王哲侃， 周浩瀾， 李丹蕾， 趙阿勇

(浙江農(nóng)林大學(xué) 動物科技學(xué)院，浙江 杭州 311300)

賈第鞭毛蟲(Giardiaduodenalis)又稱賈第蟲，是一種單鞭毛寄生蟲，主要寄生于人和哺乳動物的小腸，是人類最常見的腸道寄生蟲[1-3]，被列為十大嚴(yán)重危害人類健康的寄生蟲之一[4]。根據(jù)遺傳學(xué)和表型的不同，可將賈第蟲分為8個不同的基因型(集聚體)A～H[5-6]，其中A、B型為人獸共患型，C、D型主要感染犬類動物，E型感染有蹄動物，F(xiàn)型一般在貓科動物中出現(xiàn)，G型感染嚙齒動物，H型主要感染海洋哺乳動物[6-10]。犬類主要感染犬特異性C、D型賈第蟲，但也可能感染A、B型賈第蟲[11-13]。野生犬感染賈第蟲的概率較大[14-15]，由于賈第蟲具有人犬互傳的可能性，犬是否成為人賈第蟲病感染的重要來源已是世界性話題。

對家犬的調(diào)查顯示，不同地理區(qū)域家犬感染賈第蟲的情況存在差異[16-17]，造成這種差異的原因尚不清楚，需要在不同的地理區(qū)域進(jìn)行研究探討。目前，針對中國南海及周邊地區(qū)犬類感染賈第蟲的調(diào)查較少，且鮮有針對海洋隔離對賈第蟲地區(qū)基因分型進(jìn)行的調(diào)查鑒定。因此，本研究旨在應(yīng)用分子生物學(xué)方法對中國南海周邊國家及地區(qū)寄生于犬類的賈第蟲進(jìn)行鑒定。本研究從中國廣州、越南胡志明市、馬來西亞吉隆坡、新加坡和菲律賓馬尼拉共收集到616份犬類糞便樣本，通過巢式PCR擴(kuò)增TPI基因和BG基因，并通過序列比對分析，確定陽性樣本中賈第蟲的基因型，旨在研究海洋地域隔離是否對賈第蟲分型產(chǎn)生影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗樣品

從中國廣州、越南胡志明市、馬來西亞吉隆坡、新加坡和菲律賓馬尼拉寵物診所和收容所共采集犬糞便樣品616份，其中流浪犬糞便樣本239份，家犬糞便樣本377份(表1)。糞便樣品分別裝入干凈的自封袋，做好詳細(xì)的信息記錄并編號，放入4℃冰箱保存或-20℃冷凍直到分析。

表1 樣品信息

1.1.2 主要試劑

Stool Genomic DNA Kit、蛋白酶K、2×Taq Master Mix購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；DNA Green、平衡酚、核酸提取液I(酚、氯仿、異戊醇體積比25∶24∶1)、核酸提取液II(氯仿、異戊醇體積比24∶1)購自北京索萊寶科技有限公司；無水乙醇、氯仿、異丙醇、乙二酰胺四乙酸(EDTA)購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；DL2000 DNA Marker購自寶生物工程(大連)有限公司；PCR清潔回收試劑盒購自愛思進(jìn)生物技術(shù)(杭州)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 賈第蟲DNA提取

糞樣用無菌水沖洗3次，按照糞樣DNA提取試劑盒說明書，采用酚抽提法提取糞便中的賈第蟲DNA，采集并編號(廣州1～104號，馬尼拉105～269號，胡志明市270～414號，吉隆坡415～547號，新加坡548～616號)。檢測DNA濃度和純度，并將DNA樣品置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計

參考文獻(xiàn)[18]方法合成巢式PCR引物，引物序列及信息見表2，由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行合成。

1.2.3 巢式PCR擴(kuò)增

對賈第蟲基因位點進(jìn)行多位點序列排序，選擇Beta giardin(BG)和磷酸三脂異構(gòu)酶(triose-phosphateisomerase，TPI)這2個單拷貝蛋白編碼基因靶點，這2種基因多態(tài)性程度較高，利于分型。第1輪PCR反應(yīng)體系為：2×TaqMix 8.5 μL，上(F1)、下(R1)游引物各1 μL，模板DNA1 μL，加滅菌水至25 μL；反應(yīng)條件為：94 ℃ 2 min；94 ℃ 45 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，共35個循環(huán)；72 ℃ 5 min。第2輪PCR體系為：2×TaqMix 7.5μL，上(F2)、下(R2)游引物各1 μL，第1輪PCR產(chǎn)物1 μL，加滅菌水至25 μL；反應(yīng)條件為：94℃ 2 min；94℃ 45 s，53℃ 45 s，72℃ 45 s，共35個循環(huán)；72℃ 5 min。

1.2.4 犬賈第蟲基因型判定

將純化的PCR產(chǎn)物送至北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測序。將獲得的核酸序列與GenBank中犬賈第蟲不同基因型TPI基因(KP258395～KP258398)和BG基因(KP258342～KP258345)序列進(jìn)行對比，根據(jù)結(jié)果判斷其分型。

1.2.5 統(tǒng)計分析

將分型結(jié)果進(jìn)行整理，并進(jìn)行統(tǒng)計分析，利用卡方檢驗評價差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 糞樣陽性率

PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，約500bp處可見明顯目的基因條帶，大小與預(yù)期相符(圖1、圖2)。

M：DNA marker；107、110、127、137、176、185、231、273、418為賈第蟲感染糞樣；NC：陰性對照。M：DL 2000 DNA marker；107， 110， 127， 137， 176， 185， 231， 273， 418：Giardia duodenalis positive samples；NC：Negative samples.圖1 糞樣BG基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 BG PCR products amplified from fecal samples

M：DNA marker；11、14、21、44、100、107、108、109、110、127為賈第蟲感染糞樣。M：DL 2000 DNA marker；11， 14， 21， 44， 100， 107， 108， 109， 110， 127: Giardia duodenalis positive samples.圖2 糞樣TPI基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 TPI PCR products amplified from fecal samples

616份樣品中，有48份樣品見該目的條帶。根據(jù)結(jié)果再次對陽性產(chǎn)物進(jìn)行二次檢驗，陽性率為7.79%(48/616)。中國廣州、越南胡志明市、馬來西亞吉隆坡、新加坡和菲律賓馬尼拉犬賈第蟲感染率分別為4.81%、6.90%、9.09%、2.86%和11.52%。家犬和流浪犬賈第蟲感染率分別為5.86%和9.02%(表3)。中國廣州、越南胡志明市、馬來西亞吉隆坡、新加坡和菲律賓馬尼拉陽性樣品中，BG位點陽性率分別為40%(2/5)、30%(3/10)、75%(9/12)、0%(0/2)和84.2%(16/19)，TPI位點陽性率分別為100%(5/5)、100%(10/10)、100%(12/12)、100%(2/2)和94.7%(18/19)，2個位點均呈陽性的比例是62.5%(30/48)。

表2 引物信息

2.2 基于不同基因位點的陽性樣品分型結(jié)果

如表4所示，基于BG基因位點，陽性樣本中鑒定為集聚體B型1例(3.33%)，集聚體C型26例(86.67%)，集聚體D型3例(10%)；基于TPI基因位點，陽性樣本中鑒定為B型1例(2.12%)，集聚體C型40例(85.1%)，集聚體D型6例(12.76%)，所有地區(qū)均沒有出現(xiàn)A型。

表3 賈第蟲感染情況

表4 基于不同基因位點的陽性樣品分型結(jié)果

3 討論

賈第蟲分布廣泛，在歐洲、北美洲、南美洲、大洋洲和亞洲等地區(qū)均有感染的報道，尤其多見于溫帶和熱帶地區(qū)，且與當(dāng)?shù)氐慕?jīng)濟(jì)條件和衛(wèi)生環(huán)境密切相關(guān)[19]。據(jù)WHO估計，全世界范圍內(nèi)賈第蟲感染率為1%～30%，在經(jīng)濟(jì)水平較低、衛(wèi)生條件較差的地區(qū)，感染率達(dá)到10%～20%，基因型及其分布分析對賈第蟲感染的公共衛(wèi)生評價具有重要的意義。

本研究所選擇國家和地區(qū)處于中國南海周邊，具有明顯的海洋隔離特性。所有被調(diào)查國家和地區(qū)的犬都證實了有賈第蟲的存在。根據(jù)目前的研究結(jié)果，賈第蟲應(yīng)該被認(rèn)為是中國南海周邊地區(qū)的一種犬類常見寄生蟲。本研究對比了地區(qū)內(nèi)犬群不同集聚體類型的分布，發(fā)現(xiàn)分布以少量集聚體B型和D型和大量集聚體C型為主，家犬與其主人的密切接觸可能是導(dǎo)致引發(fā)人畜共患疾病的賈第蟲集聚體B感染的原因，而集聚體C和集聚體D類的傳播則更可能發(fā)生在生活于擁擠環(huán)境中的野生犬群中。社會和環(huán)境條件的差異也可能導(dǎo)致了集聚體分型的變化。然而由于棄養(yǎng)或偶然接觸，被賈第蟲集聚體C和集聚體D感染的犬類中，也偶有集聚體A和集聚體B的存在[20]。然而，在過去幾年的其他的研究中，在不同國家的收容所犬身上發(fā)現(xiàn)了潛在的人畜共患病集聚體A和集聚體B，在比利時的研究中從BG位點上分析得到的有37.0%[21]。在西班牙的研究中從BG位點上分析則有81.4%，但集聚體A及集聚體B的感染率始終低于集聚體C和集聚體D[22]。由于不同地區(qū)環(huán)境的影響，在未來集聚體C和集聚體D感染率是否仍然會超過集聚體A和集聚體B仍然是個未知數(shù)，這也可能與不同地區(qū)的公共生活衛(wèi)生水平有關(guān)[23]。從結(jié)果看，南海周邊地區(qū)賈第蟲基因位點C、D分型占比達(dá)到98%，并且各個地區(qū)間的分型差異并不顯著，這證明海洋并沒有成為阻擋賈第蟲基因型分布的因素，賈第蟲在該地區(qū)還以犬類感染的占比較高，隨著伴侶動物的逐漸發(fā)展，越來越多的寵物犬進(jìn)入家庭與人共處，在福利機(jī)構(gòu)也出現(xiàn)野生犬類與家養(yǎng)犬類混居的情況，而犬類可以攜帶和傳播賈第蟲病，并通過多種途徑傳播給人，所以對人類健康仍然是一個潛在威脅，對于該類疾病并沒有特效治療方法，所以針對該類疾病的預(yù)防大于治療，加強對糞便的管理和處理，保護(hù)公用水源和環(huán)境，避免污染，對于陽性結(jié)果的犬類進(jìn)行隔離，避免擴(kuò)大傳播范圍是普遍的預(yù)防手段，并且需要有數(shù)據(jù)對中國南海周邊地區(qū)賈第蟲病的流行病學(xué)、感染源、宿主和傳播進(jìn)一步了解。有必要在分型水平上使用分子工具進(jìn)行監(jiān)測研究和暴發(fā)調(diào)查。此外，為了使數(shù)據(jù)更具可比性，還需要在各地區(qū)之間達(dá)成共識并采用協(xié)調(diào)一致的有效方法。減少人畜生態(tài)系統(tǒng)中的人畜共患病和其他威脅的公共健康風(fēng)險時，必須考慮人類、動物和它們所生活的各種環(huán)境之間相互作用的復(fù)雜性。這需要負(fù)責(zé)人類健康、動物健康和環(huán)境的部門之間以一種健康的方式進(jìn)行溝通和合作，并且針對不同地理環(huán)境及不同公共衛(wèi)生狀況的地區(qū)，進(jìn)行區(qū)域性調(diào)查，盡管提出的結(jié)果對于公共衛(wèi)生專家、流行病學(xué)家、獸醫(yī)、農(nóng)民和一般公眾可能更為重要，但是進(jìn)一步解決數(shù)據(jù)的缺口，將大大有助于了解賈第鞭毛蟲病的復(fù)雜情況，從而為今后制定適當(dāng)?shù)目刂坪皖A(yù)防計劃奠定基礎(chǔ)。