／PS1 小鼠灰質(zhì)體積變化特征，并采用Th-s 熒光染色檢測(cè)其Aβ 沉積，探討APP／PS1 小鼠灰質(zhì)體積變化與學(xué)習(xí)記憶功能和Aβ 沉積之間的相關(guān)性，為該AD動(dòng)物模型的病理特征及干預(yù)性實(shí)驗(yàn)研究提供可靠的行為學(xué)和影像學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本實(shí)驗(yàn)共納入野生組（wild type，WT）和 APP／PS1 組 2 組小鼠，每組 36 只。 WT 組小鼠選用 C57-BL／6 小鼠，APP／PS1 組選用 APP／PS1 雙轉(zhuǎn)基因小鼠，2 組均分別由 2、6、12 不同月齡小鼠組成， 每組每個(gè)月齡小鼠12 只。 分批購(gòu)買于南京大學(xué)南京生物醫(yī)藥研究院［批號(hào)：SCXK（蘇）2015-0001］。 實(shí)驗(yàn)前，通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）鑒定每組不同月齡小鼠DNA 基因型，然后在福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)程序均按國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行并經(jīng)學(xué)校動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑和設(shè)備

Th-s 抗熒光衰減封片劑（中國(guó)索萊寶有限公司，S2110）；免疫熒光檢測(cè)試劑盒（上海一基實(shí)業(yè)有限公司，YJ1012576）；異氟烷（中國(guó) RWD 生命科技有限公司，1602801）；多聚甲醛（中國(guó) Biosharp 生物科技有限公司，BL539A）；Morris 水迷宮（中國(guó)上海市欣軟信息科技有限公司，XR-XM101）；7.0T 小動(dòng)物磁共振儀（德國(guó)布魯克科技有限公司，70／20 USR）；徠卡熒光顯微鏡（德國(guó)LEICA 公司，DFC425C）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 Morris 水迷宮測(cè)試 Morris 水迷宮為直徑120 cm 的圓形水池，共分為4 個(gè)象限，其中東南角為象限1，順時(shí)針以此類推。 迷宮水深30 cm 左右，逃生平臺(tái)放置在3 象限， 為一直徑5 cm 的透明原型平臺(tái)，保持其在水面下2 cm 左右。 水迷宮上方正中配置1 個(gè)攝像頭，記錄小鼠游泳軌跡，為方便鏡頭精確捕捉小鼠影像，在迷宮水面鋪灑1 層白色塑料顆粒使水面與實(shí)驗(yàn)灰黑色小鼠形成顏色對(duì)比。 實(shí)驗(yàn)開始后，拉上水迷宮四周圍簾，以免外界光線干擾攝像機(jī)記錄小鼠游泳畫面。 Morris 水迷宮分別通過(guò)前4 d 的定位航行實(shí)驗(yàn)和第5 天的空間探索實(shí)驗(yàn)檢測(cè)2 組小鼠以空間為參考的學(xué)習(xí)記憶功能。

Morris 水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行4 d，通過(guò)小鼠尋找到逃生平臺(tái)的時(shí)間，檢測(cè)2 組小鼠的空間記憶學(xué)習(xí)能力。 第1 天，將小鼠從水迷宮第1 象限內(nèi)側(cè)壁放入水中，測(cè)試90 s，其找到逃生平臺(tái)的時(shí)間即為此次逃避潛伏期，若90 s 內(nèi)仍未找到，則逃避潛伏期記為90 s，并引導(dǎo)其找到逃生平臺(tái)，休息，適應(yīng)學(xué)習(xí)平臺(tái)所在位置15 s，然后從第2 象限放入，4個(gè)象限依次進(jìn)行定位航行測(cè)試。 第2 天從第2 象限放入，以此類推共進(jìn)行4 d。 第5 天進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)測(cè)試，實(shí)驗(yàn)開始前，去掉第3 象限的逃生平臺(tái)。 每只小鼠均從第1 象限放入，測(cè)試90 s，通過(guò)記錄比較其穿越原逃生平臺(tái)所在位置的次數(shù)，檢測(cè)其空間學(xué)習(xí)記憶的提取能力。

1.3.2 磁共振T2 加權(quán)成像掃描 采用7.0T 磁共振（magnetic resonance imaging，MRI）進(jìn)行 T2 加權(quán)成像（T2-weighted imaging）掃描。掃描前，用 1.5%的異氟烷對(duì)小鼠進(jìn)行麻醉，同時(shí)監(jiān)測(cè)呼吸情況，體感線圈為激發(fā)線圈，表面線圈為接收線圈。 檢測(cè)結(jié)束，用ITK-SNAP 軟件分析對(duì)應(yīng)灰質(zhì)體積。

1.3.3 Th-s 熒光染色檢測(cè) 使用3.0%異氟烷混合純氧將小鼠麻醉，從腹部向上打開胸腔，然后用止血鉗輕微夾住心臟，灌注針刺破左心室，依次灌注生理鹽水和4%多聚甲醛，待小鼠全身抽搐、僵硬后斷頭取出完整腦組織放入多聚甲醛中，24 h 后進(jìn)行石蠟包埋切片。用0.125%的 Thioflavine-s 溶液避光浸泡8 min。 磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗 3 次，5 min／次，然后用封片劑封片，最后在顯微鏡下拍攝。 分析2 組不同月齡小鼠大腦雙側(cè)內(nèi)嗅皮質(zhì)和海馬內(nèi)的Aβ 沉積情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 2 組小鼠學(xué)習(xí)記憶功能Morris 水迷宮檢測(cè)結(jié)果比較

見圖 1、表 1 和圖 2、表 2。

圖1 2 組小鼠逃避潛伏期Figure 1 Escape labency periods between two groups

表1 2 組小鼠逃避潛伏期比較（） 秒Table 1 Comparison of escape latency between two groups （）s

注：與 WT 組同月齡小鼠比較，1） P＜0.05。Note: Compared with WT group at the same month, 1) P＜0.05.

組別WT 組APP ／PS1 組月齡2 6 12 2 6 12 n 12 12 12 12 12 12第1 天48.41±15.13 59.76±13.81 63.70±20.78 51.52±11.86 65.41±12.63 78.36±11.01第2 天41.93±12.73 51.41±16.03 48.68±19.07 46.35±20.21 55.42±17.12 66.70±16.711）第3 天33.89±13.29 35.13±10.16 40.29±19.54 39.48±11.04 50.38±18.201）68.10±15.381）第4 天27.87±7.55 26.87±11.38 28.71±11.19 31.19±10.99 41.25±11.971）53.12±10.771）

圖2 2 組穿越平臺(tái)次數(shù)Figure 2 Times of crossing the platform between two groups

表 2 2 組穿越平臺(tái)次數(shù)比較（） 次Table 2 Comparison of times of crossing the platform between two groups （）times

表 2 2 組穿越平臺(tái)次數(shù)比較（） 次Table 2 Comparison of times of crossing the platform between two groups （）times

注：與 WT 組同月齡小鼠比較，1） P＜0.05。Note:Compared with WT group at the same month,1)P＜0.05.

組別 月齡n WT 組2 6 12 APP ／PS1 組2 6 12 12 12 12 12 12 12穿越平臺(tái)次數(shù)2.81±0.51 2.43±0.67 2.45±0.60 2.43±0.88 1.53±0.871）0.61±0.281）

2.2 2 組小鼠灰質(zhì)體積T2W1 掃描檢測(cè)結(jié)果比較

見表3。

表 3 2 組小鼠灰質(zhì)體積比較（）Table 3 Comparison of gray matter volume between two groups （）mm3

表 3 2 組小鼠灰質(zhì)體積比較（）Table 3 Comparison of gray matter volume between two groups （）mm3

注：與 WT 組同月齡小鼠比較，1） P＜0.05。Note:Compared with WT group at the same month,1)P＜0.05.

組別 月齡n WT 組2 6 1 APP ／PS1 組2 2 6 1 2 12 12 12 12 12 12內(nèi)嗅皮質(zhì)3.48±0.14 3.53±0.19 3.64±0.34 3.45±0.15 3.09±0.171）2.60±0.131）海馬25.08±0.84 24.76±0.83 25.45±1.32 25.17±0.64 24.30±0.81 20.34±1.071）

2.3 2 組小鼠Aβ 沉積結(jié)果比較

對(duì)2 組小鼠大腦切片進(jìn)行Th-s 熒光染色后，Aβ 沉積呈白色高密度熒光斑塊，見圖 3。 其中，2 組小鼠2 月齡時(shí)腦內(nèi)均未檢測(cè)出 Aβ 沉積；APP／PS1組小鼠6 月齡內(nèi)嗅皮質(zhì)和海馬即可檢測(cè)到少量 Aβ沉積，而到12 月齡則可檢測(cè)出大量致密Aβ 斑塊。此病理性斑塊僅集中于海馬和內(nèi)嗅皮質(zhì)，其他腦區(qū)分布較少。 統(tǒng)計(jì)分析斑塊數(shù)量，結(jié)果見表4、圖4。

2.4 APP／PS1 小鼠灰質(zhì)體積變化與學(xué)習(xí)記憶能力的相關(guān)性分析結(jié)果

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，APP／PS1 小鼠的灰質(zhì)體積萎縮與其對(duì)應(yīng)的逃避潛伏期和穿越平臺(tái)次數(shù)分別呈負(fù)相關(guān)和正相關(guān)關(guān)系，見圖5、圖6。

圖3 2 組小鼠腦區(qū)Aβ 沉積情況Figure 3 Aβ deposition in brain area of mice between two groups

表 4 APP／PS1 小鼠 6 月齡和 12 月齡 Aβ 斑塊結(jié)果比較（）Table 4 Comparison of Aβ plaque of APP／PS1 group at 6 and 12-month-old （）

表 4 APP／PS1 小鼠 6 月齡和 12 月齡 Aβ 斑塊結(jié)果比較（）Table 4 Comparison of Aβ plaque of APP／PS1 group at 6 and 12-month-old （）

注：與 6 月齡 APP／PS1 組小鼠比較，1） P＜0.05。Note: Compared with APP／PS1 group at the 6th month,1) P＜0.05.

海馬區(qū)12.42±1.96 28.26±3.641）月齡6 月齡12 月齡n 12 12內(nèi)嗅皮質(zhì)區(qū)13.25±2.01 33.86±3.611）

圖 4 APP／PS1 小鼠 6、12 月齡 Aβ 斑塊結(jié)果比較Figure 4 Comparison of Aβ plaque of APP／PS1 group at 6 and 12-month-old

圖5 APP／PS1 小鼠灰質(zhì)體積變化與逃避潛伏期的相關(guān)性分析Figure 5 Correlation analysis between changes in gray matter volume and escape latency in APP／PS1 group

圖6 APP／PS1 小鼠灰質(zhì)體積變化與穿越平臺(tái)次數(shù)的相關(guān)性分析Figure 6 Correlation analysis betweer changes in gray matter volume and the number of crossing platforms in APP／PS1 group

2.5 APP／PS1 小鼠灰質(zhì)體積變化與Aβ 沉積相關(guān)性分析

見圖7。

圖 7 APP／PS1 小鼠內(nèi)嗅皮質(zhì)、海馬體積與其 Aβ 沉積的相關(guān)性分析Figure 7 Correlation analysis between the entorhinal cortex and hippocampus volume and Aβ deposition in APP／PS1 group

3 討 論

本研究采用APP／PS1 雙轉(zhuǎn)基因模型小鼠作為AD 模型組，APP／PS1 雙轉(zhuǎn)基因小鼠攜帶與早發(fā)AD相關(guān)的人類淀粉樣前體蛋白瑞典型突變基因（APPSW）和外顯子 9 缺失的 PS1 基因（PS1 dE9），同WT 組實(shí)驗(yàn)小鼠一致，均具有C57-BL／6 背景。C57BL／6 小鼠的生命周期大致可分為幼年期、成年期、中年期和老年期，分別對(duì)應(yīng)1～3 月齡、3～6 月齡、10～15 月齡和 18～24 月齡［9-10］。 多數(shù)研究證實(shí)，APP／PS1 小鼠在6 月齡即會(huì)表現(xiàn)出學(xué)習(xí)記憶功能障礙，并出現(xiàn)神經(jīng)退行性改變［11-12］，為探究 APP／PS1小鼠發(fā)病特征及其早期病變表現(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)分別選取2 月齡、6 月齡和12 月齡即小鼠幼年期、成年期與中年期進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3.1 APP／PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶功能障礙可能發(fā)生于6 月齡

Mirros 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與WT 組比較，APP／PS1 組2 月齡小鼠的行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果無(wú)明顯區(qū)別，提示APP／PS1 小鼠早期無(wú)學(xué)習(xí)記憶功能障礙的表現(xiàn)。 與 WT 組同月齡比較，APP／PS1 組小鼠 6月齡時(shí)逃避潛伏期明顯增高，穿越平臺(tái)次數(shù)明顯降低，且APP／PS1 組12 月齡時(shí)這種差異表現(xiàn)得更加顯著，表明APP／PS1 小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶功能障礙可能發(fā)生于6 月齡，且12 月齡時(shí)出現(xiàn)加重的情況，這與 TASDEMIR 等［13-14］研究結(jié)果一致。 這提示，對(duì)于該AD 模型的干預(yù)性實(shí)驗(yàn)研究可以選擇在更早的時(shí)間采取干預(yù)措施以預(yù)防AD 的進(jìn)展。

3.2 大腦灰質(zhì)進(jìn)行性萎縮可能導(dǎo)致AD 小鼠學(xué)習(xí)記憶功能障礙

本研究T2WI 序列掃描結(jié)果顯示，與WT 組比較，APP／PS1 組6 月齡小鼠內(nèi)嗅皮質(zhì)體積明顯縮小，12月齡小鼠內(nèi)嗅皮質(zhì)和海馬體積也均明顯萎縮，提示APP／PS1 小鼠大腦灰質(zhì)具有時(shí)間進(jìn)行性萎縮的病理表現(xiàn)。 這與AD 患者早期階段常出現(xiàn)的包括內(nèi)嗅皮質(zhì)和海馬在內(nèi)的腦實(shí)質(zhì)萎縮，且內(nèi)嗅皮質(zhì)和海馬的損傷程度常最為嚴(yán)重的研究結(jié)果一致［15-16］。 內(nèi)嗅皮質(zhì)和海馬是保證空間學(xué)習(xí)記憶功能正常的2 個(gè)重要腦區(qū)，內(nèi)嗅皮質(zhì)和海馬體積萎縮，導(dǎo)致空間學(xué)習(xí)記憶的定位與導(dǎo)航功能失常，引起AD 患者早期出現(xiàn)情景記憶損傷的情況［17-21］。 AD 患者腦區(qū)病理性變化最早出現(xiàn)的是內(nèi)嗅皮質(zhì)，而后逐漸累及海馬和大腦新皮質(zhì)［22-24］。 內(nèi)嗅皮質(zhì)、海馬和海馬旁回在內(nèi)的內(nèi)側(cè)顳葉萎縮，被認(rèn)為是AD患者灰質(zhì)體積變化的主要特征［25］。 本研究結(jié)果顯示，APP ／PS1 組6 月齡小鼠海馬體積未發(fā)生明顯變化，這與REDWINE 等［26］研究發(fā)現(xiàn) PDAPP 小鼠在 3～4 月齡時(shí)即出現(xiàn)海馬體積減少的結(jié)果不一致，這可能是由于核磁掃描序列參數(shù)、AD 模型小鼠的遺傳背景以及海馬體積的檢測(cè)方法不同所導(dǎo)致的。

此外，APP／PS1 組小鼠大腦灰質(zhì)體積萎縮與其相應(yīng)月齡的學(xué)習(xí)記憶功能相關(guān)性分析結(jié)果顯示：學(xué)習(xí)記憶功能與其灰質(zhì)體積的進(jìn)行性萎縮呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，大腦灰質(zhì)體積萎縮越厲害，AD 學(xué)習(xí)記憶功能障礙越嚴(yán)重，這提示，AD 學(xué)習(xí)記憶功能障礙可能是由大腦灰質(zhì)萎縮所導(dǎo)致。 這與有研究顯示AD患者內(nèi)嗅皮質(zhì)［27］、海馬體積［28］的萎縮程度與其認(rèn)知功能具有一定相關(guān)性的研究結(jié)果一致。

3.3 Aβ 過(guò)度沉積可能導(dǎo)致AD 大腦灰質(zhì)萎縮

本研究通過(guò)免疫熒光檢測(cè)2 組不同月齡小鼠Aβ 沉積情況，研究結(jié)果顯示，與 WT 組比較，APP／PS1 組6 月齡小鼠大腦內(nèi)開始出現(xiàn)Aβ 沉積，到12月齡時(shí)AD 小鼠Aβ 沉積進(jìn)一步增加，這表明，隨著月齡的增加AD 小鼠腦組織中Aβ 沉積逐漸增多。這提示，腦組織中Aβ 沉積是AD 患者的主要病理表現(xiàn)之一，它可能是導(dǎo)致AD 患者出現(xiàn)進(jìn)行性記憶功能障礙的最初誘因，這與HAASS 等［29-30］研究結(jié)果一致。

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，AD 小鼠灰質(zhì)體積與其相應(yīng)腦區(qū)的Aβ 沉積程度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，即灰質(zhì)體積越小，Aβ 沉積越多。 這表明高水平的 Aβ 沉積和加劇的腦萎縮是AD 小鼠神經(jīng)退行性的主要表現(xiàn)，這提示Aβ 沉積、灰質(zhì)體積萎縮是認(rèn)知功能障礙的主要原因之一。 這與 JACK 等［31-35］研究顯示腦組織內(nèi)出現(xiàn)Aβ 沉積，其大腦海馬和皮質(zhì)的萎縮程度也更高的結(jié)果一致。 有研究顯示，AD 模型小鼠大腦內(nèi)的Aβ 沉積可能與神經(jīng)元丟失和突觸減少有關(guān)，其可能誘導(dǎo)大腦灰質(zhì)體積萎縮性及營(yíng)養(yǎng)不良性神經(jīng)元［36-37］，但有關(guān)于其具體作用機(jī)制的研究還較少，還有待于包括大腦神經(jīng)功能連接以及分子生物學(xué)水平等方面在內(nèi)更深入的研究。

4 小 結(jié)

本研究證實(shí)APP／PS1 小鼠存在時(shí)間依賴性的學(xué)習(xí)記憶功能障礙，且隨時(shí)間呈漸進(jìn)性加重，這可能與大腦灰質(zhì)進(jìn)行性萎縮有關(guān)；AD 大腦灰質(zhì)體積萎縮與Aβ 沉積有明確的相關(guān)性，Aβ 過(guò)度沉積可能是AD 大腦灰質(zhì)體積萎縮的主要因素之一，但其具體機(jī)制尚未明確，今后還需進(jìn)一步深入研究，探明具體作用機(jī)制為臨床防治AD 提供依據(jù)。